專利名稱：一種胎盤間充質干細胞的規模化制備方法
技術領域：
本發明屬生物技術領域，具體涉及一種胎盤間充質干細胞的制備方法。
背景技術：
間充質干細胞在發育生物學研究和臨床治療，如組織和器官修復等方面具有廣闊 的應用前景，間充質干細胞最先在骨髓中確認存在，隨后在成人外周血、骨膜、肌肉和脂肪 組織等處均發現有間充質干細胞的存在。間充質干細胞屬于多能干細胞，在相應的誘導條 件下能分化為骨、脂肪、軟骨、肌肉和肝細胞等不同類型的細胞。目前成人骨髓是間充質干 細胞臨床應用的主要來源，但存在明顯的缺陷，如成人骨髓中的間充質干細胞含量非常少 (約0. 001%-0. 01% )。此外，在衰老和疾病狀態下，骨髓間充質干細胞的數量和分化潛能 下降，且采集骨髓為創傷過程。所以尋找其他的間充質干細胞來源迫在眉睫。研究表明，胎盤間充質干細胞具有多向分化潛能及造血支持和免疫抑制效應，其 擴增能力優于成人骨髓間充質干細胞。胎盤來源豐富、取材方便是間充質干細胞又一新來 源。現有技術的胎盤間充質干細胞的制備方法是利用胎盤特殊的解剖結構，采用灌流 法，用灌流液孵育胎盤；從灌流液中分離單個核細胞，洗滌后用間充質干細胞培養基懸浮所 獲細胞，進行培養。取胎盤母體側蛻膜，剪碎小塊胎兒蛻膜側胎盤組織，0. 1% IV型膠原酶 消化后收集細胞，以細胞培養基(含DMEM、10%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺)進行貼壁培養。從胎盤組織中提取間充質干細胞，胎盤中血液含量非常多，沖洗時消耗試劑多，且 易沖洗不徹底；現在多采用將整個胎盤組織剪切，胎盤組織體積大且厚，剪切時耗時耗力； 使用消化酶進行消化時需酶量大，耗材多；組織接種時由于組織塊體積大及數量多，所耗試 劑及器材多，工作量大易污染。
發明內容
針對現有技術中存在的問題，本發明人在現有制備技術的基礎上，改進制備方法。 將制備過程程序化，簡化操作步驟，縮短操作時間，減少工作量，從而也可在很大程度上避 免污染，減少制備過程所需試劑和耗材，并且在做到以上所述之后，增加間充質干細胞的產量。本發明采用如下技術方案一種胎盤羊膜源間充質干細胞的制備方法，包括以下步驟1)用含青霉素、鏈霉素和肝素鈉的PBS緩沖液沖洗胎盤，沿胎盤邊緣將胎兒面羊 膜慢慢剝離；2)再次沖洗胎盤源羊膜，將羊膜剪成l_5mm3小塊；3)將羊膜組織塊用含青霉素和鏈霉素的DMEM培養基混勻，在850g條件下離心 IOmin ；4)棄上清，每管加含體積比0. 25 %胰蛋白酶的DMEM培養基于37°C消化IOmin，在850g條件下離心IOmin ；5)棄上清，每管加完全培養基后，在2200rpm條件下離心IOmin ；所述完全培養基 為含體積比10%的胎牛血清+100kU/L青霉素+100mg/L鏈霉素的DMEM培養基；6)棄上清，羊膜組織塊接種于培養皿中，加完全培養基，在培養箱培養；每3天進 行半量換液；7)至10-12天有細胞貼壁生長，細胞克隆形成后，棄掉組織塊，加完全培養基進行
培養；8)至15-17天細胞克隆融合至80-90%，進行細胞傳代。
圖1 羊膜源間充質干細胞原代細胞圖2 羊膜源間充質干細胞P1、P2代圖3 羊膜源間充質干細胞流式細胞儀檢測結果技術效果1、選擇用胎盤中的羊膜來制備間充質干細胞。羊膜中含有較多的間充質干細胞， 且質薄，取材簡便易行，剪切省時省力；2、羊膜剪切成小塊后用消化酶消化時，需酶量非常少，消化時間短；3、接種時組織量少，所需耗材少，占用空間少；4、整個程序操作簡單，將制備過程由傳統的5-6小時縮短至40分鐘即可完成。5、所獲取的間充質干細胞產量大，細胞生物學特征同常規制備方法無明顯差異。
具體實施例方式胎盤羊膜源間充質干細胞的制備1.用含 100kU/L 青霉素 +100mg/L 鏈霉素 +2U/ml 肝素鈉 Ofeparin Sodium,青島 康原藥業(集團)有限公司)的PBS緩沖液沖洗胎盤，沿胎盤邊緣將胎兒面羊膜慢慢剝 離。所述的青霉素/鏈霉素溶液購自美國ScienCell公司，P/S (Penicillin/Sti^ptomycin Solution)ο2.再次沖洗胎盤源羊膜，將羊膜剪成l_5mm3小塊。3.將羊膜組織塊用含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素的DMEM培養基混勻，在 850g條件下離心lOmin。4.棄上清，每管加消化液(含體積比0.25%胰蛋白酶的DMEM培養基)于37°C消 化lOmin，在850g條件下離心IOmin05.棄上清，每管加完全培養基(含體積比10%的FBS (胎牛血清)+100kU/L青霉 素+100mg/L鏈霉素的DMEM培養基)后，在2200rpm條件下離心IOmin。6.棄上清，羊膜組織塊接種于培養皿中，加完全培養基，在37°C、5% CO2的培養箱 培養。每3天進行半量換液(棄一半培養基再加入等體積新培養基)。7.至10天左右可見細胞貼壁生長，細胞克隆形成后，棄掉組織塊，加完全培養基 進行培養。8.至15天左右細胞克隆融合至80-90%，進行細胞傳代。傳代培養后，24h (小時)即可貼壁，細胞呈較均一的長梭形，3d (天)左右細胞可鋪滿整個培養瓶底面，可繼續傳代 擴增。傳代后的細胞形態無明顯變化，性質穩定。羊膜源間充質干細胞原代細胞以及P1、 P2代細胞(如圖1、圖2)。 9.細胞培養到第3代進行流式細胞儀鑒定。以FITC標記的⑶45、⑶90及HLA-DR， PE 標記的 CD105、CD34、CD146 (BD-Pharmigen 公司，美國)進行流式細胞儀(Fascalibur，BD 公司，美國)檢測。結果顯示，高表達⑶90、⑶105、⑶146，不表達⑶45、⑶34及HLA-DR(如 圖3)。
權利要求
一種羊膜源胎盤間充質干細胞的制備方法，其特征在于包括以下步驟1)用含青霉素、鏈霉素和肝素鈉的PBS緩沖液沖洗胎盤，沿胎盤邊緣將胎兒面羊膜慢慢剝離；2)再次沖洗胎盤源羊膜，將羊膜剪成1 5mm3小塊；3)將羊膜組織塊用含青霉素和鏈霉素的DMEM培養基混勻，在850g條件下離心10min；4)棄上清，每管加含體積比0.25％胰蛋白酶的DMEM培養基于37℃消化10min，在850g條件下離心10min；5)棄上清，每管加完全培養基后，在2200rpm條件下離心10min；所述完全培養基為含體積比10％的胎牛血清+100kU/L青霉素+100mg/L鏈霉素的DMEM培養基；6)棄上清，羊膜組織塊接種于培養皿中，加完全培養基，在培養箱培養；每3天進行半量換液；7)至10 12天有細胞貼壁生長，細胞克隆形成后，棄掉組織塊，加完全培養基進行培養；8)至15 17天細胞克隆融合至80 90％，進行細胞傳代。
全文摘要
本發明涉及一種胎盤間充質干細胞的制備方法。該方法將制備過程程序化，簡化操作步驟，縮短操作時間，減少工作量，從而也可在很大程度上避免污染，減少制備過程所需試劑和耗材，并且在做到以上所述之后，增加間充質干細胞的產量。
文檔編號C12N5/0735GK101921728SQ20101024639
公開日2010年12月22日 申請日期2010年8月6日 優先權日2010年8月6日
發明者張學峰, 張美榮, 王麗, 胡建霞, 高宏, 魏斯溧 申請人:青島奧克生物開發有限公司