一種用于檢測致手足口病腸道病毒的組合物、試劑盒及方法

專利名稱：一種用于檢測致手足口病腸道病毒的組合物、試劑盒及方法
技術領域：
本發明涉及用于特異性檢測致手足口病腸道病毒的組合物、試劑盒和檢測方法。
背景技術：
手足口病(Hand-foot-mouth disease)是由腸道病毒引起的常見傳染病，以嬰幼 兒發病為主。大多數患者癥狀輕微，以發熱和手、足、口腔等部位的皮疹或皰疹為主要特征。 少數患者可并發無菌性腦膜炎、腦炎、急性弛緩性麻痹、呼吸道感染和心肌炎等。個別重癥 患兒病情進展快，易發生死亡。可以起手足口病的腸道病毒有多種亞型，包括柯薩奇病毒(Cox)A5、A10、A16、A19 型及腸道病毒71型(Ev71型)。20世紀70年代以前，cox A16型腸道病毒被認為是引起手 足口病的主要病原(何家鑫，沈曉娜。海峽預防醫學雜志，2001，7 (3) 22-24)。日本曾經多 次發生手足口病暴發流行，其主要病原為cox A16型腸道病毒。我國天津在1983-1986年， 也曾發生由cox A16型腸道病毒引起的手足口病暴發流行。20世紀70年代初，美國首先發 現由Ev71型腸道病毒引起的手足口病。澳大利亞和日本也陸續觀察到由Ev71型腸道病毒 引起的手足口病的流行，一些Ev71型重癥病例伴有中樞神經系統癥狀(李顯，汪華。江蘇 衛生保健，2002，4 (4) :178-180)。根據世界各國手足口報道的情況來看，Ev71型和cox A16 型腸道病毒是引起手足口病的主要病原(Tan EL,Chow VT,Quak SH,Yeo WC,Poh CL. Diagn Microbiol Infect Dis.2008Jul ；61 (3) :294_301)。手足口病的地區分布極為廣泛，歐洲、北美洲、大洋洲和亞洲國家，均有暴發流行。 一般多在夏秋季節爆發，健康帶毒者和輕型散發病例是主要的傳染源，主要通過飛沫經呼 吸道傳播和被污染的玩具、手經口傳播，而大部分人群對致手足口病的腸道病毒普遍易感， 尤其是嬰幼兒，更易感染，因而托幼中心和小學是手足口病高發區。2008年，安徽阜陽上千 名兒童感染腸道病毒EV71，引起手足口病暴發，僅3月份，就有19名患兒搶救無效死亡。全 國其他省市，也不同程度的出現手足口病的暴發流行。其中，北京(2221例)、上海(1988 例)、廣東(13189例)、浙江(5132例)、江蘇(2479例)、山東(1985例)、湖北(1424例)、 河南(1385例)等省市報告病例數均超過千例。由于目前缺乏特異、高效的手足口病抗病 毒藥物，對癥和支持治療是手足口病的主要治療措施。而加強實驗室監測和提高監測敏感 性是控制手足口病暴發流行的關鍵。隨著分子生物學技術的快速發展，在病原微生物實驗室和臨床檢測中，PCR法由于 其快速、簡便和特異性強的特點，逐漸呈現出要替代病原培養和血清學檢測為主的傳統檢 測方法的趨勢。而相比普通PCR方法，real-time PCR更加省時，特異更強，靈敏度更高，同 時無需PCR后產物分析步驟，減少了實驗操作步驟，降低了實驗室污染的風險，展現出了更 大的應用前景。根據行業標準，我國目前致手足口腸道病毒的檢測主要依靠普通RT-PCR。一般耗 時要4-6個小時。根據PubMed查詢的結果，以“Hand-foot-mouth disease real-time per，，
3為查詢關鍵詞，國外僅有6篇相關的文獻報道。因而，根據我國致手足口病的EV71和Cox A16型腸道病毒基因序列特征，建立一種快速簡便的多重real-time PCR，在一個反應中，實 現鑒別檢測致手足口病的EV71和Cox A16型兩種腸道病毒，可以顯著提高手足口病檢測效 率和檢測的靈敏性，同時簡化檢測過程，節約人力、物力和相關的檢測成本。由于在一個反 應中同時檢測多種類型的病毒，需要考慮多對引物、探針之間是否存在交叉干擾、錯配以及 退火溫度是否匹配等因素，并非是將分別檢測各種病毒用引物等簡單的組合在一起即可實 現；目前尚沒有可以在一個反應中同時檢測EV71和CoxAie型兩種腸道病毒的產品或方法。

發明內容
本發明的主要目的就是針對上述問題，提供一種可用于特異性檢測致手足口病的 EV71和Cox A16型腸道病毒的組合物；利用該組合物，可在一個反應中同時檢測致手足口 病的EV71和Cox A16型兩種腸道病毒，從而顯著提高手足口病檢測效率和檢測的靈敏性， 同時簡化檢測過程，節約人力、物力和相關的檢測成本。本發明的另一個目的是提供一種含有上述組合物的試劑盒。本發明的又一個目的是提供一種利用上述組合物或者試劑盒特異性檢測致手足 口病腸道病毒的方法。為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下一種用于檢測致手足口病腸道病毒的組合物，包括下列引物上游引物(Pl)5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘，下游引物(P2)5' -GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘。上述上、下游引物為針對V71和Cox A16型腸道病毒的5' UTR區基因片段設計的 引物。利用上述組合物，配合適當的探針及其它試劑，使用real time PCR方法，可以特 異性地檢測出樣品中的EV71和Cox A16型腸道病毒5' UTR區基因片斷。優選的，上述組合物中同時還可以包括下列探針EV71 病毒檢測探針(Probel) :5,-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬 滅基團-3'，Cox A16 病毒檢測探針(Probe2) -熒光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光 淬滅基團-3'，其中，Y = T或者C。上述的Probel和Probe2的熒光基團為FAM，熒光淬滅基團為ECLIPSE。為了更準確的同時鑒別檢測樣品中是否含有EV71和/或Cox A16型腸道病毒，上 述組合物還可進一步包括針對V71和Cox A16型腸道病毒的polyprotein基因設計的特異 性引物，即該組合物中除了上述引物還包括下列引物EV71 的 polyprotein 基因引物上游引物(P3)5' -CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3‘，下游引物(P4)5' -TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3‘；Cox A16 的 polyprotein 基因引物上游引物(P5)5' -ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3‘，下游引物(P6)5' -CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3‘。
進一步優選的，上述組合物中同時還可以包括下列探針EV71 病毒檢測探針(Probe3) :5,-熒光基團-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-熒光淬 滅基團-3'，Cox A16 病毒檢測探針(Probe4) :5 ‘-熒光基團-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAAC TT-熒光淬滅基團-3'，其中，Y = T或者C;并且在二個探針中分別使用不同的熒光基團。上述探針的兩對熒光基團和熒光淬滅基團可以分別是HEX和ECLIPSE ；Cy5和 BHQ3。含有上述組合物的試劑盒，即其中含有下述引物上游引物(Pl)5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘，下游引物(P2)5' -GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘；同時，該試劑盒中還含有適當的探針、熒光基團FAM和熒光淬滅基團ECLIPSE，及 RT-PCR反應體系。優選的，所述的探針包括EV71 病毒檢測探針(Probel) :5,-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬 滅基團-3'，Cox A16 病毒檢測探針(Probe2) -熒光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光 淬滅基團-3'，其中，Y = T或者C。進一步優選的，該試劑盒還可進一步含有下述引物上游引物(P3)5' -CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3‘，下游引物(P4)5' -TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3‘；Cox A16 的 polyprotein 基因引物上游引物(P5)5' -ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3‘，下游引物(P6)5' -CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3‘。同時，該試劑盒還可進一步含有下述探針EV71 病毒檢測探針(Probe3) :5,-熒光基團-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-熒光淬 滅基團-3'，Cox A16病毒檢測探針(Probe4) 5 ‘-熒光基 團-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAACTT-熒光淬滅基團-3 ‘，其中，Y = T 或者 C ；相應的，該試劑盒中還含有兩對不同的熒光基團和熒光淬滅基團，分別是第一對HEX和 ECLIPSE ；第二對Cy5和 BHQ3。上述試劑盒中的RT-PCR反應體系為實時定量PCR反應體系。反應體系為20 μ 1， 5XPCR 緩沖液 4μ lUOmmol/L dNTP Ι.Ομ 1、25 μ mol/L 引物各 0. 5 μ 1、10 μ mol/L 探針各 0. 2 μ 1、QIAGEN逆轉錄和聚合酶混合物1 μ 1、模板Iul，加滅菌水至終體系20 μ 1。利用上述組合物或試劑盒，使用real-time PCR方法，可以在一個反應中鑒別檢測 樣品中是否含有致手足口病的EV71和/或Cox A16型腸道病毒。這大大簡化了檢測流程， 節省了檢測成本。不再需要普通PCR后續的電泳等檢測過程，而直接讀取結果，可更進一步 簡化檢測過程，提高檢測效率。
如采用上述試劑盒，除了具有上述組合物所具有的效果之外，還由于試劑盒中已 經包括所需試劑等的配套配置，因此，只需要操作者提供待檢樣品核酸樣品，進行簡單的常 規操作即可得到檢測結果，更加方便使用。利用上述組合物或者試劑盒檢測致手足口病腸道病毒的方法，包括下述主要步 驟(1)、提取RNA 提取樣品中的腸道病毒RNA ；(2)、real-time PCR反應以上述步驟(1)提取得到的樣品中的腸道病毒RNA為 模板，使用上述組合物或試劑盒，用real-time PCR法擴增EV71和Cox A16型腸道病毒特 異性基因片斷；real-time PCR反應條件中，循環參數可優選為50°C，逆轉錄30min ；95°C, IOmin ；進入循環階段95°C變性15s，60°C退火延伸 lmin，共反應40個循環。(3)、結果分析對上述步驟(2)real-time PCR反應的結果進行分析，得出檢測結 論。該檢測方法無需進行病毒細胞培養，整個反應可在2小時內完成，大大節省了人 力與時間，可用于快速檢測。由于使用了上述組合物或者試劑盒，該檢測方法還具有上述組合物或試劑盒所能 夠達到的所有技術效果，可特異性檢測出樣品中是否含有EV71和/或Cox A16型腸道病毒。與現有技術相比，本發明的有益效果是本發明首先針對EV71和Cox A16型腸道病毒5' UTR區設計了特異性引物及相應 的探針；進一步的，還分別針對V71和Cox A16型腸道病毒的polyprotein基因設計了特異 性引物及相應的探針；在此基礎上，組成可用于特異性檢測樣品中EV71和Cox A16型腸道病毒的組合 物、含有該組合物的試劑盒、以及利用此組合物或試劑盒用于特異性檢測樣品中是否EV71 和/或Cox A16型腸道病毒的方法。利用本發明的組合物或試劑盒、和/或方法檢測樣品時，能夠靈敏、快速地檢測出 樣品是否存在EV71和/或Cox A16型腸道病毒，其檢測敏感度為1. OX IO1拷貝每反應體 系；整個反應可在2小時內完成。而且，利用本發明的組合物或試劑盒、和/或方法檢測樣品，可在一個反應中同時 檢測致手足口病的EV71和Cox A16型兩種腸道病毒，從而顯著提高手足口病檢測效率和檢 測的靈敏性，同時簡化檢測過程，節約人力、物力和相關的檢測成本。此外，本發明優選方案的組合物或試劑盒中設計的特異性探針，可利用TaqMan實 時熒光PCR技術進行檢測，還具有自動化程度高、無需開蓋檢測產物、可減少產物污染的機 會等特點。


圖1是試劑盒EV71型腸道病毒5’ UTR區靈敏度檢測結果圖。圖2是試劑盒Cox A16型腸道病毒5’ UTR區靈敏度檢測結果。圖3是試劑盒EV71型腸道病毒polyprotein基因靈敏度檢測結果圖。
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圖4是試劑盒Cox A16型腸道病毒polyprotein基因靈敏度檢測結果圖。圖5是試劑盒EV71型腸道病毒標本檢測結果圖。圖6是試劑盒Cox A16型腸道病毒標本檢測結果圖。圖5中1為5，UTR區通用區擴增結果，II為EV71型Polyprotein擴增結果，III 為Cox A16型Polyprotein擴增結果。圖6中方框內為5，UTR區通用區擴增結果，圓形內為EV71型Polyprotein擴增 結果，三角形內為Cox A16型Polyprotein擴增結果。
具體實施例方式為了特異性檢測樣品中致手足口病的EV71和Cox A16型腸道病毒的能力，發明 人選擇了兩種腸道病毒的5' UTR區基因片段作為靶標序列，針對該基因序列設計了特異 性引物(Pl:5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3 ‘ , P2 5' -GTCGGTTCCGC TGCAGAGT-3 ‘)，用 于本發明中。同時，為了進一步鑒別檢測樣品中致手足口病的EV71和Cox A16型腸道病 毒，發明人選擇了 polyprotein基因作為靶標序列，針對該基因設計了特異性引物(P3 5 ‘ -CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3 ‘ , P4 5 ‘ -TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3 ‘ ；P5 5‘ -ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3 ‘ , P6 5' -CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3 ‘)，用于本發 明中。在本發明的一個實施方式中，選擇Pl和P2作為特異性引物，其探針為 Probel (5 ‘-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬滅基團 _3 ‘)和 Probe2 (5'-熒 光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光淬滅基團-3 ‘，其中，Y = T或者C)，其熒光基 團和熒光淬滅基團分別是FAM和ECLIPSE;選擇P3和P4作為特異性引物，其探針為 Probe3 (5 ‘-熒光基團-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-熒光淬滅基團-3 ‘)，其熒光基團 和熒光淬滅基團可以分別是HEX和ECLIPSE;選擇P5和P6作為特異性引物，其探針為 Probe4 (5 ‘-熒光基團-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACA ACTT-熒光淬滅基團 _3 ‘，其中，Y = T 或者C)，其熒光基團和熒光淬滅基團分別是Cy5和BHQ3。使用本發明的real-time PCR方 法，在一次檢測中即可完成致手足口病的EV71和Cox A16型腸道病毒的鑒別檢測。其操作 簡便，在加入所需試劑開始反應后，不需再次開蓋加樣和取樣，避免了污染的發生。其結果 可以直接讀出，而不需要后續的諸如凝膠電泳之類的操作，大大節省了檢測的時間。下面結合具體實施例詳細說明本發明的實施方式。需要指出的是，這里列出的實 施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發明范圍的任何限制。其中使用的 試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人員可 根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本發明的目的。引物和TaqMan探針的設計與合成利用Genbank的Blast工具對EV71和Cox A16型腸道病毒5 ‘ UTR區和 polyprotein基因進行分析，選擇其保守區域作為檢測靶標序列設計上述引物和探針 (P1-P6，Probel-Probe4)，設計完成后進行人工合成。以下各實施例中涉及的引物或探針， 均分別來自此系列人工合成產物。實施例1一種用于檢測致手足口病腸道病毒的組合物，由下列引物組成0087]
0088]
0089]
0090] T或者
0091]
0092]
0093]
0094]
0095]
0096]
0097]
0098]
0083]Pl 5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘
0084]P2 5' -GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘
0085]實施例2
0086]一種用于檢測致手足口病腸道病_
；的組合物，由下列引物和探針組成
Pl 5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘， P2 5' -GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘；
Probel 5'-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬滅基團 _3‘， Probe2 5'-熒光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光淬滅基團 _3‘，其中，Y =C。
實施例3
一種用于檢測致手足口病腸道病;
；的組合物，由下列引物組成
Pl 5'-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘，
P2 5'-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘；
P3 5'-CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3‘
P4 5'-TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3‘
P5 5'-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3‘，
P6 5'-CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3‘
0099]實施例4
0100]一種用于檢測致手足口病腸道病;
；的組合物，由下列引物和探針組成
0101] 0102]
0103]
0104]
0105]
0106]
0107]
0108] T或者C;
0109]Probe3 5'-熒光基團-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-熒光淬滅基團-3 ‘，
0110]Probe4 5'-熒光基團-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAAC TT-熒光淬滅基團 _3‘，其 中，Y = T或者C;
0111]實施例5
0112]一種用于檢測致手足口病腸道病；
Pl 5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘， P2 5' -GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘； P3 5' -CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3‘， P4 5' -TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3‘； P5 5' -ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3‘， P6 5' -CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3‘；
Probel 5'-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬滅基團 _3‘ Probe2 5'-熒光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光淬滅基團 _3‘
，其中，Y =
；的試劑盒，其中含有下述引物和探針
0113]上游引物(Pl)5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘，
0114]下游引物(P2)5' -GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘；
0115]EV71 病毒檢測探針(Probel) :5,-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬 滅基團-3'， Cox A16 病毒檢測探針(Probe2) :5'-熒光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光 淬滅基團-3'，其中，Y = T或者C;
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下游引物(P2)上游引物(P3)下游引物(P4)上游引物(P5)下游引物(P6)還含有熒光基團FAM和熒光淬滅基團ECLIPSE。反應體系為20μ 1，5XPCR 緩沖液 4μ l、10mmol/L dNTP 1. 0 μ 1、25 μ mol/L 引物 各0. 5 μ 1、10 μ mol/L探針各0· 2 μ 1、QIAGEN逆轉錄和聚合酶混合物1 μ 1、模板Iul，加滅 菌水至終體系20 μ 1。實施例6一種用于檢測致手足口病腸道病毒的試劑盒，其中含有下述引物和探針上游引物(Pl)5' -CCCTGAATGCGGCTAATCC-3‘，5' -GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3‘； 5' -CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3‘， 5' -TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3‘； 5' -ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3‘， 5' -CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3‘；EV71 病毒檢測探針(Probel) :5,-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬 滅基團-3'，Cox Α16 病毒檢測探針(Probe2) :5'-熒光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光 淬滅基團-3'，其中，Y = T或者C;EV71 病毒檢測探針(Probe3) :5,-熒光基團-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-熒光淬 滅基團-3'，Cox A16病毒檢測探針(Probe4) 5 ‘ _熒光基 團-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAACTT-熒光淬滅基團-3 ‘，其中，Y = T 或者 C ；還含有三對熒光基團和熒光淬滅基團，分別是FAM 和 ECLIPSE ；HEX 和 ECLIPSE ；Cy5 和 BHQ3 ；反應體系為20μ 1，5XPCR 緩沖液 4μ l、10mmol/L dNTP 1. O μ 1、25 μ mol/L 引物 各0. 5 μ 1、10 μ mol/L探針各0· 2 μ 1、QIAGEN逆轉錄和聚合酶混合物1 μ 1、模板Iul，加滅 菌水至終體系20 μ 1。實施例7利用本發明的組合物或試劑盒，建立三重real-time PCR方法的檢測體系，并對其 檢測敏感度及特異性等進行評價，包括下述主要步驟(1)樣本中RNA的抽提利用QIAGEN公司提供的病毒RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)，抽 提手足口病毒樣本中病毒RNA。-80°C保存備用。(2)質粒標準品的構建與制備采用TA克隆技術構建目的質粒。在經過電泳確認擴增片段分子量后，將EV71和 Cox A16型腸道病毒5' UTR區和Polyprotein基因特異性序列的PCR產物連至pMD18-T載 體(日本TaKaRa公司)上，重組陽性克隆培養后抽提質粒(Omega質粒提取試劑盒)，采用 PMD18-T載體的RVM引物進行測序，利用DNASTAR軟件進行序列分析，并與原目的序列進行 比對。序列完全正確的目的質粒用紫外分光光度法定量(Eppendorf紫外分光光度計)后， 用IXTE(ρΗ8. 0)ΤΕ緩沖液稀釋到IOltl拷貝/μ 1作為儲存液，-80°C保存備用，使用時連續 10倍稀釋至濃度在1. OX IO1拷貝/ μ 1 1. OX IO6拷貝/ μ 1之間，取ι μ 1標準品作為實時定量PCR的模板，使參加每個PCR反應的質粒數形成10個拷貝到IO6拷貝的梯度分布。 并且使用上述設計并合成的的引物(P1-P6)和探針(Probel-Probe4)。三重 real-time PCR 反應體系反應體系為20口1，取5\ 0 緩沖液4口1、10讓01/1(1^131. 0 μ 1、25 μ mol/L 引 物各0. 5 μ 1、10 μ mol/L探針各0. 2 μ UQIAGEN逆轉錄和聚合酶混合物1 μ 1、模板Iul (樣 本中提取的核酸或者質粒標準品)，加滅菌水至終體系20 μ 1。PCR循環參數50°C逆轉錄30min，95°C lOmin，進入循環階段95°C變性15s，60°C 退火延伸lmin，共反應40個循環。在擴增結束后按同一條件分析數據，確定各樣品的Ct值。確立三重real-time PCR方法的檢測體系。(3)檢測體系的檢測敏感度的評價以四種質粒梯度稀釋作為模板，進行三重real-time PCR檢測時顯示，當反應體系 中EV71和Cox A16型腸道病毒5' UTR區和Polyprotein基因在IO1拷貝及以上時，其熒 光信號強度ARn高于檢測域值(ARn = 30)，其檢測范圍是1.0X IO1 1.0X IO6拷貝每 反應體系(圖1-圖4)，重復實驗結果穩定。20例手足口病病例皰疹液標本的檢測結果如 圖5和6所示。(4)檢測特異性的評價以輪狀病毒、諾如病毒、麻疹病毒、風疹病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、水 痘病毒和人體基因組為模板，使用包含上述設計引物和探針的三重反應體系，評價三重 TaqMan實時熒光PCR反應體系的特異性。利用前述檢測體系對EV71和Cox A16型腸道病毒進行檢測的結果可見明確的擴 增曲線；對上述輪狀病毒、諾如病毒、麻疹病毒、風疹病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、 水痘病毒和人體基因組進行檢測時，均未產生陽性擴增曲線，說明本發明使用的引物和探 針等與輪狀病毒、諾如病毒、麻疹病毒、風疹病毒、腺病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、水痘病毒 和人體基因組不存在交叉反應。通過上述各實施例示例性說明了本發明的某些實施方式，但是本領域技術人員 應了解，本發明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據本發明所屬技術領域的 知識對其進行修改，所作修改不會超出本發明要求保護的范圍。例如，本發明所使用的 real-time PCR也可以根據需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光基團和熒光淬 滅基團以外的標記物質，如HEX、TAMRA, ROX、BHQ、Cy3、TxRcU JOE等標記物；或使用Taqman 技術之外的其他標記體系，例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒光雙雜交探針等 熒光探針標記技術；或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和 染料，只要其使用了本發明所述的特異性引物序列，即可定量檢測目的基因的存在，進而特 異性地檢測樣品中是否存在能夠致手足口病的EV71和Cox A16型腸道病毒。所以，這些本 領域技術人員所了解的改變和慣用手段的替換也落入本發明的保護范圍內。
權利要求
一種用于檢測致手足口病腸道病毒的組合物，其特征在于該組合物中包括下列引物P15′ CCCTGAATGCGGCTAATCC 3′，P25′ GTCGGTTCCGCTGCAGAGT 3′。
2.根據權利要求1所述的組合物，其特征在于所述的組合物中還包括下列探針 Probel 5'-熒光基團-AACTGCGGAGCACACGCCCAC-熒光淬滅基團 _3‘，Probe2 5'-熒光基團-CTGCGGAGCGCGYACCCTCA-熒光淬滅基團 _3‘，其中，Y = T 或 者Co
3.根據權利要求2所述的組合物，其特征在于所述的熒光基團為FAM，熒光淬滅基團 為 ECLIPSE。
4.根據權利要求1或2所述的組合物，其特征在于所述的組合物中還包括下列引物 P3 5' -CAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAA-3‘，P4 5' -TCAATTACATCTGCCACCCTATCTC-3‘； P5 5' -ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3‘， P6 5' -CAGTGTTGGCAGCTGTAGGTAGTAC-3‘。
5.根據權利要求4所述的組合物，其特征在于所述的組合物中還包括下列探針 Probe3 5'-熒光基團-CCTGCAGACGGGCACCATCCA-熒光淬滅基團 _3‘，Probe4 5'-熒光基團-CTTTGGCAGCAGCYCAGGACAACTT-熒光淬滅基團 _3‘，其中，Y = T或者C;并且在二個探針中分別使用不同的熒光基團。
6.根據權利要求5所述的組合物，其特征在于所述的二對熒光基團和熒光淬滅基團 分別為:HEX 和 ECLIPSE ；Cy5 和 BHQ3。
7.含有權利要求1-6中任一項所述的組合物的試劑盒，其特征在于該試劑盒中還含 有RT-PCR反應體系。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述的RT-PCR反應體系為實時定量 PCR 反應體系；反應體系為 20μ 1，5XPCR 緩沖液 4μ 1、IOmmo 1/LdNTP Ι.Ομ l、25ymol/L 引物各0. 5 μ 1、10 μ mol/L探針各0. 2 μ 1、QIAGEN逆轉錄和聚合酶混合物1 μ 1、模板Iul， 加滅菌水至終體系20 μ 1。
9.利用權利要求1-6中任一項所述的組合物、或者利用權利要求7或8所述的試劑盒， 檢測致手足口病腸道病毒的方法，包括下述主要步驟(1)、提取RNA提取樣品中的腸道病毒RNA ；(2),real-time PCR反應以上述步驟(1)提取得到的樣品中的腸道病毒RNA為模板， 使用所述的組合物或試劑盒，用real-time PCR法擴增EV71和Cox A16型腸道病毒特異性 基因片斷；(3)、結果分析對上述步驟(2)real-timePCR反應的結果進行分析，得出檢測結論。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于 所述的real-time PCR法的循環參數為50°C，逆轉錄30min ；95°C, IOmin ；進入循環階段95°C變性15s，60°C退火延伸lmin， 共反應40個循環。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測致手足口病腸道病毒的組合物，其中包括上游引物P15′-CCCTGAATGCGGCTAATCC-3′，和下游引物P25′-GTCGGTTCCGCTGCAGAGT-3′。利用該組合物，配合適當的探針及其它試劑，使用real time PCR方法，可以特異性地檢測出樣品中的EV71和Cox A16型腸道病毒5′UTR區基因片斷。本發明還公開了含有該組合物的試劑盒、以及利用此組合物或試劑盒檢測EV71和/或Cox A16型腸道病毒的方法。利用該組合物或試劑盒、和/或方法檢測樣品時，能夠在一個反應中，靈敏、快速地檢測出樣品是否存在EV71和/或Cox A16型腸道病毒；從而提檢測效率和靈敏性，同時簡化檢測過程，節約人力、物力和檢測成本。
文檔編號C12Q1/68GK101956021SQ20101024588
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者不公告發明人 申請人:成都新基因格生物科技有限公司