轉基因提高丹參中丹酚酸b含量的方法

專利名稱：轉基因提高丹參中丹酚酸b含量的方法
技術領域：
本發明屬于藥用植物基因工程技術領域，具體涉及到在丹參中轉化擬南芥花青色 素生成轉錄因子1基因提高丹酚酸B含量的方法。
背景技術：
丹參是我國常用大宗道地藥材，為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Mlvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根及根莖，對心腦血管疾病、癌癥及各種炎癥具有顯著的臨床 治療作用。丹參的主要活性成分分為兩大類一類為脂溶性的丹參酮類化合物，另一類為水 溶性的酚酸類成分，主要包括丹參素、迷迭香酸和丹酚酸B等。丹參水溶性化合物因與傳統 用藥多以水煎為主的一致性，越來越多地受到人們的關注。丹酚酸B是目前已知的抗氧化 作用最強的天然產物之一，也是丹參中含量最高、抗氧化活性最強的化合物，其結構上含有 多個酚羥基，具有清除自由基、保護心腦血管、抗肝纖維化、抗腫瘤和抗衰老等功能，是《中 華人民共和國藥典》(2010年版)中丹參藥材質量控制的重要指標性成分。據統計，丹參年 需求量近2. 4萬噸，銷售價格近年來一直維持在10元/千克左右，僅藥材生產銷售近2. 3 億元，以丹參為主要原料制成的中成藥有100多種，其產值超過100億元，其中以丹酚酸B 為藥效基礎的新藥研發倍受人們關注，蘊藏著巨大的市場潛力。由于丹參野生資源幾乎耗 盡，目前藥用丹參以人工栽培為主，而栽培中人們對丹參優良品種的選育重視不夠，導致丹 參質量良莠差異較大。因此，提高丹參中有效成分，特別是丹酚酸B的含量，培育優異的丹 參資源具有重要意義。經對現有技術的文獻檢索發現，國內外科學家嘗試組織培養和細胞工程的方法， 通過生物/非生物誘導子誘導、原位吸附、半連續培養等方式提高丹參酮類物質的含量取 得了較明顯的進展。然而這些手段僅在一定程度上能提高丹參某一時期酮類物質的含量， 沒有涉及丹參酚酸類成分，特別是丹酚酸B含量的提高。另外，此類方法篩選帶有一定的 盲目性，很難獲得持續穩定高產的丹參新品系，使其應用受到了限制。在諸多方法之中，利 用基因工程技術對藥用植物次生代謝途徑的遺傳特性進行改造，提高藥用植物有效成分含 量，培育能夠大量積累目標次生代謝物的新品種，愈來愈受到人們的關注。以轉基因技術為 核心的現代分子育種技術在改良藥用植物、豐富中藥資源、提高抗病性和抗逆性、培養高天 然藥物含量的新型轉基因藥材中有著誘人的應用前景。但目前利用轉基因技術提高丹參中 丹參酚酸類成分，特別是丹酚酸B含量的方法尚無報道。植物代謝途徑是由多種酶參與的多步反應，受發育、環境等因素的影響，而對單個 基因進行修飾有時難以奏效。轉錄調控因子可調控植物次生代謝物合成途徑中多個關鍵酶 基因的表達，有效地激活或抑制整條代謝途徑，從而調節特定次生代謝物質的合成與否以 及積累量的多少。轉錄因子通常指由核基因編碼的一類蛋白質，它們主要以同源或異源二 聚體的形式同順式作用因子發生特異性的結合，通過和某些輔助調控子發生作用而影響轉 錄復合體的形成，從而調節植物基因的特異性表達。改變轉錄因子的表達往往可導致植物 中該轉錄因子所控制性狀發生較大改變，因此，利用基因工程的方法調控轉錄因子是具有應用價值的植物遺傳操作手段。本發明通過構建轉錄因子過表達載體，將擬南芥花青色素 生成轉錄因子1基因導入丹參中，提高丹參中丹酚酸B的含量，可以填補該領域研究的空 白，因而該技術路線具有較強的創新性。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于克服上述技術中的不足，提供一種提高丹參中丹 酚酸B含量的新方法。解決上述技術問題所采用的技術方案是由下述步驟組成1、采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的cDNA全長。2、把擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因連接于表達調控序列，形成含有所述基 因的植物表達載體。3、將擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因轉化根癌農桿菌EHA105，獲得用于轉化 丹參的含有所述植物表達載體的根癌農桿菌菌株。4、用所構建的根癌農桿菌菌株轉化丹參，培養并獲得經聚合酶鏈式反應檢測的轉 基因丹參植株。5、半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參植株中擬南芥花青色素生成 轉錄因子1基因的表達。6、對獲得的轉基因丹參植株中丹酚酸B含量進行高效液相色譜測定，篩選獲得丹 酚酸B含量顯著提高的轉基因丹參植株。本發明的采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的cDNA全 長方法為設計可擴增出擬南芥擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因完整編碼框的引物， 并在上游和下游引物上分別引入BglII和BstEII限制性酶切位點，上游引物為5’-AGATCT ATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3，，下游引物為 5，-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3，，以 擬南芥cDNA為模板，經聚合酶鏈式反應擴增，獲得的擴增產物進行電泳分離，回收連接，轉 入大腸桿菌DH5 α，測序驗證并得到所述基因的cDNA編碼序列。本發明的把擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因連接于表達調控序列，形成含有 所述基因的植物表達載體的方法為用BglII和BstEII雙酶切所述的擬南芥花青色素生成 轉錄因子1基因的pGEM T-easy載體和pCAMBIA1302植物表達載體，回收連接轉化，挑取單 克隆，提取質粒做聚合酶鏈式反應檢測和酶切驗證，得到含有所述基因的植物表達載體。本發明的將擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化 丹參的含有所述植物表達載體的根癌農桿菌菌株的方法為將所述的含擬南芥花青色素生 成轉錄因子1基因的植物表達載體轉化根癌農桿EHA105，進行聚合酶鏈式反應驗證，獲得 含有所述植物表達載體的根癌農桿菌菌株。本發明的經聚合酶鏈式反應檢測的轉基因丹參植株為用所述的根癌農桿菌菌株 轉化丹參葉片，置于由MS培養基、4. 4μ M ΒΑΡ、0. 5μΜ NAA、200mg/L頭孢霉素、5mg/L潮霉 素組成的固體培養基上進行選擇培養，長出抗性芽后將其轉入附加5mg/L潮霉素的V2MS 培養基上生根，獲得潮霉素抗性的再生丹參植株，用擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因 的特異性檢測引物聚合酶鏈式反應擴增再生丹參植株DNA，紫外線下觀察到747bp目的條 帶的陽性株系即為轉基因丹參植株。
本發明的半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參植株中擬南芥花青色 素生成轉錄因子1基因的表達方法為用擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因和丹參管家 基因延長因子l-α的檢測引物，進行半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應擴增，用相對定量法 分析擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因相對表達量。本發明的對獲得的轉基因丹參植株中丹酚酸B含量進行高效液相色譜測定方法 為用Wienomenex硅膠基質C18反向色譜柱，以質量分數為0. 4%的醋酸水溶液、乙腈和甲 醇為流動相梯度洗脫，流動相梯度洗脫程序為0. 01 5分鐘，質量分數為0. 4%的醋酸水溶 液體積由95%降為90%，乙腈體積由5%升至10%;5 25分鐘，質量分數為0. 4%的醋酸 水溶液體積由90%降為67%，乙腈體積由10%升至30%，甲醇體積由0升至3% ；25 40 分鐘，質量分數為0.4%的醋酸水溶液體積由67 %降為60 %，乙腈體積由30 %升至35 %，甲 醇體積由3%升至5%。柱溫30°C，流速1. OmL/分鐘，檢測波長^Onm,進樣量20 μ L，丹酚 酸B的含量根據其峰面積由標準曲線回歸方程y = 5E-8x-0. 0134 (r2 = 0. 9997)進行計算，式中χ表示樣品中丹酚酸B的峰面積，y表示丹酚酸B的濃度，單位mg/ mL，r表示相關系數。本發明將擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因轉入丹參植株，篩選獲得了丹酚酸 B含量顯著提高的轉基因丹參植株。在生長165天的轉基因的丹參干燥根中，丹酚酸B的 含量高達73. 27mg/g，是同時期非轉化普通丹參干燥根中丹酚酸B含量(36. 98mg/g)的2. 0 倍，高于《中華人民共和國藥典》(2010年版)中規定的丹參藥材質量標準，為提高丹參中丹 酚酸B含量提供了一種新方法，可在丹參的培育中推廣使用。


圖1是聚合酶鏈式反應檢測的轉基因丹參植株的電泳圖。圖2是半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參植株中擬南芥花青色素生 成轉錄因子1基因表達量的電泳圖。圖3是高效液相色譜測定轉基因丹參植株中丹酚酸B含量的色譜圖。 具體實施方案下面結合附圖和實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限于這些實施例。實施例1本實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照已知的方法進行操作，例如 Sambrook 等〈〈分子克隆實驗室手冊〉〉(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行操作。1、擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因cDNA全長的克隆(1)擬南芥總RNA的提取選取新鮮、健壯的擬南芥幼苗全株，利用杭州博日科技有限公司生產的Biozol總 RNA提取試劑盒分離提取其總RNA。提取方法參照Biozol總RNA提取試劑盒(Cat# BSC51S1) 說明書。(a)提取擬南芥總RNA的實驗前準備工作
所使用的各種玻璃儀器、槍頭、離心管、全部洗凈，浸泡于經過夜搖勻的體積 分數為0. 的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液中，浸泡M小時以上，取出后在121°C， 1. 034X IO5Pa蒸汽滅菌40分鐘，50°C烘干備用。(b)向洗凈的研缽中加入適量酒精燒研缽和藥匙，待研缽冷卻后，取Ig丹參材料， 置于液氮中研磨成粉末，加入ImL Biozol RNA提取試劑，劇烈震蕩后室溫下孵育15分鐘， 使樣品充分裂解至透明。上述的Biozol RNA提取試劑由杭州博日科技有限公司生產。(c)將勻漿液4°C，12000轉/分鐘離心5分鐘，取上清棄去沉淀。(d)按照氯仿與Biozol RNA提取試劑的體積比為1 5加入氯仿，蓋緊管蓋，顛倒 振蕩混勻，冰上孵育15分鐘。(e)4°C, 12000轉/分鐘離心15分鐘，取上清層。(f)將上清層轉移到干凈的離心管中，按Biozol RNA提取試劑與氯仿、水飽和酚 的體積比為5 1 1加入氯仿、水飽和酚，振蕩混勻15秒。(g)4°C, 12000轉/分鐘離心15分鐘，取上清層。(h)將上清層轉移到干凈的離心管中，加入等體積冰浴的異丙醇，溫和顛倒振蕩混 勻，_20°C條件下孵育20分鐘以上。(i) 40C，12000轉/分鐘離心10分鐘，棄去上清，留沉淀，RNA沉淀通常形成片狀沉
淀附著于管壁或者管底。(j)用冰浴的ImL體積分數為75 %的乙醇水溶液洗滌RNA沉淀，顛倒洗滌離心管
管壁，并渦旋振蕩樣品，盡可能讓沉淀懸浮。(k) 40C，12000轉/分鐘離心5分鐘，再次去除上清，于陰涼處適度晾干沉淀。(1)加入100 μ L的無RNA酶水溶解沉淀，抽提好的RNA，保存于_80°C或者立即以 120伏電壓，瓊脂糖凝膠電泳檢測。(2)cDNA第一鏈的合成選取質量較好的RNA利用TaKaRa公司的M-MLV (RNase H-)反轉錄酶合成cDNA第 一鏈。步驟如下(a)在反應管中加入Ing-I μ g總RNA，以及1 μ L oligo (dT) 18 (50mM)，加入體積分 數為0. 1 %的DEPC水溶液至12 μ L，將反應液混勻，70°C孵育10分鐘后迅速在冰上急冷2 分鐘以上。(b) 3000轉/分鐘離心30秒使模板RNA/引物的變性溶液聚集于反應管底部。(c)反應液中依次加入5 X M-MLVBuffer4 μ LdNTP Mixture (各 IOmM)1 μ LRNase Inhibitor (40U/ μ L)0. 5 μ LRTase M-MLV (RNase F) (200U/ μ L) 1 μ LRNase free dH20力口至 20 μ L(d)將反應混合液混勻，42°C孵育60分鐘，70°C孵育15分鐘終止反應；(e)將反轉錄所得的cDNA稀釋10倍，-20°C保存備用。(3)擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因cDNA的聚合酶鏈式反應擴增
根據所述的擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的cDNA序列(核苷酸序列表)， 利用I^emier Primer 5. 0軟件，設計1對引物，設計擴增出完整編碼框的上下游引物，并在 上游和下游引物上分別引入BglII和BstEII限制性酶切位點，以便構建表達載體。構建上 游引物 AtPAPl-F 為5’ -AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAAGG-3，；下游引物 AtPAPl-R 為5’ -GG TAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3，。以擬南芥cDNA為模板，經聚合酶鏈式反應擴增， 將獲得的擴增產物于的瓊脂糖凝膠電泳進行分離，目標片段回收后與pGEMT-easy載體 連接，轉入大腸桿菌DH5 α，隨機挑選所得陽性克隆經菌落聚合酶鏈式反應檢測后送上海生 工生物工程有限公司進行測序。測序結果表明，所克隆的序列與GenBank中所報道的擬南 芥花青色素生成轉錄因子1基因的cDNA編碼序列(核苷酸序列表)一致。所述的采用基因克隆方法從擬南芥中獲得序列正確的擬南芥花青色素生成轉錄 因子1基因，為通過轉基因提高丹參中丹酚酸B含量提供了一個重要的轉錄因子基因。2、含擬芥花青色素生成轉錄因子1基因的植物表達載體的構建以pCAMBIA1302(為市場銷售的生物材料，由澳大利亞CAMBIA公司生產)為植 物表達載體，用擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因替換其上的綠色熒光蛋白基因，即用 BglII和BstEII雙酶切含有擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的pGEM T-easy載體和 PCAMBIA1302植物表達載體，回收擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因和pCAMBIA1302大片 段，連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做聚合酶鏈式反應和酶切驗證，得到含有所述基因的 植物表達載體。上述的將擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因連接于表達調控序列，形成含有所 述基因的植物表達載體，該表達載體可用于通過基因工程策略來提高丹參中丹酚酸B的含量。3、含擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株的獲 得將含擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的植物表達載體轉入根癌農桿菌 EHA105，根癌農桿菌EHA105為市場出售的生物材料，由澳大利亞CAMBIA公司生產，菌株編 號為Gambarl，并進行聚合酶鏈式反應驗證。驗證結果表明，含擬南芥花青色素生成轉錄因 子1基因的植物表達載體已成功構建到根癌農桿菌菌株中。具體的構建方法如下用氯化鈣法制備感受態農桿菌EHA105，在50mL的無菌離心管中加入5mL LB液體 培養基(含利福霉素20mg/L)，用滅菌的牙簽從平板上挑取生長良好的EHA105單菌落接種 于該離心管中，在恒溫培養箱內28V 180轉/分鐘培養16 18小時，次日取2mL培養物 接種到含IOOmL LB液體培養基的錐形瓶中，恒溫培養箱內180轉/分鐘快速培養至 OD600為0. 4 0. 6，無菌條件下轉移菌液至兩只高壓滅菌的50mL離心管中，立即冰浴30分 鐘，4°C 5000轉/分鐘離心8分鐘收集細胞，棄上清，加IOmL預冷的0. ImoL CaCl2溶液溫 和重懸菌體，冰浴20分鐘，4°C保存10小時備用。采用以下方法獲得含擬南芥花青色素生 成轉錄因子1基因植物表達載體的根癌農桿菌菌株取一管EHA105感受態細胞置冰上溶化，將含擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因 植物表達載體30ng加入到100 μ L溶化后的感受態細胞中，冰浴40分鐘，42°C熱激90秒， 移至冰上放置1 2分鐘，向試管中加入400 μ L LB液體培養基，280C 100轉/分鐘恢復培 養3 4小時，將菌液均勻涂布于含有利福霉素G0mg/L)和壯觀霉素(50mg/L)的LB固體培養基上，28°C恒溫培養箱中倒置培養18 36小時，挑取抗性單菌落，接種于IOmL LB液 體培養基中(含壯觀霉素50mg/L，利福霉素20mg/L)J8°C 180轉/分鐘振蕩培養16小時， 用菌落聚合酶鏈式反應擴增擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因。結果表明，含有擬南芥 花青色素生成轉錄因子1基因植物表達載體已經成功地構建到根癌農桿菌菌株中。4、轉基因丹參植株的獲得(1)根癌農桿菌介導擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因轉化丹參(a)外植體的預培養丹參種子用流水沖洗，用體積分數為75%乙醇水溶液表面滅菌20秒，二次蒸餾水 沖洗2次，每次4分鐘，用體積分數為0. 1 %的升汞水溶液表面滅菌10分鐘，二次蒸餾水 沖洗5次，種子用濾紙吸干表面殘存的水分后置于MS基本培養基上萌發，25°C，16小時/8 小時3000LUX光/暗培養，獲得的無菌試管苗，從節間切斷，將帶有2個腋芽的莖段扦插于 1/2MS培養基上，每四周繼代繁殖一次。轉化所用的材料均為繼代2 4次的丹參試管苗， 其中繼代培養20天的幼苗用于基因轉化，繼代培養30天的幼苗用于核酸提取及各種檢測。選取繼代培養20天的丹參無菌苗，將其葉片切成0. 5cmX0. 5cm的小塊，轉入預培 養培養基中(MS培養基附加4. 4 μ M BAP和0. 5 μ M NAA)，在正常培養條件下預培養1天。(b)浸染及共培養將預培養的丹參葉片取出，3/4丹參葉片放入含擬南芥花青色素生成轉錄因子1 基因植物表達載體的根癌農桿菌菌液中浸染25 30分鐘，取出丹參葉片，將其表面的菌液 用濾紙吸干，轉移到預培養培養基上培養2 3天。1/4丹參葉片不在菌懸液中進行浸染， 直接在預培養培養基上生芽后，將芽剝落，置于1/2MS培養基上生根，作為實驗未轉化的對 照植株。(c)選擇培養共培養2 3天后，將外植體從原培養基上取出，轉接到選擇培養基上。選擇培養 基為預培養培養基附加200mg/L頭孢霉素和5mg/L潮霉素。每10天更換一次選擇培養基。(d)不定芽生根及植株再生待抗性芽長到0.5cm左右時，將抗性芽切下，轉入附加5mg/L潮霉素的1/2MS培養 基上生根，完整的植株從節間切斷，將帶有2個腋芽的莖段扦插于1/2MS培養基上繼代培 養，獲得潮霉素抗性的再生丹參植株。(2)轉基因丹參植株的聚合酶鏈式反應檢測采用改良的十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)方法提取上述轉基因和對照丹參植株 的DNA，利擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因完整編碼框的上下游引物對目的基因進行 聚合酶鏈式反應檢測，電泳圖見圖1，在圖1中M為DNA分子量標準，從上到下依次為100， 250，500，750，IOOObp.第1泳道為非轉化丹參株系，第2泳道為陽性對照即含擬南芥花青 色素生成轉錄因子1基因的植物表達載體，第3-16泳道為不同的轉基因株系，B為未加DNA 模板的陰性對照，由圖1可見，用聚合酶鏈式反應特異引物，能擴增出747bp的特異DNA片 段，而以非轉化丹參基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何片段，說明所述的載體構建和轉 化策略是正確的，目的基因已插入丹參基因組中。轉基因丹參植株的獲得為篩選較高丹酚 酸B含量的丹參株系提供了基本材料。5、半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參植株中擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的表達(1)引物的設計與合成用I^emier Primer 5. 0軟件，設計合成擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因和和 丹參管家基因延長因子l-α的引物，進行半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應擴增，聚合酶鏈 式反應產物凝膠電泳后與非轉化對照丹參株系比較目標片段的擴增。(2)丹參總RNA的提取采用OMEGA公司的植物RNA提取試劑盒按照試劑盒說明書進行(a)實驗準備實驗所用的玻璃、金屬制品于210°C烘烤12小時以上，塑料制品用 體積分數為0. 的DEPC水溶液于37°C浸泡12小時以上，121 滅菌，50°C烘干。電泳緩 沖液用體積分數為0. 1% DEPC水溶液配制。研缽用氯仿潤洗后加入1/3體積的無水乙醇， 充分燃燒，并加液氮冷卻。(b)取_80°C保存的丹參葉片用液氮迅速研磨，取IOOmg加入500 μ L提取緩沖液，
劇烈震蕩。(c)室溫14000轉/分鐘離心5分鐘，取上清轉移至Homogenization Spin Column,室溫14000轉/分鐘離心2分鐘；(d)將收集液轉移至新的離心管中，加入0. 5倍體積的無水乙醇(室溫)渦旋20 秒；(e)將全部混合液加入HiBind RNA Mini column中，室溫10000轉/分鐘離心1 分鐘；(f)棄掉收集管中的液體，HiBind RNA Mini column中加入400 μ LRNA洗脫液I， 室溫10000轉/分鐘離心1分鐘；(g)將柱子轉移至新的收集管中，加入500 μ L RNA洗脫液II，室溫10000轉/分鐘 離心1分鐘；(h)重復步驟(g)；(i)將收集管中的液體倒掉，柱子放回空收集管中，室溫10000轉/分鐘離心2分 鐘；(j)將柱子轉移至一個新的離心管中，在柱子膜的中間部位加50 μ L體積分數為 0. 1 %的DEPC水溶液，室溫靜置2分鐘，10000轉/分鐘離心1分鐘，洗脫獲得的RNA溶液， 用于DNA酶消化；(k) DNase 消化
在離心管中依次加入
總RNA50 μ g
IOXDNase I Buffer5 μ L
DNase I(RNase-free,5U/μ L)2μ L
RNase Inhibitor(40U/μ L)0. 5μ L
RNase Free H2O加至50 μ L
37°C恒溫培養箱中放置1. 5小時
(1)加入50 μ L的體積分數為0.1 %的DEPC水溶液至100 μ L，加入25 μ L苯酚、
24yL氯仿和1 μ L異戊醇，充分混勻，4 0C 10000轉/分鐘離心7分鐘，取上層移至另一離心管中；(m)加入96 μ L氯仿和4 μ L異戊醇，混勻，4°C 10000轉/分鐘離心7分鐘，上層移
至另一離心管中；(η)加入10 μ L的!BmoL醋酸鈉水溶液(ρΗ為5. 2)，250 μ L的預冷的無水乙 醇，-20°C放置1小時以上(ο) 40C，10000轉/分鐘離心20分鐘，棄上清，沉淀用體積分數為70%的乙醇水溶 液洗兩次，4°C 10000轉/分鐘離心5分鐘，棄上清；(ρ)沉淀干燥后，用體積分數為0. 的DEPC水溶液溶解，電泳檢測，_80°C保存備用。(3)cDNA第一鏈的合成cDNA第鏈的合成利用Takara公司Prim必cript 反轉錄試劑盒進行。在反應管中依次加入下列溶液5XPrimeScript Buffer (forreal time)2μ LPrimeScript RT Enzyme Mix10. 5 μ LOligo dT Primer (50 μ Μ)0. 5 μ LRandom 6 mers (100 μ Μ)0. 5 μ LTotal RNA(Iyg)1 μ LRNasefreedH2O力口至 10 μ L將反應混合液混勻，37°C孵育30分鐘，85°C反應5秒，將反轉錄所得的cDNA稀釋 10倍，-20°c保存備用。(4)半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參植株中擬南芥花青色素生成 轉錄因子1基因的表達用非轉化丹參株系為對照，用半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應測定擬南芥花青色 素生成轉錄因子1基因的表達量。半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應擴增條件是94°c、2分 鐘，94°C、30秒，51 °C、30秒，72 °C、25秒，30個循環。結果見圖2，在圖2中，第1泳道為非轉 化丹參株系，第2 6泳道為不同的轉基因株系，由圖2可見，在相同的丹參管家基因延長 因子l-α基因(SmEFl-α)表達水平下，相比非轉化對照丹參株系，3、5、6泳道的轉基因丹 參株系中均有擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的轉錄，表明所述的目的基因已在丹參 中超量表達。6、利用高效液相色譜測定轉基因丹參株系中丹酚酸B的含量(1)高效液相色譜條件及系統適用性以及標準溶液的配制(a)高效液相色譜條件采用日本SHIMADZU公司LC-2010高效液相色譜儀(包括自動進樣器，紫外檢測 器，LCsolution色譜工作站等)，色譜柱為Phenomenex硅膠基質柱(5 μ m C18反向柱， 4. 6mmX250mm)，以質量分數為0. 4%的醋酸水溶液、乙腈和甲醇為流動相梯度洗脫，流動相 梯度洗脫程序為0. 01 5分鐘，質量分數為0. 4%的醋酸水溶液體積由95%降為90%， 乙腈體積由5%升至10% ；5 25分鐘，質量分數為0. 4%的醋酸水溶液體積由90%降為 67%，乙腈體積由10%升至30%，甲醇體積由0升至3% ； 25 40分鐘，質量分數為0. 4% 的醋酸水溶液體積由67%降為60%，乙腈體積由30%升至35%，甲醇體積由3%升至5%;柱溫30°C，流速1. OmL/分鐘，檢測波長280nm，進樣量20 μ L。(b)對照品溶液的制備配制標準溶液稱取丹酚酸B標準品10. Omg,置IOmL容量瓶，加體積分數為70% 的甲醇水溶液定容，作為標準品母液，4°C冰箱中保存。實驗時，分別取標準品母液稀釋成濃 度梯度的標準品溶液，0. 45 μ m微孔濾膜過濾后進樣分析。本發明中采用的流動相梯度洗脫程序，丹酚酸B保留時間為32. 8分鐘，峰形良好， 可保證丹酚酸B與丹參中其它酚酸類成分的分離。(2)繪制標準曲線吸取丹酚酸B標準品10、20、40、60、80、10(^1^分置于具塞試管中，依次加蒸餾水 使最終體積均為2. OmL,在相應的色譜條件下進樣，記錄圖譜及色譜參數，分別以丹酚酸B 峰面積對標準品濃度進行回歸分析，得到丹酚酸B的線性回歸方程為y = 5E-8x-0. 0134 (r2 = 0. 9997)式中χ表示樣品中丹酚酸B的峰面積，y表示丹酚酸B的濃度，單位mg/mL，r表示 相關系數。(3)樣品溶液的制備將丹參干燥根30°C烘至恒重，置于研缽中磨碎，精密稱取20mg粉末于離心管中， 加入1. 5mL體積分數為70%的甲醇水溶液，以功率800W、頻率750Hz的超聲提取30分鐘， 將提取液轉入新的離心管中，4000轉/分鐘離心5分鐘，上清經0. 45 μ m的微孔濾膜過濾后 進樣分析，記錄各樣品中丹酚酸B峰面積，代入線性回歸方程，計算即得丹酚酸B的含量。用高效液相色譜測定轉基因丹參株系中丹酚酸B的含量，結果見圖3，由圖3可見， 在生長165天的轉基因的丹參干燥根中，丹酚酸B的含量高達73. 27mg/g，是同時期非轉化 普通丹參干燥根中丹酚酸B含量(36.98mg/g)的2. 0倍，高于《中華人民共和國藥典》(2010 年版)中規定的丹參藥材質量標準。本實施例用轉化擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的基因工程策略獲得了丹 酚酸B高產的轉基因丹參植株，用高效液相色譜法測定了轉基因丹參中丹酚酸B的含量，為 規模化生產丹酚酸B并最終解決丹參資源緊缺問題提供了一種理想方法。
權利要求
1.一種轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于該方法由下述步驟組成(1)采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的cDNA全長；(2)把擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因連接于表達調控序列，形成含有所述基因 的植物表達載體；(3)將擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因轉化根癌農桿菌EHA105，獲得用于轉化丹 參的含有所述植物表達載體的根癌農桿菌菌株；(4)用所構建的根癌農桿菌菌株轉化丹參，培養并獲得經聚合酶鏈式反應檢測的轉基 因丹參植株；(5)半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參植株中擬南芥花青色素生成轉錄 因子1基因的表達；(6)對獲得的轉基因丹參植株中丹酚酸B含量進行高效液相色譜測定，篩選獲得丹酚 酸B含量顯著提高的轉基因丹參植株。
2.按照權利要求1所述的轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 采用基因克隆方法獲得擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的cDNA全長方法為設計可擴 增出擬南芥擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因完整編碼框的引物，并在上游和下游引物 上分別引入BglII和BstEII限制性酶切位點，上游引物為5，-AGATCTATGGAGGGTTCGTCCAAA GG-3，，下游引物為 5，-GGTAACCCTAATCAAATTTCACAGTCTCTCCATC-3，，以擬南芥 cDNA 為模板， 經聚合酶鏈式反應擴增，獲得的擴增產物進行電泳分離，回收連接，轉入大腸桿菌DH5 α，測 序驗證并得到所述基因的cDNA編碼序列。
3.按照權利要求1所述的轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 把擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因連接于表達調控序列，形成含有所述基因的植物表 達載體的方法為用BglII和BstEII雙酶切所述的擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的 pGEM T-easy載體和pCAMBIA1302植物表達載體，回收連接轉化，挑取單克隆，提取質粒做 聚合酶鏈式反應檢測和酶切驗證，得到含有所述基因的植物表達載體。
4.按照權利要求1所述的轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 將擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化丹參的含有所述植 物表達載體的根癌農桿菌菌株的方法為將所述的含擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因 的植物表達載體轉化根癌農桿EHA105，進行聚合酶鏈式反應驗證，獲得含有所述植物表達 載體的根癌農桿菌菌株。
5.按照權利要求1所述的轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 經聚合酶鏈式反應檢測的轉基因丹參植株為用所述的根癌農桿菌菌株轉化丹參葉片，置 于由MS培養基、4. 4μ M ΒΑΡ、0. 5μΜ NAA、200mg/L頭孢霉素、5mg/L潮霉素組成的固體培養 基上進行選擇培養，長出抗性芽后將其轉入附加5mg/L潮霉素的V2MS培養基上生根，獲得 潮霉素抗性的再生丹參植株，用擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的特異性檢測引物聚 合酶鏈式反應擴增再生丹參植株DNA，紫外線下觀察到747bp目的條帶的陽性株系即為轉 基因丹參植株。
6.按照權利要求1所述的轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參植株中擬南芥花青色素生成轉錄因子1基 因的表達方法為用擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因和丹參管家基因延長因子1-α的檢測引物，進行半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應擴增，用相對定量法分析擬南芥花青色素 生成轉錄因子1基因相對表達量。
7.按照權利要求1所述的轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，其特征在于所述的 對獲得的轉基因丹參植株中丹酚酸B含量進行高效液相色譜測定方法為用Wienomenex 硅膠基質C18反向色譜柱，以質量分數為0. 4%的醋酸水溶液、乙腈和甲醇為流動相梯度洗 脫，流動相梯度洗脫程序為0. 01 5分鐘，質量分數為0. 4%的醋酸水溶液體積由95%降 為90%，乙腈體積由5%升至10% ;5 25分鐘，質量分數為0. 4%的醋酸水溶液體積由 90 %降為67 %，乙腈體積由10 %升至30 %，甲醇體積由0升至3 % ；25 40分鐘，質量分數 為0. 4%的醋酸水溶液體積由67%降為60%，乙腈體積由30%升至35%，甲醇體積由3% 升至5 % ；柱溫30°C，流速1. OmL/分鐘，檢測波長^Onm，進樣量20 μ L，丹酚酸B的含量根 據其峰面積由標準曲線回歸方程 y = 5E-8x-0. 0134 (r2 = 0. 9997)進行計算，式中χ表示樣品中丹酚酸B的峰面積，y表示丹酚酸B的濃度，單位mg/mL， r表示相關系數。
全文摘要
一種轉基因提高丹參中丹酚酸B含量的方法，由下述步驟組成采用基因克隆獲得擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的cDNA全長；構建含有所述基因的植物表達載體；將上述載體轉化根癌農桿菌EHA105，獲得含所述基因的根癌農桿菌菌株；用根癌農桿菌菌株轉化丹參，培養并獲得經聚合酶鏈式反應檢測的轉基因丹參植株；半定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應檢測轉基因丹參中擬南芥花青色素生成轉錄因子1基因的表達；對所述基因表達的轉基因丹參中丹酚酸B含量進行高效液相色譜測定，篩選得到丹酚酸B含量提高的轉基因丹參植株。采用本發明獲得的轉基因丹參植株，生長165天的干燥根中，丹酚酸B的含量高達73.27mg/g，是非轉化普通丹參干燥根中丹酚酸B含量的2倍。
文檔編號C12N15/29GK102061297SQ20101024582
公開日2011年5月18日 申請日期2010年8月4日 優先權日2010年8月4日
發明者張媛, 王喆之 申請人:陜西師范大學