專利名稱：一種生物不對稱轉化制備r－腎上腺素的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，更具體涉及乙醇脫氫酶生物不對稱轉化R-腎上腺素。
背景技術：
(R)-腎上腺素是由腎上腺髓質分泌的一種激素，屬于兒茶酚胺類手性藥物，臨床 上廣泛應用于治療心臟驟停、支氣管哮喘、過敏性休克，也可治療蕁麻疹、枯草熱及鼻粘膜 或齒齦出血。由于腎上腺素分子中存在一個手性中心，而生命過程中發生的各種生化反應 均與手性的識別和應答有關。因而腎上腺素對生物的應答(如在體內的吸收、轉運、組織分 布、代謝和消除)直接關系到它的藥理作用、臨床效果和藥效發揮。例如在支氣管擴張作用 中，R-腎上腺素是其S對映體的45倍。因此，探索單一對映體腎上腺素的制備方法，研究 R-腎上腺素不對稱反應的機制，不僅可以為臨床上正在使用的100多種擬腎上腺素能藥提 供一種制備單一對映體藥物的新方法，而且為腎上腺素能藥不對稱轉化的工業化生產開辟 了一條新的綠色途徑。目前腎上腺素工業化合成路線主要有兩條，一是以相應的α -鹵代苯乙酮為原 料，經胺化及還原后，然后進行化學拆分得單一對映體產品；二是在制備腎上腺素、去甲腎 上腺素和異丙腎上腺素時，以兒茶酚與氯乙酰氯或氯乙酸為原料，通過縮合、氨化及還原， 得相應產物的外消旋體，再用(+)_酒石酸進行化學拆分。但化學合成與拆分方法技術路線 復雜，合成步驟多，費用高，并且拆分后的S對映體無法利用，對環境將造成較大的污染。
發明內容
本發明的目的是提供一種生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，該方法能夠 選擇性地將底物腎上腺酮不對稱轉化為R-腎上腺素，所制得的R-腎上腺素純度高，產物無 需拆分，并且該制備方法成本低，污染少。本發明的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，是利用乙醇脫氫酶催化底物 腎上腺酮中羰基的不對稱還原成為R-腎上腺素。首先將底物腎上腺酮加入錐型瓶中，然后 加入輔酶NADH和乙醇脫氫酶，催化底物腎上腺酮中羰基的不對稱還原，反應最終產物經減 壓干燥得R-腎上腺素。所述減壓干燥條件為45 70°C，0. 05 0. 08 Mpa ；最佳條件為55°C，0. 07 Mpa0生物轉化時間為15 24 h。所述生物不對稱轉化的溫度為32 40°C ；最佳溫度為35°C。所述輔酶NADH的濃度為1 10 mmol/L,乙醇脫氫酶的用量為1 5 ml。所述底物腎上腺酮的濃度為5 120 mmol/L。本發明以乙醇脫氫酶為生物催化劑，以潛手性化合物腎上腺酮為底物，將底物 腎上腺酮加入生物不對稱轉化體系，然后加入乙醇脫氫酶和輔酶煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)，催化底物腎上腺酮中羰基的不對稱還原，最后從生物不對稱轉化系統中分離純化 反應產物R-腎上腺素。該反應除了可以在水相中進行，還可以在有機相，雙水相，離子液體
3和固定化體系中進行。本發明的顯著優點是本發明的R-腎上腺素制備方法專一性強、產率高、操作簡 單、成本低廉、目標產物易分離。所采用的乙醇脫氫酶生物不對稱轉化R-腎上腺素的方法， 不僅能獲得高純度的R-腎上腺素，而且生產成本比現有的低廉，并且產物無需拆分，是一 種具有廣泛應用前景的生產方法，可以滿足迅速發展的醫藥工業的需求。
圖1為轉化產物腎上腺素高效液相色譜圖； 圖2為轉化產物腎上腺素高效毛細管電泳圖3為腎上腺素標準品(A)及轉化產物腎上腺素(B)質譜圖。
具體實施例方式本發明提供的乙醇脫氫酶生物不對稱轉化R-腎上腺素的方法主要用于制備R-腎 上腺素，所述制備方法步驟為在100 mL的錐型瓶中，加入5 120 mmol/L的底物腎上腺 酮(購自Sigma公司)，1 10 mmol/L的輔酶NADH (購自Roche公司)，再加入1 5mL 乙醇脫氫酶(購自Sigma公司)啟動反應，其余部分用50 mmol/L磷酸緩沖液補足。32 40°C水浴鍋保溫15 24 h后，離心除去乙醇脫氫酶，得R-腎上腺素水溶液，經減壓干燥得 R-腎上腺素。其中，減壓干燥條件為45 70°C，0. 05 0. 08 Mpa，最佳條件為55°C，0. 07 MPa。轉化的溫度為32 40°C，最佳溫度為35°C。輔酶NADH濃度為1 10 mmol/L，乙醇脫氫酶用量為1 5mL。 底物腎上腺酮濃度為5 120 mmol/L。以下本發明的幾個具體實例，進一步描述本發明，但是本發明不僅限于此。實施例1
乙醇脫氫酶在離子液體中不對稱轉化R-腎上腺素
在IOOmL錐型瓶中首先加入50 mL由12. 5% (V/V) C4MImBF4和磷酸緩沖液(50 mmol/ L, pH 7. 0)組成的混合溶劑，然后加入底物腎上腺酮(5mmol/L)，輔酶NADH(2mmol/L)和乙 醇脫氫酶(1.5mL)，置錐型瓶于恒溫振蕩培養箱中(35°C，160 r/min)保溫15 h后，得產物 R-腎上腺素。R-腎上腺素濃度采用反相離子對高效液相色譜法測定，其中流動相為甲醇 醋酸鈉-醋酸緩沖液(15 85，V/V)，庚烷磺酸鈉(5mmol/L)為離子對試劑，流速LOmL/ min,檢測波長233nm，柱溫25°C。其中底物腎上腺酮的轉化率為96. 74%,R-腎上腺素的得 率為55.8% (如圖1所示)。產物腎上腺素的光學純度(e.e)采用毛細管電泳分析。電泳 條件為分離電壓10 1^;分離柱溫250(;進樣壓力3.0\103 Pa，進樣時間10 sec ；紫外檢 測波長214 nm。標準樣品用超純水配制(Milli. -Qii型超純水系統)。毛細管預處理為 每次使用前分別用超純水(13. 78X104Pa)淋洗5min、0. lmol/L NaOH (6. 89X 104Pa)淋洗 5min、超純水淋洗5min。每次進樣前用超純水和緩沖液各淋洗3min。其中R-腎上腺素的 e.e值為99. 8% (如圖2所示)。R-腎上腺素的分子量采用Firmigan MATLCQ 離子阱電 噴霧質譜儀測定。質譜檢測采用正離子模式，離子阱條件為噴霧電壓5 KV,殼氣，輔助氣 為N2。金屬毛細管的溫度為270°C，金屬毛細管的電壓為16 KV。腎上腺素在電噴霧電離條件下容易得到質子而帶正電荷，側鏈N原子具有吸質子的特性，樣品通過靜電場以后，得到 的質子很容易結合到N原子上，形成準分子離子峰[M + H]+，圖3為腎上腺素標準品(A) 及本實驗得到的轉化產物R-腎上腺素(B)的質譜圖，A圖中出現的m/zl84. 1強離子峰和B 圖中出現的m/zl84. 2強離子峰應該都屬于準分子離子[Μ + H]+，腎上腺素的標準分子量為 183. 2，A和B的保留時間(A為2. 16 min，B為2. 10 min)也基本一致，表明實驗得到的轉 化產物是R-腎上腺素。實施例2
乙醇脫氫酶在聚乙二醇/(NH4)2SO4雙水相體系中不對稱轉化R-腎上腺素
在250 ml的錐型瓶中，先加入50 ml溶有濃度為0. 004 mol/L的β-環糊精的腎上 腺酮水溶液(腎上腺酮濃度為120 mmol/L)，再加入20 ml質量分數為30 %的PEG2000溶 液，磁力攪拌器搖勻后，加入質量分數為20 %的(NH4)2 SO4和10 mM輔酶NADH以及2. 5 mL 乙醇脫氫酶，加入5 ml NaH2PO4-H3PO4緩沖液調節體系的pH (6. 5 7.0)值后，靜置于35 °C的恒溫振蕩培養箱中反應20 h,待溶液分相完全后，分離上下相。R-腎上腺素和乙醇脫 氫酶主要分布在PEG相中，利用Si^phadex G-100凝膠層析進行腎上腺素和乙醇脫氫酶，以 及PEG2000的分離，具體步驟為首先稱取3 g葡聚糖凝膠(S^hadex G-25)于沸水中煮沸 5 h后冷卻，充分溶脹后的凝膠反復傾瀉去掉表面懸浮的小顆粒，如此反復洗滌2-3次，最 后加入等體積PH 7.0磷酸緩沖液備用。接著取玻璃層析柱垂直固定在鐵架臺上，將層析柱 下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入50 mM磷酸緩沖液(約1/3柱床高度)，調節流速1滴/10 s。待柱中剩余約0. 5 cm磷酸緩沖液時，關掉恒流泵，將溶脹好的凝膠濃漿液緩慢倒入柱中， 待凝膠沉積約1 2 cm高度后打開出水口，控制一定流速，使凝膠一直處于溶液中。然后 關閉出水口，靜置片刻，使凝膠完全沉降。接著用50 mM磷酸緩沖液沖洗洗脫凝膠層析柱， 然后平衡20 min。最后將PEG相中的樣品小心加入到柱床表面，然后打開恒流泵，不斷向 柱內加50 mM磷酸緩沖液進行洗脫，由于R-腎上腺素是小分子化合物，最先被洗脫出來，收 集R-腎上腺素洗脫液，放入減壓干燥箱內減壓干燥，減壓干燥箱的工作條件為55°C，0. 07 Mpa，產物純度為99. 5%。實施例3
乙醇脫氫酶在有機相中不對稱轉化R-腎上腺素
以氯仿為有機相，首先在錐型瓶中加入IOOml氯仿，然后加入0. 6ml磷酸緩沖液，以 確保乙醇脫氫酶保持活性三維結構狀態所需要的最少含水量。在此基礎上，添加底物腎 上腺酮25mmol/L，輔酶NADH 3 mmol/L和乙醇脫氫酶1. 5 ml。加入TW-80 0. 8ml和DMSO 0.6ml以提高乙醇脫氫酶的反應活性，然后把錐型瓶放置在35 °C，180r/min的恒溫振蕩培 養箱中反應18 h，離心除去乙醇脫氫酶后，放入減壓干燥箱內減壓干燥去除溶劑，減壓干燥 箱的工作條件為65°C，0.07 Mpa0乙醇脫氫酶在氯仿中不對稱轉化R-腎上腺素的得率為 65. 3%，產物純度為99. 4%。實施例4
聚N-異丙基丙烯酰胺固定化乙醇脫氫酶不對稱轉化R-腎上腺素 在100克水中，加入N-異丙基丙烯酰胺10g，甲基丙烯酸鈉0.5克，N，N-亞甲基雙 丙基丙烯酰胺0. 005克，乙醇脫氫酶2. 0 ml。然后加入過硫酸銨(0. 01克)及偏重硫酸鈉 (0.02克)啟動聚合反應。整個反應始終是在25 °C下進行，并充以氮氣以消除因氧氣而引
5發的鏈終止。24 h可得含有乙醇脫氫酶的N-異丙基丙烯酰胺與甲基丙烯酸鈉共聚的凝膠。 將凝膠切成直徑約為10 mm、高約為5 mm的圓柱體后，放在蒸餾水中浸泡4h，以去除反應 剩余物及雜質。浸泡后的凝膠放入溫度為50 °C的烘箱干燥，干燥Id后備用。然后稱取10 g含有乙醇脫氫酶的N-異丙基丙烯酰胺與甲基丙烯酸鈉的共聚凝膠，放入250ml的錐型瓶 中，分別加入水50 ml，底物腎上腺酮50mmol/l，輔酶NADH 1 mmol/L。靜置于35 °C的恒溫 振蕩培養箱中反應20 h，反應完畢后，用棉沙布過濾含有乙醇脫氫酶的N-異丙基丙烯酰胺 與甲基丙烯酸鈉的共聚凝膠，收集過濾液，離心去除從凝膠中滲漏出來的乙醇脫氫酶后，收 集離心上清液，置于減壓干燥箱內減壓干燥，減壓干燥箱的工作條件為55°C，0. 07 MPa0
權利要求
一種生物不對稱轉化制備R 腎上腺素的方法，其特征在于利用乙醇脫氫酶催化底物腎上腺酮中羰基的不對稱還原成為R 腎上腺素。
2.根據權利要求1所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于首先 將底物腎上腺酮加入錐型瓶中，然后加入輔酶NADH和乙醇脫氫酶，催化底物腎上腺酮中羰 基的不對稱還原，反應最終產物經減壓干燥得R-腎上腺素。
3.根據權利要求2所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于所述 減壓干燥條件為45 70°C，0. 05 0. 08 Mpa0
4.根據權利要求3所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于所述 減壓干燥條件為55°C，0. 07 Mpa0
5.根據權利要求1或2所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于 生物轉化時間為15 24 h。
6.根據權利要求1或2所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于 所述生物不對稱轉化的溫度為32 40°C。
7.根據權利要求5所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于所述 生物不對稱轉化的最佳溫度為35°C。
8.根據權利要求2所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于所述 輔酶NADH的濃度為1 10 mmol/L,乙醇脫氫酶的用量為1 5 ml。
9.根據權利要求1或2所述的生物不對稱轉化制備R-腎上腺素的方法，其特征在于 所述底物腎上腺酮的濃度為5 120 mmol/L。
全文摘要
本發明提供了一種乙醇脫氫酶生物不對稱轉化R-腎上腺素的方法，該方法利用乙醇脫氫酶催化底物腎上腺酮中羰基的不對稱還原成為R-腎上腺素。本發明的R-腎上腺素制備方法專一性強、產率高、操作簡單、成本低廉、目標產物易分離。本發明所采用的乙醇脫氫酶生物不對稱轉化R-腎上腺素的方法，不僅能獲得高純度的R-腎上腺素，而且生產成本比現有的低廉，并且產物無需拆分，是一種具有廣泛應用前景的生產方法，可以滿足迅速發展的醫藥工業的需求。
文檔編號C12P41/00GK101906457SQ201010245540
公開日2010年12月8日 申請日期2010年8月5日 優先權日2010年8月5日
發明者侯志國, 李忠琴, 許小平, 陳秉梅 申請人:福州大學