專利名稱：一種推斷cyp3a4基因表達量的方法
技術領域：
本發明涉及一種推斷CYP3A4基因表達量的方法。
背景技術：
不同的人對同一種藥物的吸收、運輸和代謝有很大的差異，同一處方劑量的藥物對不同病人的治療效果和毒副作用的差異很大，因此，長期以來，藥物作用的個體差異一直是臨床治療中影響藥物療效的一個重要因素。藥效個體差異的一個主要原因是藥物代謝能力的差異，藥物的代謝主要是由一系列藥物代謝酶來執行的，因而，對藥物代謝酶基因多樣性的研究是了解藥效個體差異原因的基礎。細胞色素P4503A4 (Cytochrome P4503A4，簡寫為CYP3A4)是人體內第一大藥物代謝酶，約占成人肝臟CYP450酶總量的25%，能夠代謝超過50 %的臨床常用藥物，到目前為止，共有20個等位基因被報道。CYP3A4的活性與其在人體肝臟中的表達量相關，其表達水平能夠決定藥物的療效和安全性，但是，由于CYP3A4基因在人體內的表達存在很大的個體差異，因此，個人對CYP3A4相關藥物代謝能力也就存在相當大的差異，這給臨床安全有效用藥帶來了困難。目前，對大部分的藥物代謝相關基因的研究，主要是通過檢測其基因序列的多態性是否關聯到藥物代謝相關基因的表達量或其編碼的蛋白活性的改變來進行的，但大部分的基因多態性只在某些研究或某些特定人群中具有意義，在另一些研究中可能得到相反的結果。同時，由于CYP3A4在人群中的頻率極低，因此，目前尚無法通過SNP(Single nucleotide polymorphism，單一核苷酸多態性)檢測來解釋CYP3A4的表達量和其活性在人群中所存在的相當大的差異。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種推斷CYP3A4基因表達量的方法，它可以用來解釋CYP3A4相關藥物藥效的個體差異，指導臨床合理用藥。為解決上述技術問題，本發明的推斷CYP3A4基因表達量的方法，通過檢測個體 DNA的CYP3A4基因的一個CpG位點的甲基化程度，推斷該個體的CYP3A4基因的表達量。所述CpG位點的甲基化程度通過下列步驟進行檢測(1)抽取受試者外周血樣本的DNA ；(2)用亞硫酸氫鹽處理DNA樣本；(3)用特異性BSP引物擴增步驟(2)得到的DNA樣本；(4)純化步驟(3)的擴增產物；(5)將步驟(4)得到的產物與T載體連接，轉化0冊3感受態菌，然后篩選出陽性克隆；(6)對步驟(5)中篩選出的陽性克隆，用通用引物進行原位菌落PCR，并測定產物的堿基序列；
(7)判斷步驟(6)中測得的堿基序列在該CpG位點是否發生了 C — T的堿基變化， 計算不發生C —T堿基變化的克隆數量，該克隆數量與步驟(5)中篩選出的克隆總數的比率，即為該CpG位點的甲基化程度。所述CpG位點是SEQ ID NO 1中第159位胞嘧啶堿基。所述步驟(3)中的引物包括正向引物和反向引物，該正向引物具有SEQ IDNO :2所示的序列，該反向引物具有SEQ ID NO: 3所示的序列。所述步驟(5)中篩選出的陽性克隆的數目至少為20個。所述甲基化程度> 95%時，推斷該個體的CYP3A4基因的表達量低；所述甲基化程度彡95%時，則推斷該個體的CYP3A4基因的表達量高。本發明通過檢測人體血液DNA位點的甲基化程度，獲得CYP3A4基因在人體內的表達信息，進而推斷出個體對相關藥物代謝能力的差異，以及由此造成的藥效個體差異，從而能夠指導臨床合理用藥，提高用藥的安全性和有效性，避免不良反應，減少藥物治療的費用和風險，實現個體化治療的目標。
下面結合附圖與具體實施方式
對本發明作進一步詳細的說明附圖是本發明實施例1的SEQ ID NO :1第159位堿基的甲基化程度與CYP3A4表達量的相關示意圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發明，而不用于限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1收集73例正常肝臟的病理活檢樣本，每例約50 200mg。前述樣本采集后立刻浸入ImL RNALater中，4°C過夜，待樣本被RNALater充分浸透后，轉移至-70°C保存。樣本經過勻漿之后，利用Qiagen公司的AllPr印DNA/RNA Mini試劑盒抽取DNA和RNA。利用PrimeScript 1st Strand cDNA 合成試劑盒，反轉錄生產 cDNA。以人類基因組DNA(Promega，Catalog No. G152A)作為標準品，ACTB基因作為參照基因，在ABI7900HT儀器上通過熒光實時定量PCR檢測CYP3A4在各個肝臟樣本中的相對表達量。定量PCR的引物為正向GCTCTTCAAGAAATCTGTGCCTG(SEQ ID N0:4)，反向 TCTACACAGACAATGAGAGAGCTCAA(SEQ ID NO :5)，反應體系為 20 μ 1 IX QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix，0. 3 μ M引物，2 μ 1用雙蒸水20倍稀釋的反轉錄產物cDNA，循環參數為95°C變性15分鐘，94°C變性15秒，57°C退火30秒，72°C延伸30秒，共40個循環。在73例樣本中，挑選CYP3A4高表達8例，低表達8例。用亞硫酸氫鈉處理這16 例樣本DNA，然后用特異性BSP引物擴增，引物為正向GTAGTTTGATTTTAGATTGTTGTG(SEQ ID NO 2)；反向 TAACCCCTCCTCTACATTCTATT(SEQ ID NO :3)。擴增產物使用 Qiagen 公司的Qiaquick PCR Purification kit進行純化后，利用T4DNA連接酶與pMD18_T載體連接，轉化入Dffia感受態菌，藍白篩選不少于20個陽性克隆，然后用載體通用引物T7和SP6進行原位菌落PCR，產物直接測序。根據測序結果，計算CYP3A4基因上游，距離CYP3A4基因最近的CpG島中位點的甲基化程度，每個位點的甲基化程度由該位點甲基化的克隆數除以總的克隆數得到。通過t 檢驗，發現在CYP3A4低表達的樣本中，第159位堿基的甲基化程度高；在CYP3A4高表達的樣本中，第159位堿基的甲基化程度低，P值為0.014。附圖顯示了 SEQ ID NO :1第159位堿基的甲基化程度與CYP3A4表達量的關系，圖中橫坐標“mRNA level”表示基因CYP3A4在肝臟中的表達量大小，縱坐標“SlOmethylation status”表示SEQ ID NO :1中第159位堿基的甲基化程度(甲基化比非甲基化所得的比率，最大為1)，從該圖中可以看出，當位點完全被甲基化時，CYP3A4表達量降至0. 67以下；當甲基化程度為95%及以下時，CYP3A4的表達量明顯上升到1. 53以上，差異達到顯著性。實施例2上述實施例1驗證了 CYP3A4基因序列第159位堿基的甲基化程度與CYP3A4基因在人體中的表達量相關，據此，可以通過檢測受試者的CYP3A4基因序列第159位堿基的甲基化程度，來推斷CYP3A4基因在該受試者體內的表達情況。具體方法如下收集受試者外周血血液樣本，抽取DNA。DNA樣本經亞硫酸氫鈉處理后，用特異性 BSP 引物擴增。引物為正向 GTAGTTTGATTTTAGATTGTTGTG(SEQ ID NO :2)；反向 TAACCCCTCCTCTACATTCTATT (SEQ ID NO :3)。擴增產物使用 Qiagen 公司的 Qiaquick PCR Purification kit進行純化后，利用T4DNA連接酶與pMD18_T載體連接，轉化Dffia感受態菌，藍白篩選不少于20個陽性克隆。然后用載體通用引物T7和SP6進行原位菌落PCR，產物直接測序。判斷測得的堿基序列在SEQ ID NO 1序列的第159位是否發生了 C — T (胞嘧啶變為胸腺嘧啶)堿基變化，計算不發生C — T堿基變化的克隆數量在篩選出的克隆總數中的比率，得到CpG位點的甲基化程度。若位點甲基化比率大于95%，就認為該受試者的CYP3A4 基因表達量低；反之，若所得甲基化比率小于或等于95%，則認為該受試者的CYP3A4基因
表達量高。由于CYP3A4基因的表達量與CYP3A4酶的活性相關，因此，本發明的方法可用以解釋CYP3A4基因對藥物代謝的效能，從而確定藥效個體差異的遺傳基礎，為指導臨床合理用藥，提高用藥的安全性和有效性，避免不良反應，減少藥物治療的費用和風險，最終實現個體化治療等目標提供方法和手段。
權利要求
1.一種推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于通過檢測個體DNA的CYP3A4基因的一個CpG位點的甲基化程度，推斷該個體的CYP3A4基因的表達量。
2.如權利要求1所述的推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于所述CpG位點的甲基化程度通過下列步驟進行檢測(1)抽取受試者外周血樣本的DNA；(2)用亞硫酸氫鹽處理DNA樣本；(3)用特異性BSP引物擴增步驟(2)得到的DNA樣本；(4)純化步驟(3)的擴增產物；(5)將步驟⑷得到的產物與T載體連接，轉化Dffia感受態菌，然后篩選出陽性克隆；(6)對步驟(5)中篩選出的陽性克隆，用通用引物進行原位菌落PCR，并測定產物的堿基序列；(7)判斷步驟(6)中測得的堿基序列在該CpG位點是否發生了C —T的堿基變化，計算不發生C —T堿基變化的克隆數量，并用該克隆數量除以步驟(5)中篩選出的克隆總數，計算該CpG位點的甲基化程度。
3.如權利要求1或2所述的推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于所述CpG位點是SEQ ID NO 1中第159位胞嘧啶堿基。
4.如權利要求2所述的推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于所述步驟(3)中的引物包括正向引物和反向引物，該正向引物具有SEQ ID NO :2所示的序列，該反向引物具有SEQ ID NO 3所示的序列。
5.如權利要求2所述的推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于所述步驟(5)中的T載體為pMDIS-T載體。
6.如權利要求2所述的推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于所述步驟(5)中采用藍白斑篩選方法篩選陽性克隆。
7.如權利要求2所述的推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于所述步驟(5)中篩選出的陽性克隆的數目至少為20個。
8.如權利要求1或2所述的推斷CYP3A4基因表達量的方法，其特征在于所述甲基化程度> 95%時，推斷該個體的CYP3A4基因的表達量低；所述甲基化程度< 95%時，則推斷該個體的CYP3A4基因的表達量高。
全文摘要
本發明公開了一種推斷CYP3A4基因表達量的方法，通過檢測人體血液DNA樣本中CYP3A4基因的一個CpG位點的甲基化程度，來推斷CYP3A4基因在該人體內的表達信息。該方法可以推斷出人體中的CYP3A4酶的活性，從而可用以解釋藥效的個體差異性，指導臨床合理用藥。
文檔編號C12Q1/68GK102344958SQ201010245428
公開日2012年2月8日 申請日期2010年8月4日 優先權日2010年8月4日
發明者壽維華, 施錦繡, 王大志, 黃薇 申請人:上海人類基因組研究中心