專利名稱：一種利用類彈性蛋白標簽純化重組乳糖酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種酶的純化方法，尤其涉及一種利用類彈性蛋白標簽通過非色譜方 法純化重組乳糖酶的方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
乳糖酶(EC :3. 2. 1. 23)也稱β -半乳糖苷酶，它能把乳糖分解為易吸收和甜味 品質好的葡萄糖和半乳糖，并且在水解糖過程中還可以發生轉糖苷反應，生成具有多種生 理功能的低聚半乳糖，因此它是解決乳糖不耐癥問題的關鍵，即通過開發低乳糖乳制品或 直接讓患者口服乳糖酶來治療乳糖不耐癥。然而迄今乳糖酶在我國的乳品工業中應用得 很少，一個重要原因是目前我國絕大多數乳糖酶仍是依賴進口，而進口的乳糖酶價格昂貴 (每噸約100萬元人民幣)，使得乳糖酶的使用受到很大的限制。造成乳糖酶價格高的原因 主要有兩點第一，生產乳糖酶的菌株(如脆壁克魯維酵母、乳酸克魯維酵母、黑曲霉和米 曲霉)發酵周期長，產量較低；第二，很多微生物所產生的乳糖酶屬于胞內酶，需經過多步 分離純化才能獲取純度和酶活力均較高的乳糖酶制劑。由于這些分離純化步驟耗時多、效 率低，所需材料價格昂貴，因而使得分離純化的成本占據了乳糖酶60% -70%的生產成本。 解決上述第一個問題的辦法通常是利用現代基因工程和發酵工程技術生產乳糖酶，它的優 點是產量高，生產成本低，周期短，而且不受季節、地理位置等因素的影響。自20世紀70年 代以來，大腸桿菌一直是基因工程中研究最深入、發展最完善、應用最廣泛的表達系統，因 為大腸桿菌具有培養條件簡單、生長繁殖快、安全性好、可以高效表達不同外源基因產物等 特點。目前大量的有價值的多肽和蛋白質已在大腸桿菌中獲得了超量表達。因此采用大腸 桿菌表達系統生產重組乳糖酶，可以在較短的生產周期內獲得大量的重組乳糖酶，從而在 一定程度上降低乳糖酶的生產成本。然而利用大腸桿菌表達系統生產的乳糖酶也是胞內 酶，它的分離純化也需要經過細胞裂解、親和層析等處理步驟。其中的親和層析雖然具有高 選擇、高活性回收率和高純度等特點，并已成為目前純化蛋白質等生物大分子最有效的技 術之一，但它的缺點也很明顯，主要包括耗時大、成本高、處理量小等，這些缺陷不但使得這 種純化蛋白質的生產工藝成本較高，而且也限制了其大規模的工業化應用。據我們了解，目 前國內外利用大腸桿菌表達系統生產重組乳糖酶，其分離純化工藝基本上仍然采用的是細 胞裂解然后進行親和層析的方法。彈性蛋白(elastin)屬于細胞外基質蛋白(extracellular matrix，ECM)，主要分 布于血管、皮膚、韌帶和肺等組織器官。彈性蛋白能提供足夠的彈性和恢復力，從而使組織 器官經受重復和可逆的變形而不至于發生破裂。彈性蛋白原(tropoelastin)是可溶性彈性 蛋白的前體，包括疏水性和親水性兩個結構域，當其定位于細胞外空間時通過賴氨酸氧化 酶催化變成不可溶的彈性蛋白，即高度交錯連接的纖維原。類彈性蛋白多肽(elastin-like polypeptides,ELPs)是彈性蛋白原的疏水結構域衍生來的循環重復氨基酸序列，通過人工 方法合成的具有刺激應答能力的多肽聚合物，主要由Val-Pro-Gly-Xaa-Gly五肽段單元串 連重復組成(Xaa稱為“客體氨基酸”，可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸)。ELPs是眾多刺激應答聚合物中的一類，由于它是由氨基酸編碼的重組多肽，能在分子水平上準確控制 ELPs序列的組成和長度，因而比其他聚合物具有更大的優勢。ELPs可隨著溫度的升高，發 生可逆的相變，即從可溶狀態變成不溶的集合體，該溫度即為相變溫度(Tt)。ELP融合蛋白 又稱為ELPylation，即在目標蛋白的C-端或N-端連接上ELPs，ELP融合蛋白繼承了 ELP 的特性，即也能從可溶狀態變成不溶的集合體。通過改變溫度和離子強度等環境因素，從 而引起ELP融合蛋白發生可逆性溶解，這一過程稱為可逆相變循環(inverse transition cycling, ITC)。通過ITC循環處理，ELP融合蛋白集合體能通過簡單的離心或者超濾收集， 并在低于相變溫度或者改變其他環境條件時能重溶于緩沖液中。因此利用彈性蛋白這一特 性，通過多輪ITC純化過程可滿足工業上簡單、快速和大批量純化目標蛋白的需求。目前國 內外尚無利用類彈性蛋白標簽技術純化乳糖酶的報道。
發明內容
本發明的目的在于提供一種利用類彈性蛋白標簽純化重組乳糖酶的方法，進一步 降低乳糖酶的生產成本和使用成本，實現大規模地分離純化乳糖酶。本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的一種利用類彈性蛋白標簽純化重組乳糖酶的方法，包括以下步驟(1)將乳糖酶基因和類彈性蛋白標簽ELP[V5_80]依次連接到原核表達載體 pET-32a(+)上，構建成乳糖酶融合表達載體pET32a-乳糖酶基因-ELP[V5-80]；(2)構建好的表達載體電擊轉化大腸桿菌表達菌株，然后鑒定過的陽性轉化子進 行自誘導表達50-80小時；(3)收集菌體，用超聲波破碎，離心去除不溶性物質，得到可溶性細胞裂解液即粗 酶液，置于4°C冰箱備用；(4)確定乳糖酶粗酶液沉淀的相變溫度(Tt)；(5)用ITC循環純化乳糖酶重組蛋白。本發明所述的乳糖酶基因為來源于各種微生物的乳糖酶基因，優選乳糖酶基因為 tt412 ；該基因具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2 所示。本發明所述的大腸桿菌優選的表達菌株為BLR(DE3)，該菌株是recA_的衍生菌。本發明所述的自誘導表達條件為將轉化子接種到含TB培養基的三角瓶中， 150-300rpm、30-37 °C 培養，直至 OD6tltl 達到 0. 5-0. 8，然后在 150rpm、20-3(TC 條件下進行自 誘導表達50-80h。本發明所述的菌體收集條件為4-8°C下、6000-10000g離心5-lOmin收集菌體，菌 體用30mL、50mM Tris緩沖液(pH8. 0)洗滌一次后，放入_80°C冰箱中凍存備用。本發明所述的超聲波破碎條件為功率4-8W，破碎時間2_4s，破碎間隔4_8s，總時 間 10-20min。本發明所述的相變溫度的測定過程為取3份Iml的粗酶液，分別加入等體積但 濃度不同的(NH4)2SO4溶液，使粗酶液中(NH4)2SO4的終濃度分別為0. 5-1. 0MU. 0-2. OM和 1. 5-3. 0M,以2°C為梯度測定從16°C到40°C時重組蛋白水溶液的0D_ ；當某個溫度下的 OD600達到在60°C重組蛋白水溶液OD6tltl的一半時，該溫度即為相變溫度Tt。
本發明通過四輪以上的ITC循環，得到純度高的乳糖酶。本發明方法簡單、快速、高效，乳糖酶總酶活的回收率可達55-65%;蛋白質的純化 倍數為2. 0-3. 0倍。本發明不僅僅適用于重組乳糖酶的純化，也可應用于其它重組蛋白質 的分離和純化。因此，本發明可用于大規模地分離純化乳糖酶和其它工業酶制劑，在酶制劑 生產中具有較高的實際應用價值。
圖1為乳糖酶融合表達載體的構建流程；圖2為RDL法合成ELPs聚合物的原理示意圖；圖3為ITC純化過程示意圖；圖4為經1-4輪ITC純化處理后的乳糖酶的SDS-PAGE電泳分析圖；其中，M為高分子量標準蛋白Marker(中國大連TaKaRa公司產品)，SL為破碎后 的可溶性上清，即乳糖酶粗酶液；CS為經ITC循環最后一步冷離心(cold spin, CS)處理后 的純化的乳糖酶融合蛋白；后面的數字代表ITC循環的次數。
具體實施例方式實施例一本實施例優選乳糖酶基因tt412，該基因所產生的重組乳糖酶具有低溫下活性高、 其最適pH(7. 0)接近天然牛奶的pH值(6. 7-6. 8)、耐受天然牛奶中所含有的各種離子(Na+、 K+、Ca2+等)等一系列優點。原核表達載體優選大腸桿菌表達載體pET_32a (+)，該載體具有T7強啟動子，使得 載體上的外源基因的表達量非常高，從而利于后續的純化步驟。大腸桿菌表達菌株優選的表達菌株為BLR (DE3)，該菌株是recA_的衍生菌，能提高 單個質粒表達水平，并可穩定帶有重復序列的質粒或者減少由于質粒的表達產物所引起的 DE3原噬菌體的丟失。步驟1 構建成乳糖酶融合表達載體pET32a-tt412-ELP[V5-80]。將SEQ ID No:l所示的乳糖酶基因tt412構建到大腸桿菌表達載體pET_32a(+) (美國麥迪遜市的Novagen公司產品)上，得到重組載體pET32a_tt412 ；再將SEQ ID NO 3所示的SFI片段連接到重組載體pET32a-tt412上，得到重組載體pET32a-tt412_SFI ；合 成SEQ ID NO :4所示的類彈性蛋白標簽DNA序列ELP [V5-IO]；該DNA序列5 ‘端帶一個 EcoRI酶切位點，3’端帶一個HindIII酶切位點。基因合成后，利用基因兩端的EcoRI和 HindIII酶切位點克隆到pUC18載體(美國皮斯卡塔韋市的GenScript公司產品)上，并 采用RDL (recursive directional ligation，循環定向連接，該方法的細節可參考Meyer 和Chilkoti2002年發表的相關論文)方法在pUC18載體上完成一系列的ELPs的聚合， 直至得到類彈性蛋白標簽ELP[V5-80]；將重組載體pET32a-tt412-SFI和類彈性蛋白標簽 ELP [V5-SO]相連接，形成乳糖酶融合表達載體pET32a-tt412-ELP [V5-SO]。上述載體構建過 程如圖1所示，RDL方法合成ELPs聚合物的原理如圖2所示。步驟2 構建好的表達載體電擊轉化大腸桿菌表達菌株BLR(DE3)(美國麥迪遜市 的Novagen公司產品)，然后鑒定過的轉化子接種到含100ml TB培養基的250ml三角瓶中，200rpm、32°C培養，直至OD6tltl達到0. 8，然后在150rpm、21°C條件下進行自誘導表達65h。上述所用TB培養基可通過以下過程配制配制每升培養基，在900ml去離子水中 加入胰化蛋白胨12g、酵母提取物24g、甘油4ml。搖動容器使溶質完全溶解。然后在121°C 溫度下蒸汽滅菌20min。當溶液冷至60°C或60°C以下時加入IOOml無菌的0. 17M KH2PO4* 0. 72M K2HPO4混合溶液(該混合溶液的配制方法是用90ml去離子水溶解2. 31g KH2PO4和 12. 54g K2HPO4，完全溶解后，用去離子水定容至IOOml并在121°C溫度下蒸汽滅菌20min)。步驟3 :4°C下8000g離心5min收集菌體，菌體用30ml、50mM Tris緩沖液(pH 8. 0) 洗滌一次，放入_80°C冰箱中凍存備用。將菌體室溫解凍后，重懸于5ml、50mM Tris緩沖液 (pH 8. 0)中，細胞懸液用超聲波破碎(條件為:4ff, 2s破碎時間，間隔4s,總時間IOmin)，再 以16000g離心20min以去除細胞碎片等不溶性物質，粗酶液置于4°C冰箱中備用。上述洗滌和重懸菌體所用的緩沖液為50mM Tris緩沖液(pH 8. 0)，該緩沖液可通 過以下過程配制將0. 61g Tris堿溶于50ml去離子水中，得到50ml、0. IM Tris堿溶液。該 溶液中加入29. 2ml 0. IM鹽酸(0. IM鹽酸的配制方法為900ml去離子水中加入86. 2ml質 量百分比為36%的濃鹽酸，加去離子水定容至1L，即配成IM鹽酸。IM鹽酸稀釋10倍，即為 0. IM鹽酸)，混勻后，加水將體積調至IOOml。步驟4 確定乳糖酶粗酶液沉淀的相變溫度。取3份Iml上述制得的的粗酶液，分別加入等體積但濃度不同的(NH4)諷4溶液，使 得粗酶液中(NH4)2SO4的終濃度分別為0. 5Μ、1· 2Μ、2· 0Μ,以2°C為梯度測定從16°C到40°C 時重組蛋白水溶液的0D_。當某個溫度下的OD6tltl達到在60°C重組蛋白水溶液0D_的一半 時，該溫度即為相變溫度Tt。通過上述方法確定粗酶液沉淀的相變溫度為32°C。步驟5 用ITC循環純化乳糖酶重組蛋白。取Iml步驟3制得的粗酶液，加入等體積的IM(NH4) 2S04溶液，使粗酶液中(NH4) 2S04 的終濃度為0. 5M。在步驟4確定的相變溫度32°C下水浴lOmin，然后于室溫下14000g離心 8min。去除上清，將沉淀重新溶解于冰冷的30mL、50mMTris緩沖液(pH8. 0)中，然后于4°C 下14000g離心15min，以進一步除去不溶性物質。此即為一輪ITC循環。所得上清繼續用 ITC方法進行純化。經過4輪ITC循環后，即可得到純度很高的乳糖酶。ITC方法純化乳糖 酶的過程如圖3所示。經過1-4輪ITC循環處理后的乳糖酶，其得率和純度情況如圖4所 示。經計算，本實施例中乳糖酶總酶活的回收率可達58. 42%左右。蛋白質的純化倍數為 2. 16倍。具體數據如表1所示。本實施例及下面的實施例中，步驟5中乳糖酶酶活的測定方法為將待測的乳糖 酶酶液稀釋 100 倍后，取 100 μ 1，加入到 400 μ 1 0. 25% 的 ONPG (Ο-Nitrophenyl-β-D-gala ctopyranosidhONPG，鄰硝基苯酚- β -D-半乳糖苷)溶液中，46°C恒溫水浴中放置15min， 加入500μ1 10% Na2CO3溶液終止反應，在OD4tl5比色并計算酶活力。在上述條件下，乳糖 酶每分鐘水解ONPG產生1 μ mol鄰硝基苯酚所需酶量為一個酶活單位(U)。表1經4輪ITC循環處理后的重組乳糖酶的純化情況
權利要求
一種利用類彈性蛋白標簽純化重組乳糖酶的方法，其特征是包括以下步驟(1)將乳糖酶基因和類彈性蛋白標簽ELP[V5 80]依次連接到原核表達載體pET 32a(+)上，構建成乳糖酶融合表達載體pET32a 乳糖酶基因 ELP[V5 80]；(2)構建好的表達載體電擊轉化大腸桿菌表達菌株，然后鑒定過的陽性轉化子進行自誘導表達50 80小時；(3)收集菌體，用超聲波破碎，離心去除不溶性物質，得到可溶性細胞裂解液即粗酶液，置于4℃冰箱備用；(4)確定乳糖酶粗酶液沉淀的相變溫度(Tt)；(5)用ITC循環方法純化乳糖酶重組蛋白。
2.根據權利要求1所述的純化重組乳糖酶的方法，其特征是所述的乳糖酶基因為來 源于各種微生物的乳糖酶基因，優選乳糖酶基因為tt412;該基因具有SEQ ID N0:1所示的 核苷酸序列，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
3.根據權利要求1所述的純化重組乳糖酶的方法，其特征是所述的大腸桿菌優選的 表達菌株為BLR (DE3)，該菌株是recA-的衍生菌。
4.根據權利要求1所述的純化重組乳糖酶的方法，其特征是，所述的自誘導表達條件 為將轉化子接種到含TB培養基的三角瓶中，150-300rpm、30-37°C培養，直至0D_達到 0. 5-0. 8，然后在150rpm、20-30 °C條件下進行自誘導表達50_80h。
5.根據權利要求1所述的純化重組乳糖酶的方法，其特征是，所述的菌體收集條件為 4-8°C下、6000-10000g 離心 5-lOmin 收集菌體，菌體用 30ml、50mM Tris 緩沖液(pH8. 0)洗 滌一次后，放入-80°C冰箱中凍存備用。
6.根據權利要求1所述的純化重組乳糖酶的方法，其特征是，所述的超聲波破碎條件 為功率4-8W，破碎時間2-4s，破碎間隔4-8s，總時間10_20min。
7.根據權利要求1所述的純化重組乳糖酶的方法，其特征是，所述的相變溫度的測定 過程為取3份Iml的粗酶液，分別加入等體積但濃度不同的(NH4)2SO4溶液，使粗酶液中 (NH4)2SO4的終濃度分別為0. 5-1. 0MU. 0-2. OM和1. 5-3. 0M,以2°C為梯度測定從16°C到 40°C時重組蛋白水溶液的OD6tltl當某個溫度下的OD6tltl達到在60°C重組蛋白水溶液0D_的 一半時，該溫度即為相變溫度Tt。
8.根據權利要求1所述的純化重組乳糖酶的方法，其特征是，通過四輪以上的ITC循 環，得到純度高的乳糖酶。
全文摘要
本發明公開一種利用類彈性蛋白標簽純化重組乳糖酶的方法，包括以下步驟(1)將乳糖酶基因tt412和類彈性蛋白標簽ELP[V5-80]依次連接到原核表達載體pET-32a(+)上，構建成乳糖酶融合表達載體pET32a-tt412-ELP[V5-80]；(2)構建好的表達載體電擊轉化大腸桿菌表達菌株BLR(DE3)，然后將鑒定過的陽性轉化子進行自誘導表達50-80小時；(3)收集菌體，用超聲波破碎，離心去除不溶性物質，得到乳糖酶粗酶液，置于4℃冰箱備用；(4)確定乳糖酶粗酶液沉淀的相變溫度；(5)用ITC方法純化乳糖酶重組蛋白。本發明方法簡單、快速、高效，可用于大規模地分離純化乳糖酶和其它工業酶制劑，在酶制劑生產中具有較高的實際應用價值。
文檔編號C12N9/38GK101955960SQ201010244640
公開日2011年1月26日 申請日期2010年8月3日 優先權日2010年8月3日
發明者余世琴, 劉玉煥, 李剛 申請人:中山大學