提高粘紅酵母對水果采后病害生物防治效力的方法

專利名稱：提高粘紅酵母對水果采后病害生物防治效力的方法
技術領域：
本發明涉及一種粘紅酵母菌種(Rhodotorula glutinis)以及利用殼聚糖 (chitosan)誘導培養提高該菌種對水果采后病害防治效力的方法。
背景技術：
水果在采摘、運銷、儲藏過程中因腐爛造成的損失是巨大的，已成為全球關注的問 題。據報道，發達國家由此造成的損失為10% _25%，而在缺乏冷藏設施的發展中國家則高 達40%-50%，我國水果采后損失為20%-25%左右。2007年3月國家統計局發布的《中華 人民共和國2006年國民經濟和社會發展統計公報》顯示，2006年我國水果總產量達17050 萬噸。據此估算，我國水果采后的損失每年將達到數百億元人民幣的水平。病原微生物侵染造成的腐爛是水果采后損失的主要原因，這些病原微生物主要 有灰葡萄抱(Botrytis cinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stoloniger)、青霉(Penicillium spp·)、毛霉(Mucor spp.)、鏈格抱(Alternaria spp.)禾口曲霉(Aspergillus spp.)等。 病原微生物對采后水果的危害不僅在于其導致水果在數量上造成的嚴重損失，而且由于 許多病原真菌能分泌產生許多次生代謝產物從而引起嚴重的食品安全問題，如擴展青 霉(P. expansum)產生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢(B. cinerea)產生的葡雙醛霉素 (botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐爛的方法是低溫貯藏和化學殺菌劑處理。近年來低 溫貯藏技術在我國得到了廣泛的發展和應用，但已有的冷藏設備往往不能滿足大多數水果 的需要。同時，在低溫條件下仍有相當數量的致病菌能夠在水果上生長，并造成水果腐爛。 而那些對低溫敏感的水果只能在不低于使產品受冷害的溫度下貯藏。長期以來，控制水果采后病害的主要措施是使用殺菌劑。化學殺菌劑對防治病害 可以起到立竿見影的效果，但是，長期和大量的使用，不僅導致病原微生物產生抗藥性，同 時嚴重污染環境，有損于人類健康。美國國家科學院(National Academy of Scinces)的 一份報告顯示，在用于處理食品的全部農藥中，殺菌劑構成60%的致瘤危險。隨著國家經濟發展和消費水平的提高，人們對食品安全和環境保護意識的日益增 強，目前多種化學殺菌劑(如CaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果產品 上限制使用，其直接的后果是目前許多水果采后病害已經沒有殺菌劑能予以控制。因此，各 國科學家都在積極地探索能代替化學殺菌劑的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。 當前國際上對用拮抗微生物進行水果采后病害的生物防治的研究已經取得了階段性的成 果，并認為這是最有希望取代化學殺菌劑的方法之一。隨著酵母分類、生態、生理、生物化學和分子生物學的研究取得進展，人們對果蔬 貯藏中利用酵母的興趣日益提高。國內外的研究表明，許多酵母菌應用于水果表面，可以防 治水果由致病霉菌引起的病害，這些酵母被稱為拮抗酵母。酵母菌遺傳穩定，抑菌譜廣、效 價高，一般不產生對人和寄主植物有害的代謝產物，安全性高，且對營養要求低，生長快，并 對多種脅迫、逆境具有較強的耐受力，對大多數殺菌劑不敏感，對其它化學和物理處理能夠相容。因此近年來拮抗酵母作為水果采后病害生防菌，受到國際上的廣泛關注。其中粘紅 酵母已被證明能有效控制水果采后病害。國外方面，Sansone等從蘋果表面分離得到的粘紅 酵母對由Botrytis cinerea引起的灰霉病有顯著的防治效果，在實驗室條件下，其腐爛率 與對照相比降低了 54%。Calvente等的研究也發現粘紅酵母對水果采后青霉病害有顯著 的抑制效果。國內方面，鄭曉冬等在體外和體內抑菌試驗中研究了粘紅酵母對由指狀青霉 引起的柑桔青霉腐爛的抑制效果，發現粘紅酵母在控制由指狀青霉引起的柑桔腐爛中顯示 出了很高的抑菌活性，在25°C條件下，對照的發病率為100%，而使用IXlO8個/mL的菌懸 液的發病率僅為45%，而且隨著酵母濃度的提高，發病率也有逐漸下降的趨勢。張紅印等研 究了粘紅酵母對草莓采后灰霉病的抑制效果，對草莓進行了前期的預處理后，接種IXlO9 個/mL的菌懸液和1 X IO5個/mL的病原菌孢子菌懸液分別在4°C下貯藏7d和20°C下貯藏 2d后，發現接種粘紅酵母的草莓，其腐爛率與對照相比分別降低了 95%和94. %，。然而大量的研究也表明，粘紅酵母對果實病害的防治效力與化學殺菌劑相比仍有 較大的差距。因此進一步提高粘紅酵母的拮抗效力，是提高其對水果采后病害控制水平，并 將其應用于水果貯藏保鮮的重要策略之一。殼聚糖是β_(1，4)_葡糖胺的多聚體，是幾丁質脫乙酰產物。作為一種可生物降 解的天然物質，殼聚糖不僅資源豐富，而且價格低廉、無毒安全。因其具有眾多獨特的生物 學特性，在食品和水果采后保鮮等領域都有著廣泛的研究和應用。在水果采后保鮮領域，殼聚糖被作為理想的水果涂層，用來延緩果實成熟衰老， 維持水果采后品質。研究表明殼聚糖對多種病原菌有直接的拮抗活性，如，桃果實的 Monilinia fructicola、葡萄果實的 B. cinerea、相禾S果實的 P. digitatum 禾口 P. italicum。近年來，如何將殼聚糖與其它安全的非殺菌劑方法有效整合，以獲得對水果采 后真菌病害更高水平的控制，已成為國際上非常受關注的一個研究熱點。El-Ghaouth 等(2000)報道，采后拮抗酵母Candida saitoana與殼聚糖衍生物聯合處理能對蘋果青 霉病和灰霉病及柑橘綠霉病產生協同增效的控制效果。Yu等(2007)也報道拮抗酵母 C. Iaurentii與殼聚糖聯合處理能對蘋果青霉病產生協同增效的控制效應。但國內外對殼 聚糖培養能否影響采后拮抗酵母生物防治效力尚無相關報道。

發明內容
本發明為了克服上述現有技術中的不足，在培養基中添加不同濃度的殼聚糖，對 粘紅酵母進行誘導培養，提供了一種提高粘紅酵母生物防治效力的方法。經殼聚糖誘導培 養的粘紅酵母，可以明顯地抑制水果病原菌，防止水果采后腐爛。本發明具有安全、高效、成 本低等優點，可以廣泛地用于水果采后病害的生物防治過程中，減少水果采后病害造成的 損失。本發明同時提供了一種利用殼聚糖誘導培養粘紅酵母，進行水果采后病害防治及 貯藏保鮮的方法。步驟如下將粘紅酵母活化，接種到添加有以質量計為0. 01% -1%殼聚 糖的NYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水1000ml，pH自然)培養基中進行誘 導培養，離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成IX IO6個/mL-1 X IO9個/mL的菌懸液； 將水果放入菌懸液中，浸泡30s后馬上取出，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放 在室溫或冷藏條件下存放。
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本發明利用殼聚糖誘導培養粘紅酵母進行水果采后病害防治及貯藏保鮮的方法。 適合于梨果、桃果、草莓、蘋果的采后病害防治及貯藏保鮮通過借助以下實施實例將更加詳細的說明本發明。以下實施例僅是說明性的，本 發明并不受這些實施實例的限制。


圖1為不同濃度殼聚糖誘導后的粘紅酵母對草莓灰霉病的抑制效果，注CK:對 照；0 =NYDB ；0. 01-1 添加0. 01% 殼聚糖的培養基。發病率及病斑直徑是20°C放置3d 后測定的結果。不同字母代表差異顯著性(P = 0. 05)。圖2不同濃度殼聚糖誘導后的粘紅酵母對草莓根霉病的抑制效果，注CK 對照； 0 =NYDB ；0. 01-1 添加0.01%-1%殼聚糖的培養基.20°C放置3d后測定的結果。不同字母 代表差異顯著性(P = 0. 05)。圖3不同濃度殼聚糖誘導后的粘紅酵母對桃青霉病的抑制效果，注CK 對照；0 NYDB ；0. 01-1 添加0. 01% 殼聚糖的培養基.25°C放置測定的結果。不同字母代表差 異顯著性(P = 0. 05)。圖4不同濃度殼聚糖誘導后的粘紅酵母對桃灰霉病的抑制效果，注CK 對照；0 NYDB ；0. 01-1 添加0. 01% 殼聚糖的培養基.25°C放置測定的結果。不同字母代表差 異顯著性(P = 0. 05)。病斑直徑在第6d測定。圖5不同濃度殼聚糖誘導后的粘紅酵母對桃根霉病的抑制效果，注CK 對照；0 NYDB ；0. 01-1 添加0.01%-1%殼聚糖的培養基.25°C放置3d后測定的結果。不同字母代 表差異顯著性(P = 0. 05)。
具體實施例方式在本發明的具體實施方式
中如無特殊說明，所有添加量的百分比，均以質量計，下 面對此不再贅述。粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)，于NYDA (NYDB培養基的基礎上添加以質量計 為2%的瓊脂)培養基4°C低溫保存。培養程序為(1)固體活化將粘紅酵母接種于NYDA 培養基中，在28°C培養48h ； (2)液體培養在250ml的三角瓶中裝入50ml的NYDB種子培養 基，用接種環接入一環活化好的粘紅酵母，在200rpm，28°C條件下培養20h ； (3)誘導培養 將上述培養混合物7000 Xg條件下離心lOmin，無菌蒸餾水洗滌兩次，以去除培養介質，并 用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細胞，血球記數板調節細胞濃度為5 X IO8個/mL。在250ml的 三角瓶中分別裝入50ml NYDB培養基或殼聚糖補充培養基(在NYDB中添加0. Ol%、0. 1%, 0.25%、0.5%及殼聚糖)，并加入上述濃度的酵母細培養液Iml，然后在200rpm，28 °C條 件下培養24h ;(4)離心分離再懸浮上述不同處理酵母培養混合物在7000Xg條件下，離 心10-15min，并用無菌蒸餾水洗滌2次，以去除培養介質，用無菌蒸餾水重新再懸浮，并用 血球計數板調節酵母細胞濃度為1 X IO9個/mL，再用滅過菌的生理鹽水稀釋到所需濃度。實施例1 殼聚糖誘導培養粘紅酵母對水果病害的抑制效果一、試驗方案水果處理后，用消過毒的打孔器在每個果實表面赤道部位形成統一大小和深度的傷口。其中草莓的表面傷口為3mm(直徑)X3mm(深)，桃果的表面傷口為5mm(直 徑)X 3mm(深)。每個傷口處等量加入30 μ 1(1)經NYDB培養基培養的酵母懸浮液；(2)經殼 聚糖補充培養基(NYDB+chitosan)培養的酵母懸浮液；(3)無菌水(作為對照)。2h后，在每 個傷口處加入等量30 μ 1的病原菌孢子(B. Cinerea濃度為IX IO5SporeS πιΓ1 ；P. expansum 濃度為5X104spores/mL，R. stolonifer濃度為1 X 104spores/mL)。自然晾干后，將果實放 入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫培養箱中培養(水分活度95% )，草莓置于20°C，桃果置于 25 °C。每處理重復3次，每個重復18個果實。整個試驗重復2次。經過若干天的培養，用 游標卡尺測定水果病斑，記錄病斑直徑并計算發病率，以此評價R. glutinis的抑菌效果。 發病率的計算公式如下發病率(％ ) =Σ發病的果實/接種病原菌的果實總數X100%二、試驗結果按照上述步驟試驗，后統計水果的腐爛率結果如下1. 1對草莓灰霉病及根霉病的抑制效果粘紅酵母經殼聚糖誘導培養后，其對灰葡萄孢在草莓傷口處的侵染抑制作用顯著 增強(說明書附1、圖2)，尤其當誘導量為0. 5 %時，酵母菌懸液處理草莓后其灰霉病的 發病率僅為對照的37%，為未經殼聚糖處理的43%。且當殼聚糖添加量在0.01-0. 5%的范 圍內，對灰霉病的抑制作用呈直線遞增趨勢。粘紅酵母對葡枝根霉在草莓傷口處的侵染抑 制作用也出現了類似的結果。1.2對桃果青霉病、灰霉病及根霉病的抑制效果如說明書附3所示，添加0. 5%殼聚糖誘導培養后的粘紅酵母，對桃果傷口青 霉病侵染的抑制效力顯著增強，主要表現在整個試驗階段桃果青霉病發生率均顯著低于經 NYDB培養基培養的粘紅酵母處理的桃果。在對桃果傷口灰霉病及根霉病的抑制作用上也出 現了類似的結果(說明書附4，說明書附5)。試驗結果表明通過添加殼聚糖誘導培養能顯著提高粘紅酵母對草莓及桃果由灰 葡萄孢、葡枝根霉及擴展青霉引起的病害的控制效力，最佳誘導量為0. 5%。實施例2 殼聚糖誘導培養粘紅酵母對水果自然腐爛及貯藏品質的影響一、試驗方案試驗水果采摘后直接用以下處理浸泡果實30s (I)NYDB培養基培養的粘紅酵母 懸浮液；(2)殼聚糖補充培養基(NYDB+chitosan)培養的的酵母懸浮液；(3)無菌水(作為 對照)。然后將果實放在塑料筐內，風干后用保鮮膜密封。草莓貯藏于4°C冰柜，20d后轉 入20°C恒溫箱貯藏，7d后觀察果實腐爛情況，計算腐爛率；桃果貯藏于4°C冰柜，30d后轉入 250C，7d后觀察果實腐爛情況，計算腐爛率，并進行貯藏品質分析。每處理重復3次，每次重 復10個果實，整個試驗重復2次。貯藏品質分析方法如下(1)硬度采用TA_XT2i質構分析儀測試，探頭直徑為5mm，探頭測試前、測試中、測 試后的運行速度分別為4. Omm s^U.Omm ^T1J. Omm S、草莓測試深度為6mm，桃果及梨果測 試深度為10mm，探頭插入水果時所受的最大阻力(單位為牛頓)就被定義為水果的硬度。 每個水果繞赤道處每120°測定3次。
(2)總可溶性固形物采用WYT(0_80% )手持糖量計進行測定，測定結果表示為 g/100g 樣品。(3)維生素C含量的測定紫外快速測定法。從6個水果上取20g果肉樣品加20ml 鹽酸勻漿，50ml容量瓶定容至刻度。10000Xg，4°C條件下離心lOmim，上清用于測定。
取0. 4ml提取液，放入盛有0. 8ml 10% HCl的IOml刻度試管中，用蒸餾水稀釋至刻度后搖 勻。以蒸餾水為空白，在243nm處測定吸光度。另吸取0. 4ml提取液，分別加入4ml蒸餾水 和1. 6ml Imoir1NaOH溶液至IOml至刻度試管，搖勻，靜置15min后。加入1. 6ml 10% HCl， 混勻，加蒸餾水定容至刻度。以蒸餾水為空白，在243nm處測定吸光度。由待測液及堿處理 待測液的A243值之差，查標準曲線，計算樣品中維生素C的含量。每處理3次重復。(4)褐變度6個水果稱取20g果肉組織，加入40ml蒸餾水勻漿，10000Xg，4°C條 件下離心lOmim，取上清IOml加入95%乙醇15ml 10000 X g，4°C條件下離心lOmim，取上清 液于420nm測定吸光度值，以此表示褐變程度。每處理3次重復。二、試驗結果按照上述步驟試驗，統計草莓及桃果的自然腐爛率及貯藏品質的影響結果如下表1殼聚糖誘導后的粘紅酵母對草莓自然腐爛率及儲藏品質的影響 備注0 =NYDB培養基培養的粘紅酵母；0. 5 添加0. 5 %的殼聚糖誘導培養的粘紅 酵母。上述表中的發病率和品質測定時在4°C放置20d后轉入20°C放置7d后測定的結果。 不同字母代表差異顯著性(P = 0. 05)。如表1所示，粘紅酵母經0. 5%殼聚糖誘導培養后，對草莓自然腐爛的抑制作用顯 著，草莓的腐爛率僅為對照的47%，且顯著地低于未經誘導培養的粘紅酵母處理的草莓的 腐爛率。與未誘導培養的粘紅酵母相比，經0.5%殼聚糖誘導培養的粘紅酵母對草莓的硬 度、可溶性固形物、Vc含量、褐變度均不產生有害影響。表2殼聚糖誘導后的粘紅酵母對桃果整果儲藏品質的影響 注0 =NYDB培養基培養的粘紅酵母；0. 5 添加0. 5%的殼聚糖誘導培養的粘紅酵 母。上述表中的發病率和品質測定時在4°C放置30d后轉入20°C放置7d后測定的結果。不同字母代表差異顯著性(P = 0. 05)。0.5%殼聚糖誘導培養粘紅酵母，對桃果自然腐爛的抑制作用顯著，其處理的桃果 自然腐爛率約為未經殼聚糖誘導培養的R. glutinis處理的桃果腐爛率的55%。同時，經 0.5%殼聚糖誘導培養粘紅酵母處理的桃果，其可溶性固形物含量及褐變度與對照桃果相 比，無顯著差異，其硬度及Vc含量顯著增加，對各項品質指標均不產生有害影響(表2)。以上試驗結果表明殼聚糖誘導培養后粘紅酵母對草莓及桃果自然腐爛病害的發 生有顯著的抑制作用，并且對水果貯藏品質沒有產生不利影響。
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權利要求
提高粘紅酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于步驟如下將粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)活化，接種到添加有以質量計0.01％ 1％殼聚糖的NYDB培養基中進行誘導培養，離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成1×106個/mL 1×109個/mL的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡30s后馬上取出，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。
2.權利要求1所述提高粘紅酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其 中所述的NYDB培養基組成為酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水IOOOml，pH自然。
3.權利要求1所述提高粘紅酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其 中所述的水果為梨果、桃果、草莓或蘋果。
全文摘要
本發明公開了提高粘紅酵母對水果采后病害生物防治效力的方法。將粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)活化，接種到添加有0.01％-1％殼聚糖的NYDB(酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水1000ml，pH自然)培養基中進行誘導培養，離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成1×106個/mL-1×109個/mL的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡30s后馬上取出，自然風干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫或冷藏條件下存放。本發明使用殼聚糖誘導培養后的粘紅酵母可以代替化學殺菌劑防治水果采后病害，避免使用化學殺菌劑對人的危害，具有顯著的經濟效益和社會效益。
文檔編號A23B7/155GK101911968SQ201010240638
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月29日 優先權日2010年7月29日
發明者任曉鋒, 張紅印, 葛玲玲, 陳克平 申請人:江蘇大學