專利名稱：多重pcr檢測食品中肉類來源的引物組及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，涉及多重PCR檢測食品中肉類來源的引物組 及檢測試劑盒。
背景技術：
目前的肉制品市場中，一些單位和個人為了追求自身利益而以雞肉充豬肉，以豬 肉充牛肉等，用低價劣質的肉冒充高價優質的肉，這極大的損壞了消費者的利益和健康。由 于國家沒有規定統一的肉類檢測方法，也沒有形成成熟、快速簡便的檢測肉類來源的行業 方法，目前質監部門主要是通過肉制品的味道、色澤、肉類的紋理等進行肉類來源的判別工 作，這些傳統鑒別方法對于市場上假冒生肉的鑒別起到了非常重要的作用。但是，對于很多 熟肉制品(如香腸)來說，加入的肉經過了粉碎處理，并且添加了香料掩蓋了原有的味道， 傳統的方法難以進行準確的肉類來源鑒定。目前，市場上經過加工的熟肉制品質量越來越難以鑒定，國家及地方各級質監部 門急需要一種分析食品中的肉類來源的方法能夠快速，有效的對肉類開源進行檢測。分析 食品中的肉類來源的方法主要有兩種應用抗體特異性的ELISA法和基于核酸特異性的 PCR法。由于肉制品加工過程中蛋白質容易變性，導致ELISA法鑒定肉類來源的穩定性較 差，容易出現偏差，且檢測步驟復雜，時間長，不利推廣。而PCR方法基于核酸的特異性，不 受高溫的影響。食品的肉類中含有大量的核酸分子，通過合成種屬特異的引物并進行PCR， 可以靈敏，快速的確定肉質中的肉類來源，如果找到一種能同時檢測熟肉制品多種來源肉 的種類，將可以大大縮短了檢測的時間，提高了檢測的效率，更利于應用于實際。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術存在的不足，提供一種多重PCR檢測食品中肉類來 源的引物組。本發明的第二個目的是提供一種多重PCR檢測食品中肉類來源的試劑盒。本發明的技術方案概述如下一種多重PCR檢測食品中肉類來源的引物組，由檢測豬肉引物對、檢測雞肉引物 對、檢測牛肉引物對和檢測羊肉引物對組成，所述檢測豬肉引物對的上下游引物分別是序 列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述檢測雞肉引物對的上下游引物 分別是序列表中SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，所述檢測牛肉引物對的上 下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述檢測羊肉引 物對的上下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。一種多重PCR檢測食品中肉類來源的試劑盒，該試劑盒包括引物組、PCR管和 2XTaq PCR反應混合試劑，所述引物組由檢測豬肉引物對、檢測雞肉引物對、檢測牛肉引 物對和檢測羊肉引物對組成，所述檢測豬肉引物對的上下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 1、SEQ IDN0. 2所示的核苷酸序列，所述檢測雞肉引物對的上下游引物分別是序列表中
3SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，所述檢測牛肉引物對的上下游引物分別是 序列表中SEQ IDN0.5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述檢測羊肉引物對的上下游引物 分別是序列表中SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。本發明的引物組可以應用于多重PCR技術檢測食品中肉類來源。本發明的試劑盒 可以靈敏，快速地確定熟肉制品中的肉類來源，多重PCR方法更是縮短了檢測的時間，提高 了檢測的效率，將多重PCR方法應用于食品檢測領域。
圖1應用多重PCR進行肉類來源分析的瓊脂糖電泳圖。圖中第1泳道是marker，第2條泳道是四重PCR結果，第3，4，5，6泳道分別是豬， 牛，羊，雞的單重PCR結果。
圖2應用多重PCR進行市場中香腸肉類來源分析的瓊脂糖電泳圖。 圖中第 1 泳道是 DNAmarker (100bp, 250bp, 500bp, 750bp, 1000bp, 2000bp)，第 2，3，4，5 泳道分別是豬，牛，羊，雞的單重PCR結果，第6泳道是牛肉腸A的多重PCR檢測結果，第7 泳道是牛肉腸B的多重PCR檢測結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1本發明是對于食品中肉類來源的檢測，通過PCR反應擴增出來的產物長度分別為 豬136bp，牛705bp，羊199bp，雞327bp。一.肉制品中DNA的提取樣品處理將等質量的豬、牛、羊和雞肉組織樣品研充分磨備用。總DNA的提取取30mg樣品用200 μ 1 TE懸浮，加入400 μ 1裂解液(5mol/L CuSCN ；0. 05mol/L Tris-HCl，ρΗ6· 4 ；0. 02mol/L EDTA，pH8. 0 ；1. 3% TritonX-100)，70°C溫 浴10分鐘，加等量氯仿混勻，離心(10000r/min，5min)，取上層水相，加等量冰乙醇-20°C沉 淀10分鐘，離心(lOOOOr/min，5min)，棄上清，用70%乙醇洗滌一次，晾干，用50 μ ITE溶解 沉淀；-20°C下保存待用。二.引物的篩選和驗證首先，從GENEBANK查找獲得相應的基因序列，針對要進行多重PCR反應的模板序 列進行基因比對，找到特異性序列；然后，將特異性序列進行比對搜索，以確定該序列在所 有物種中的特異性，避免序列出現重復現象，對選定序列兩端進行微調，以確定最佳序列； 其次，設計不同物種的PCR長度，至少相差50bp，從而確定上下游的引物序列，并保證所有 引物的Tm值大致相同；最后用Primer軟件進行分析，并微調引物序列，以確定引物之間沒 有過多的配對，沒有二聚體。1.引物篩選結果豬5-ACTACTCATACCCAGCAAGC-3 (序列表中 SEQ ID NO. 1 所示)5-TAAGGTGACAATAGGTAGTCCT-3 (序列表中 SEQ ID N0. 2 所示)雞5-TCCTCACTACTGTCATCTT-3 (序列表中 SEQ ID N0. 3 所示)
5-CTGGAAGAAGGAGTGATGGG-3 (序列表中 SEQ ID NO. 4 所示)牛5-AAGCAATCGCTTTGTAACCC-3 (序列表中 SEQ ID NO. 5 所示)5-CCAATTATTAGCAGGGTCATTG-3 (序列表中 SEQ ID NO. 6 所示)綿羊5-CTGACCCCCTATATAAACCT-3 (序列表中 SEQ ID NO. 7 所示)5-GTAAGGTTGTACTAATGAGGATC-3 (序列表中 SEQ ID NO. 8 所示)2.引物特異性驗證分別提取豬、牛、羊、雞肉制品的總DNA，將豬肉制品的總DNA、牛肉制品的總DNA、 羊肉制品的總DNA和雞肉制品的總DNA各1μ 1分別加入到50μ 1的PCR管中，再在每個PCR 管中加入濃度為ΙΟμπιοΙ/L的步驟1獲得的四種上下游引物各1 μ 1，然后加入12. 5μ 1的 2 X TaqPCR反應混合試劑后加3. 5 μ 1無離子H2O至25 μ 1體系。將此PCR體系在5000轉 /分條件下離心30s。將反應體系放入PCR儀中，設定變性、退火和延伸時間和溫度。PCR檢測方法的循環參數
反應變性 退火術口循環數第-一個反應94 0C, 3min1第:二個反應94°C, 30s 60°C，30s72 "C, Imin30第:Ξ個反應72 "C ’ 5min1反應完畢后將PCR產物取出，在4°C下短期保存，備用。3.多重PCR反應提取含有豬、牛、羊、雞四種肉的混合肉制品的總DNA，取4μ1加入50μ1 PCR管 中，再各取濃度為ΙΟμπιοΙ/L的步驟1制備的四種上下游引物各Iy 1加入同一 PCR管，然 后加入12. 5 μ 1的2 X Taq PCR反應混合試劑后加0. 5 μ 1無離子H2O至25 μ 1體系。將此 PCR體系在5000轉/分條件下離心30s。將反應體系放入PCR儀中，設定變性、退火和延伸 時間和溫度。PCR檢測方法的循環參數
反應變性 退火Φ入 水口循環數第--個反應940C, 3min1第二二個反應94°C, 30s 60°C, 30s72 °C，Imin30第三三個反應72°C, 5min1反應完畢后將PCR產物取出，在4°C下短期保存，備用。此步驟用時約90分鐘。三.PCR產物的電泳分析 PCR產物檢測可以用電泳法或者序列分析法。序列分析法可精確得到擴增序列，但 此方法要有專門的技術設備，不適合推廣；而電泳的方法簡單易操作，在不需要準確得到擴 增序列的情況下，普遍用于PCR產物的檢測。此方法可根據實驗情況靈活掌握實驗條件，
5比如以下即為一種檢測PCR產物的具體操作。將已配置的1. 5%瓊脂糖凝膠加熱溶解，使溶液澄清透亮。在50°C左右將溶液倒 入插好梳子的凝膠灌制模具中，約0. 3 0. 4cm厚。靜置，待凝膠完全凝固。電泳槽中加滿0. 5XTBE電泳緩沖液。凝膠完全凝固后，小心拔出梳子，將模具取 出，連同凝膠一起放入電泳槽中間的平板上，凝膠要沒入電泳液中。凝膠上有樣品孔的一側 要朝向電泳槽負極。取PCR的產物10 12 μ 1放入100 μ 1無菌離心管中，另加入2 3 μ 1 6 X loading buffer。輕敲管底部，使混合均勻。吸取6 μ 1混合好的樣品加入凝膠加樣孔 中。另吸取DNA marker (標準分子)加入相鄰的樣品孔中。恒壓電泳，使PCR產物在瓊脂 板上展開。將已形成譜帶的瓊脂放入EB (溴化乙啶)染色液中染色20 40分鐘，將凝膠取出 放入紫外光下觀察。見圖 1，圖中 Lane 1. DNA marker (lOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp)Lane 2.豬，牛，羊，雞的四重PCR結果，Lane 3.豬的單重PCR結果Lane 4.牛的單 重PCR結果，Lane 5.羊的單重PCR結果，Lane 6.雞的單重PCR結果。此步驟用時約70 100分鐘。實施例2一種多重PCR檢測食品中肉類來源的的試劑盒，該試劑盒包括引物組、PCR管和 2XTaqPCR反應混合試劑，所述引物組由檢測豬肉引物對、檢測雞肉引物對、檢測牛肉引 物對和檢測羊肉引物對組成，所述檢測豬肉引物對的上下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述檢測雞肉引物對的上下游引物分別是序列表中 SEQ IDN0.3、SEQ IDN0. 4所示的核苷酸序列，所述檢測牛肉引物對的上下游引物分別是序 列表中SEQ ID N0. 5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述檢測羊肉引物對的上下游引物 分別是序列表中SEQ ID N0. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。實施例3一種多重PCR檢測食品中肉類來源的的試劑盒的應用樣品DNA提取、PCR及電泳方法與實施例1相同。 將多重PCR應用于市場熟肉制品的檢測，從市場中購買各種熟肉制品，并記錄其 標簽所標識的肉質種類，提取總DNA，進行多重PCR反應，檢測其中的真實組分。用本發明的試劑盒對于市場中獲取的30組樣品進行了檢測，其中28個是合格產 品，但有兩組的多重PCR檢測結果與食品標簽有所不同，如圖2所示，一個在標簽上注明是A 品牌牛肉腸，實際的檢測結果是牛肉與豬肉的混合產品；另一個注明的是B品牌牛肉腸，多 重PCR的結果是豬肉，牛肉，雞肉的混合。圖2中，Lane 1. DNA marker (100bp, 250bp, 500bp, 750bp, 1000bp,2000bp) ；Lane 2.豬的單重 PCR 反應；Lane 3.牛的單重 PCR 反應；Lane4. 羊的單重PCR反應；Lane 5.雞的單重PCR反應；Lane 6.牛肉腸A的多重PCR檢測結果； Lane 7.牛肉腸B的多重PCR檢測結果。本發明的方法應用于食品檢測將具有廣闊的前景。
權利要求
一種多重PCR檢測食品中肉類來源的引物組，其特征是由檢測豬肉引物對、檢測雞肉引物對、檢測牛肉引物對和檢測羊肉引物對組成，所述檢測豬肉引物對的上下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述檢測雞肉引物對的上下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列，所述檢測牛肉引物對的上下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述檢測羊肉引物對的上下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列。
2.一種多重PCR檢測食品中肉類來源的的試劑盒，其特征是該試劑盒包括引物組、PCR 管和2XTaq PCR反應混合試劑，所述引物組由檢測豬肉引物對、檢測雞肉引物對、檢測牛 肉引物對和檢測羊肉引物對組成，所述檢測豬肉引物對的上下游引物分別是序列表中SEQ IDNO. USEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，所述檢測雞肉引物對的上下游引物分別是序列表 中SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，所述檢測牛肉引物對的上下游引物分別 是序列表中SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示的核苷酸序列，所述檢測羊肉引物對的上下游 引物分別是序列表中SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種多重PCR檢測食品中肉類來源的引物組及試劑盒，多重PCR檢測食品中肉類來源的引物組，由檢測豬肉引物對、檢測雞肉引物對、檢測牛肉引物對和檢測羊肉引物對組成，本發明的引物組可以應用于多重PCR技術檢測食品中肉類來源。本發明的試劑盒可以靈敏，快速地確定熟肉制品中的肉類來源，多重PCR方法更是縮短了檢測的時間，提高了檢測的效率，將多重PCR方法應用于食品檢測領域。
文檔編號C12N15/11GK101962675SQ201010239180
公開日2011年2月2日 申請日期2010年7月29日 優先權日2010年7月29日
發明者喬建軍, 關叢笑, 孫艷華, 張智禹 申請人:天津大學