專利名稱：轉人app雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型的建立和應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫學領域，轉人APP雙突變基因癡呆癥小鼠模型(PDGF_hAPPV652I/ K596N/M597)是用于研究阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的發病機理、藥物和疫苗研 發的動物模型。
背景技術：
阿爾茨海默病(Alzheimer，s disease,AD)是一種常見的中樞神經系統退行性變 性疾病，主要臨床表現為進行性記憶減退和認知障礙，認知功能障礙和思維遲鈍，且進行性 加重，是老年人群中最常見的一種癡呆癥疾病，其患者占全部癡呆癥病例的50% -70%。AD 的發病率和患病率均隨年齡增加呈指數增加。根據聯合國提供的數字，全球約有5000多萬 的老年人患有ADjIj 2050年這個數字預計將翻兩番。目前，中國60歲以上的老人占中國人 口總數的14%，且AD患者在65歲以上老年人中發病率為5% 10%。隨著現代醫學的發 展和人口老年化趨勢的加重，AD困擾著許多老年人，帶來了嚴重的社會經濟和家庭問題。AD的主要神經病理學特征為過度的細胞外β淀粉樣蛋白(amyloid-β protein， Αβ)沉淀、細胞內神經纖維纏結增多、Tau蛋白的過度磷酸化、突觸密度減少、神經元細胞 減少等。為了更加深入的探究AD的發病機制，研究人員建立了一系列的模型動物作為研究 工具。淀粉樣蛋白前體蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)在AD發病機制中起重要 作用，APP經過剪切加工后的Αβ是AD患者腦內老年斑的主要成分，而點突變的APP則是 早發性 AD(Early onset of familial Alzheimer' s disease, FAD)的主要原因。目前國內外已經建立了多種APP突變型轉基因小鼠模型，如PDAPP轉基因小鼠模 型、APP23轉基因小鼠模型等，但是大多數模型出現病理及行為學改變的時間比較滯后，通 常在六月齡以后才出現上述改變。因此，一種出現病癥快，并且臨床和病理特征更接近于老 年癡呆病人，高效的轉基因動物模型亟待研發。
發明內容
鑒于以上問題，本發明的主要目的是建立一種用于研究阿爾茨海默病 (Alzheimer' s disease, AD)的小鼠動物模型，轉人APP雙突變基因小鼠，用于老年癡呆疾 病藥物和疫苗開發及其發病機理的研究。本發明提供的轉人APP雙突變基因小鼠模型作為研究人老年癡呆癥的發病機理、 藥物和疫苗研發的工具所述的老年癡呆癥是指阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)，是淀粉樣前體 蛋白(Amyloid Precursor Protein, APP)的降解過程發生異常引起Aβ (腦內老年斑的主 要成分)的生成增加、清除減少，最后導致腦組織內Αβ的積聚；所述轉人APP雙突變基因小鼠模型包括人APP基因變點ΑΡΡ695 _9\ PDGF-APPV652iA596_97雙突變轉基因載體質粒和小鼠模型；所述APP基因第一突變位于膜內區的第595及596位點(按ΑΡΡ695計算)的氨
3基酸同時發生了賴氨酸_天門冬酰胺與蛋氨酸_亮氨酸的突變，此位點距A β的第1位氨 基酸(即β分泌酶酶切位點)僅1-2個氨基酸。該突變帶來的蛋白構象變化使得APP蛋 白更容易被β分泌酶切割；所述APP基因第二突變位于跨膜區內第642位點(按ΑΡΡ695計算)的氨基酸發 生纈氨酸(Val)-異亮氨酸(Ile)突變，此位點距A β的第42位氨基酸(即、分泌酶酶切 位點)僅4個氨基酸。該突變帶來的蛋白構象變化使得APP蛋白更容易被γ分泌酶切割；本發明提供的APP雙突變基因小鼠模型的鑒定是通過分子生物學PCR、Western Blot免疫印跡、病理學、行為學方法。本發明所述APP雙突變基因小鼠模型的特點具備人老年癡呆疾病的臨床特點和 病理變化。該小鼠模型在三月齡時即表達Αβ (腦內老年斑的主要成分)、五月齡開始出現 Αβ在神經元內的積累和早期老年斑、在三月齡時就出現了學習記憶障礙等。該模型與其它 老年癡呆動物模型比較，具有發病早、臨床和病理特征明顯的特點。
圖1為本發明APP轉基因的質粒構建圖。圖2為本發明PCR鑒定APP轉基因動物的凝膠電泳分析圖。圖3Α為APP轉基因小鼠抗人A β 1-17單抗免疫組化染色(X 200)-野生小鼠腦組 織；圖3Β APP轉基因小鼠抗人Αβ 1-17單抗免疫組化染色(Χ200)-三月齡單突變 APP695V6421轉基因小鼠腦組織；圖3C為APP轉基因小鼠抗人A β 1-17單抗免疫組化染色(X 200)-三月齡雙突變
App695V642I/K595N/M596L轉基因小鼠腦組織。圖4A為APP轉基因小鼠抗人A β 1-17單抗免疫組化染色(X 200)-五月齡單突變 APP695V6421轉基因小鼠腦組織；圖4B為APP轉基因小鼠抗人A β 1-17單抗免疫組化染色(X 200)-五月齡雙突變
App695V642I/K595N/M596L轉基因小鼠腦組織；圖4C為APP轉基因小鼠抗人Αβ 1_17單抗免疫組化染色(Χ200)-齡雙突變
App695V642I/K595N/M596L轉基因小鼠腦組織。圖5A為本發明隱蔽平臺水迷宮實驗APP轉基因小鼠學習和認知分析圖_單突變 APPv6521轉基因；圖5B為本發明隱蔽平臺水迷宮實驗APP轉基因小鼠學習和認知分析圖-野生小 鼠；圖5C為本發明隱蔽平臺水迷宮實驗APP轉基因小鼠學習和認知分析圖-APPV652I/ K596N/M597L轉基因小鼠。
具體實施例方式以下結合具體實施步驟及附圖對本發明的技術方案進行進一步說明實施例1 :APP雙突變轉基因載體及小鼠的制備、模型鑒定1、APP雙突變轉基因載體及小鼠的制備
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將APP雙突變基因插入到PDGF啟動子下游，構建轉基因表達載體(如圖1)。通 過簡單的顯微注射操作建立APP695v—轉基因C57BL/6J小鼠。靶基因信息Human
App695V642I/K595N/M596L突變體，對應于仲打川趴7^ /·“構建信息 1、小鼠模型的PCR法鑒定1)剪取0. 5-lcm鼠尾置于EP管，加入0. 5ml鼠尾裂解液，再加入20mg/ml蛋白酶 K 10 μ 1，55°C振搖過夜；2)次日，加入300 μ 1飽和氯化鈉，冰上靜置15ming，13000rpm離心15min ；3)取上清600 μ 1，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，直至有絮狀沉淀出現，13000rpm 離心15min ；4)用70 %乙醇洗滌沉淀一次，晾干沉淀約30min但不能干透；5)沉淀溶于200 μ 1 TE中，55 °C 2小時將DNA完全溶解；6) PCR (聚合酶鏈反應)體系IOX PCR Buffer (緩沖液) 2 μ 1MgCL2 (25mM)1 μ 1dNTP mixture (IOmM,底物) 0. 4 μ 1上游引物(50μ Μ)0· 2 μ 1下游引物(50μ Μ)0· 2 μ 1Template cDNA (模板)1 μ 1Taq DNA Polymerase (聚合酶)0. 2μ 1ddH2015 μ 1_總體積20 μ 1(上游引物 5，CTAGTTCTGCATCTGCTCAAAG3，、下游引物 5，GACTCTGTGCCAGCCAACAC 3，)7)PCR產物電泳結果(1. DNA 2，OOOMarker ；2.陽性對照；4.首建鼠18 ；6.首建鼠31 ；7.首建鼠36 ；10.首建鼠37 ；其他泳道為轉基因陰性鼠)如圖2。2、小鼠模型免疫印跡法鑒定1)脫頸椎法犧牲小鼠，將1/4鼠腦通過處理，提取組織蛋白并測定總蛋白濃度；2)將蛋白變性，并通過電泳，將蛋白轉移在SDS-PAGE凝膠上，然后進一步轉到硝 酸纖維素膜上；3)將硝酸纖維素膜用抗A β 1-17單抗、二抗雜交，用ECL化學發光試劑盒，檢測人 APP蛋白在腦組織中的表達；4)免疫印跡結果顯示小鼠模型建立正常。3、小鼠模型腦內老年斑Αβ的形成與積聚1)固定腦，石蠟切片，常規脫蠟；2)抗原修復取一定量的0. OlM檸檬酸鹽緩沖液(ρΗ6. 0)于微波盒中，微波加熱至沸騰；將脫蠟水化后的組織切片置于沸騰的緩沖液中，中高檔繼續處理lOmin，使溫度維 持在92 °C -98 °C (高火3min，中高火7min)；3)免疫組織化學染色(抗人A β 1-17的單抗6E10 (PBS 1 200稀釋)、羊抗小鼠 IgG抗體-HRP多聚體)；4)在顯微鏡下觀察。發現在三月齡時雙突變APPv652vk596nai597l轉基因小鼠海馬區神 經元出現了棕黃色的陽性信號，說明已經開始表達Αβ。而同月齡的單突變APPv6521轉基因 小鼠和野生小鼠都未檢測到A β的表達。即雙突變APPv652—/M597L轉基因小鼠海馬區神經 元內Αβ 1-17表達明顯早于同月齡的單突變APPv6521轉基因小鼠，在形態學上證明了轉入的 人APP基因的高表達。五月齡時在雙突變ΑΡΡν652 Λ596ΝΛβ97 轉基因小鼠腦內檢測到早期老年 斑，而單突變APPv6521轉基因小鼠一般在9-12個月才出現老年斑(見圖3)。4、小鼠模型的行為學檢測，評價動物的認知和記憶力水平1)設備直徑1. O米，高0. 47米的圓形鐵皮水池，內壁及盆底貼上乳白色無味防 水貼，在實驗過程中加入25cm深的水(水溫24-25°C)，肉眼看不清水下平臺。平臺為一直 徑為9cm的玻璃杯。在實驗過程中平臺位于水面下0.5cm處。在探索實驗中，平臺被拿走。 水迷宮水池放在一個3X4m的房間內，在整個水迷宮實驗過程中，房間內裝置及物品的擺 放要一致，兩個實驗員坐在固定的位置，中途不得更換實驗人員。動物要提前一個月放入此 房間飼養，以便其更好的適應迷宮環境。水池的上方有天花板，日光燈和攝像鏡頭。這些標 志在整個實驗過程中保持不變。攝像鏡頭通過影像失蹤系統與計算機相連，記錄儀記錄實 驗過程中小鼠的運動行為。2)方法:A.先進行小鼠游泳能力的測試。讓每只小鼠在無逃避平臺的水迷宮池里 自由游泳60秒。接著，讓每只小鼠通過一個15cm寬的通道(從無逃避平臺的一端游到有 逃避平臺的另一端)，連續三次，每次間隔(inter-trial intervals，ITI) 10分鐘。B.常規 逃避平臺訓練從第二天開始計為隱蔽平臺訓練第一天，共連續4天。逃避平臺放在一個象 限的中央，位于水面下0.5cm。在整個試驗過程中平臺的位置保持固定不變。在平臺相對 的象限內貼池壁輕輕地將每只小鼠放入水中，頭朝外壁。當小鼠爬到逃避平臺上和其在水 中游泳達60秒時，即停止試驗。在小鼠爬到逃避平臺上后，讓其停留10秒。如果60秒內 小鼠沒有找到平臺，則實驗者引導其爬上逃避平臺上并讓其停留10秒。每天4次，ITI 30 分鐘。C.探索實驗在第5天小鼠只做兩次實驗，接著將平臺拿走，做一次“探索實驗”(a probe trial)。讓每只小鼠在水迷宮內搜索60秒，通過影像失蹤系統記錄小鼠的運動行為。 將逃避平臺的位置放在另一個象限的中央，并在逃避平臺上插一個高10cm，直徑1cm，黑白 相間的標竿，標竿頂部用白色防水貼封好。3)數據的采集與分析在整個實驗過程中小鼠的運動行為通過影像失蹤系統記 錄，存入計算機內。將每天四次訓練的數據合并在一起作為一天的數據加以分析。在隱蔽 平臺和可見平臺實驗中，記錄小鼠的運動速度，逃避潛伏期和搜索距離。在搜索實驗(probe trial)中，記錄并分析小鼠在有逃避平臺所在象限中搜索時間所占的百分比和小鼠通過平 臺的次數(平臺次數=經過平臺的次數-經過虛臺的次數)。實驗數據采用SAS V8分析， 各組之間的差異分析采用重復測量方差檢驗及T-檢驗。4)通過對不同年齡組雙突變ΑΡΡ695—Μ·轉基因小鼠、單突變APP695Vmi轉 基因小鼠及野生小鼠三組動物實驗，結果顯示各組小鼠在四天的訓練中，搜索平臺的潛伏
6期之間存在差異，各組小鼠的潛伏期均有明顯的縮短，說明水迷宮的訓練對小鼠學習和記 憶能力能力的提高是有意義的。從月齡開始，ΑΡΡ695ν652 Λ59_■轉基因小鼠潛伏期比野生 型延長2倍以上，比單突變APPv6521轉基因小鼠型延長約1倍，而單突變APPv6521轉基因小鼠 與野生型相比差異不大(見圖4)。說明雙突變APP695V652I/K596_5m轉基因小鼠從三月齡時 就出現了學習記憶障礙、認知水平下降。
權利要求
一種轉人APP雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型的建立。其特征在于，所述基因為人APP基因變點APP695V6521/K596N/M597L、PDGF APPV652I/K596N/M597雙突變轉基因載體質粒和小鼠模型。
2.一種轉人APP雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型的應用，其特征在于，作為研究人老 年癡呆癥的發病機理、藥物和疫苗研發的工具。
3.一種轉人APP雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型的制備方法，其特征在于，包括以下 步驟(1)將APP雙突變基因插入到PDGF啟動子下游，構建轉基因表達載體。(2)通過簡單的顯微注射操作建立APP695V6521—轉基因C57BL/6J小鼠。
4.根據權利要求1所述的一種轉人APP雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型的建立，其特 征在于，所述APP基因第一突變位于膜內區的第595及596位點(按APP695計算)的氨基 酸同時發生了賴氨酸-天門冬酰胺與蛋氨酸-亮氨酸的突變，此位點距Αβ的第1位氨基 酸(即β分泌酶酶切位點)僅1-2個氨基酸。該突變帶來的蛋白構象變化使得APP蛋白 更容易被β分泌酶切割。
5.根據權利要求1所述的一種轉人APP雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型的建立，其特 征在于，所述APP基因第二突變位于跨膜區內第642位點(按ΑΡΡ695計算)的氨基酸發生 纈氨酸(Val)-異亮氨酸(Ile)突變，此位點距A β的第42位氨基酸(即、分泌酶酶切位 點)僅4個氨基酸。該突變帶來的蛋白構象變化使得APP蛋白更容易被γ分泌酶切割。
6.根據權利要求1、2和3所述的一種轉人APP雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型，其特 征在于，該小鼠模型在三月齡時即表達Αβ (腦內老年斑的主要成分)、五月齡開始出現Αβ 在神經元內的積累和早期老年斑、在三月齡時就出現了學習記憶障礙等。
全文摘要
本發明屬于醫藥領域，提供一種轉人APPV652I/K596N/M597雙突變基因老年癡呆癥小鼠模型的建立和應用。本發明所述APP雙突變基因小鼠模型的特點具備人老年癡呆疾病的臨床特點和病理變化。該小鼠模型在三月齡時即表達Aβ(腦內老年斑的主要成分)、五月齡開始出現Aβ在神經元內的積累和早期老年斑、在三月齡時就出現了學習記憶障礙等。該模型與其它老年癡呆動物模型比較，具有發病早、臨床和病理特征明顯的特點。因此，該種APP雙突變基因小鼠模型的建立和應用，為研究人老年癡呆癥的發病機理、藥物和疫苗研發的提供了工具。
文檔編號C12N15/63GK101914547SQ20101023885
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者張連峰, 方瑾, 李萬波, 楊志偉, 陳煒 申請人:北京華阜康生物科技股份有限公司