專利名稱：一種外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物肥料領域，尤其涉及一種外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌及其 在促進黑松生長和防治松苗猝倒病中的應用。
背景技術：
植物根際促生細菌(Plant growth-promoting rhizobacteria, PGPR)是對根 際微生物區系中能夠促進植物生長、防治病害、增加作物產量的細菌的統稱。自從1978 年Burr等人首先在馬鈴薯上報導PGPR以來，國內外已發現20多個種屬PGPR。其中，假
Ifi^M (Pseudomonas) ,Wl^PfMM (Bacillus)、H干胃M (Agrobacterium) > K 菌屬(Eriwinia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、巴其Jf 德氏菌屬(Pasteuria) > W IS lif (Serratia)、腸桿菌(Enterobacter)等的作用最為突出。植物根際促生細菌和外生菌根真 菌(Ectomycorrhizal Fungi, EMF)作為植物根圈微生物的重要組成類群，對植物的營養吸 收、生長發育及土壤結構發揮著重要的作用。國內外已有大量的研究表明，菌根真菌與PGPR 混合接種對宿主植物的生長和營養吸收具有積極意義(Linderman，1996 JezaRll et al, 2004 ；王新榮等，1998)。菌根輔助細菌(MycorrhizalHelper Bacteria,MHB)作為一類的特殊的 PGPR，與 菌根真菌的作用關系十分密切，是菌根學研究的熱點之一。MHB的概念是1994年由法國學 者Garbaye提出的，具體是指可與菌根聯結并對菌根的形成具有選擇性促進作用的細菌。 大量研究表明，MHB與菌根真菌雙接種可顯著促進菌根真菌孢子萌發和菌絲生長、提高菌根 侵染率等，從而促進植物生長(Garbaye et al,1992 ；Duponnois et al，2003)。國外關于 MHB與菌根真菌互作關系的研究已有幾十年的歷史，篩選出了大量的MHB，并對某些優良的 MHB開展了比較深入的研究，但到目前為止，在我國還未見有關MHB的篩選研究以及MHB與 菌根真菌互作的相關報道。黑松(Pinus thimbergii)是我國南方人工林中最主要的造林樹種之一，廣泛應用 于荒山造林、沿海防護林帶的建設，且具有極強的觀賞價值。黑松是典型的外生菌根樹種， 主要生長在沿海土壤瘠薄的立地上，其生長對外生菌根真菌(EMF)的依賴性很強，菌根技 術的應用可以提高其在土壤貧瘠地區的生產力；而菌根輔助細菌(MHB)能通過促進菌根菌 生長，從而達到更好的促進林木生長的目的。因此，研究MHB及其與菌根真菌互作對黑松的 促生效果具有重要的理論和實踐意義。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種促進黑松生長和外生菌根真菌生長的短 小芽孢桿菌。本發明還要解決的一個技術問題是提供上述外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌的應用。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下
外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus) HR10，是一種從黑松 (Pinusthunbergii)和黃色須腹菌(Rhizopogen luteous,Rl)菌根共生體根際土壤中篩選 獲得的對黑松和黃色須腹菌(Rl)生長具有促進作用的MHB菌株，已保藏于中國典型培養物 保藏中心CCTCC，保藏號為CCTCC NO =M 2010143，保藏日期2010年6月12日。CCTCC NO :M 2010143菌株的菌學特性如下在TSA培養基平板，28°C培養24 36h菌落圓形、平鋪、米黃色、表面皺縮、較干、 邊緣放射狀，菌體細桿狀；革蘭氏染色為陽性、3% KOH試驗陰性；芽孢中生。通過BIOLOG系 統對HRlO進行鑒定，該菌株在鑒定板培養16 24h時的讀數相似值(SIM值)為0. 555，大 于0. 50，符合BIOLOG系統關于理想結果的要求，與數據庫比對結果的相似性(PROB)都為 99%。利用該系統鑒定到了種，為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。測得16SrDNA大部分序列1409bp，具體如SEQ ID No 1所示。16SrDNA序列通過 BLAST比對，在GenBank中找到同源性非常高的相近菌株序列。與HRlO菌株相似性最高的 是短小芽孢桿菌，同源性達到100%。從進化樹可以看出，HRlO與短小芽孢桿菌的親緣關系 較近，這與BIOLOG鑒定及BLAST的比對結果相符。CCTCC NO =M 2010143菌株對黑松具有促生長的作用。CCTCC NO =M 2010143菌株對松樹苗木猝倒病病原絲核菌(Rhizoctonia sp.)具 有抑菌作用；溫室防治試驗表明，該菌株能有效防治松苗猝倒病。并且上述CCTCC NO =M 2010143菌株對黃色須腹菌具有促生作用，且其與黃色須 腹菌互作對黑松的具有明顯的促生長作用，各接種處理間均表現出正交互作用。有益效果本發明與現有技術相比，具有如下優勢(1)外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌HRlO為植物根際促生細菌，對黑樹的生長具 有直接地促進作用；并且還能夠促進外生菌根真菌黃色須腹菌的生長，與黃色須腹菌雙接 種對黑松的也具有明顯的促進作用。(2)外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌HRlO對松樹苗木猝倒病病原絲核菌具抑制 作用；溫室防治試驗表明，短小芽孢桿菌HRlO菌株能有效防治松樹苗木猝倒病。
短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)HR10，已保藏于武漢大學中國典型培養物保 藏中心(簡稱CCTCC)；地址武漢武漢大學；郵編430072 ；保藏號M 2010143 ；保藏日期 2010年6月12日。圖1短小芽孢桿菌HRlO菌體對黃色須腹菌(Rl)菌絲生長的影響(X 17)；圖2短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產物對黃色須腹菌(Rl)菌絲生長的影響；圖3短小芽孢桿菌HRlO單獨接種及與黃色須腹菌(Rl)雙接種對黑松的促生作 用；圖4短小芽孢桿菌HRlO與苗木猝倒病病原絲核菌對峙培養結果。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 短小芽孢桿菌HRlO對黃色須腹菌(Rl)的促生作用將待測細菌活化后，用接種環取少量接種于裝有50mL TSA液體培養基的IOOmL三 角瓶中，280C，160r/min振蕩培養72h。將菌懸液倒入滅菌的離心管中，4°C，5000r/min離心 5min，倒去上清液，再用生理鹽水潤洗菌體兩次，最后根據離心管內菌體的數量適量加入生 理鹽水，混勻后即為HRlO菌株的菌體懸濁液(約含5X108cfu/mL)。同時，用無菌注射器吸 取上清液，細菌過濾器(濾膜孔徑為0. 22 μ m，直徑為0. 25mm)過濾后即為HRlO菌株的無菌 濾液。(1)短小芽孢桿菌HRlO菌體懸液對黃色須腹菌(Rl)的促生測定采用干皿對抗法進行試驗。將Rl菌根真菌培養于ZPD培養基，在其生長最旺盛期 間，用直徑為7mm的打孔器在培養皿邊緣打孔，取厚度(約5mm)基本一致的菌塊作為材料。 將菌根真菌菌塊倒置放入滅菌的空培養皿中，每皿接種三塊，三角狀放置，再用無菌移液器 吸取25 μ L HRlO菌株菌體懸濁液，滴加于各個真菌菌塊上，每個細菌菌株設六個重復，以滴 加生理鹽水的作為對照，置于25°C培養箱中培養。每隔6天添加25 μ IlOmM的葡萄糖溶液， 以防止菌塊干燥。待菌塊生長12 16d后，借助于裝有測微尺的體式顯微鏡觀測各個菌塊 的菌絲生長情況(表1 ；圖1)，計算HRlO菌株對菌根菌絲的平均促生長量。試驗結果表明， HRlO菌株對Rl菌絲的生長具有促進作用，與對照相比增長了 13. 1%。表1短小芽孢桿菌HRlO菌株菌體對黃色須腹菌(Rl)菌絲生長的影響
^iit __菌絲長度
菌株 -
平均值/cm增長率/%-
HRlO1.55±0.102a13.1
CK1.37+0.134a-注不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著，下同。(2)短小芽孢桿菌HRlO胞外代謝產物對黃色須腹菌(Rl)菌落生長的影響將ImL無菌濾液與45°C，20mL ZPD固體培養基混合倒平板，以無菌水處理作為對 照。將菌根真菌菌塊接種于培養皿中央，每處理三個重復，置于25°C恒溫培養。培養12 15d后觀測其菌落半徑(圖2)。試驗結果表明，HRlO菌株的胞外代謝產物對Rl菌落的生 長具有促進作用。HRlO在1000 μ L用量時，Rl菌落直徑比對照增長了 20. 2% (表2)。
表2短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產物對黃色須腹菌(Rl)菌落生長的影響
^it __菌落直徑
菌株 -
大小/cm增長率/%
HRlO 2.91 ±0.156 20.2 _CK_2.42 + 0.236__(3)短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產物對黃色須腹菌(Rl)生物量的影響。通過將HRlO菌株胞外代謝產物與黃色須腹菌(Rl)共培養，稱量菌絲干重的方法 來研究胞外代謝產物對菌根菌絲生長量的影響。具體方法如下將菌根真菌培養一段時間 后，用滅菌的打孔器打下菌餅(d = 7mm, <2 = 5mm)，每50mLZPD液體培養基中加入菌餅3
5塊，同時加入ImLHRlO菌株胞外代謝產物，25°C，160r/min共同振蕩培養12 15d，定性濾 紙過濾，再置于60°C烘箱中烘至恒重，然后用電子天平進行稱量。以TSA培養液為對照，每 處理各3次重復。試驗結果表明，HRlO菌株的代謝產物能促進Rl菌絲的生長量，與對照相 比，菌絲生物量增長了 30.5%。表3短小芽孢桿菌HRlO菌株胞外代謝產物對Rl菌絲生物量的影響 實施例2 短小芽孢桿菌HRlO與黃色須腹菌(Rl)互作對黑松的促生作用。芽苗的培育黑松種子經60°C溫水浸泡24h用以催芽，以0. 5%高錳酸鉀溶液浸 泡，2h進行表面消毒，再用自來水沖洗Ih后，播種于滅菌沙子中，置于25°C溫室中培養，待 其長到子葉期時進行芽苗截根移苗。盆栽基質基質土壤采自南京林業大學校園后山，土樣過篩后經1.01X 106pa滅 菌，90min，冷卻后備用。短小芽孢桿菌HRlO菌體懸濁液的制備將供試細菌活化后，用接種環取少量接種 于裝有50mL TSA液體培養基的IOOmL三角瓶中，28°C，160r/min振蕩培養72h。將菌懸液 倒入滅菌的離心管中，4°C，5000r/min離心5min，倒去上清液，潤洗菌體兩次，最后獲得菌 體懸濁液，并將各菌株接種液濃度調至5 X 108CfU/ml左右。黃色須腹菌(Rl)固體菌劑的制備利用ZPD培養基平板培養Rl菌根菌，將其作為 母菌種備用。固體擴大培養基質為蛭石、玉米粉和麩皮，三者以8 1 1的比例充分混合， 攪拌均勻，然后加入ZPD營養液(以手緊握有水滲出但不下滴為準)再次拌勻，取約400g 基質裝入培養袋中，將其壓實，并用包裝繩扎好袋口。培養基質經1. 01 X 106pa滅菌90min， 冷卻后，在無菌條件下將Rl接種于固體培養基質，置于25°C恒溫培養，待菌絲長滿培養基 質后即制備成外生菌根真菌的固體菌劑。短小芽孢桿菌HRlO與黃色須腹菌(Rl)雙接種的盆栽試驗采用芽苗截根法移栽 黑松幼苗，基質土與固體菌劑比例為10 1，細菌接種液的量為5mL/株，濃度約為IO7Cfu/ go具體方法如下首先，取適量無菌的盆栽基質裝入培養杯中，然后在土層表面覆約20g的 外生菌根菌劑；其次，將子葉期的黑松幼苗輕輕地從育苗盆中取出，并用清水將幼苗根部的 沙子沖洗干凈，用解剖刀將芽苗截去少量主根后移栽至培養杯中，使根系盡量包埋于菌劑 中，壓實土壤；第三，用無菌移液管吸取5ml的細菌菌體懸濁液，沿幼苗根系將其緩緩注入， 然后再覆一層基質土，每個處理的盆栽基質土為200g ；第四，澆水定根。以單接種細菌或外 生菌根菌及不接菌三種處理作為對照，每處理10個重復。置于25°C溫室培養，光照為12h/ d，適時澆水，統一管理。待雙接種處理黑松苗生長16個月后，對植株的生長狀況、生物量進 行觀察和測定。試驗結果表明(表4 ；圖3)，各接種處理均能顯著改善黑松的生長態勢，但不同處 理間差異顯著。單接種HRlO對黑松的促生作用最為顯著，該處理的黑松苗高、地徑的增長
6率分別高達62. 92%,62. 50%;R1+HR10混接處理，單接種Rl處理對黑松生長的促生作用次 之，各處理間差異達顯著水平。不同接種處理對黑松植株總生物量的影響也存在顯著差異。單接種HRlO可以顯 著增加黑松植株的總生物量，其植株總濕重的增長率高達132. 29%;R1+HR10混接和單接種 Rl處理的黑松總生物量的增長率分別達到73. 7%和27. 86%，以上三種接種處理與CK均達 到顯著差異水平。表4短小芽孢桿菌HRlO與黃色須腹菌(Rl)互作對黑松苗木生長的影響 實施例3 短小芽孢桿菌HRlO對絲核菌(Rhizoctonia sp.)平板抑菌作用將用NA斜面活化的短小芽孢桿菌HRlO菌株劃線接種于PDA平板兩側，再將松樹 苗木猝倒病病原菌PDA平板培養物用直徑5mm的打孔器打取同質同量的菌塊，點接于平板 中間。28°C培養7天觀察抑菌帶的有無，并記錄其寬度。從表5和圖4可看出，HRlO對病 原菌絲核菌(Rhizoctonia sp.)具有拮抗作用。與對照相比，抑菌率達85. 58%。表5短小芽孢桿菌HRlO對絲核菌(Rhizoctonia sp.)的抑制作用 實施例4 短小芽孢桿菌HRlO對溫室盆栽松苗猝倒病的防治芽苗的培育同實施例2;接種方法待黑松芽苗長至子葉期時進行移栽(每處理20個重復)，移栽基質土 壤采自南京林業大學校園后山，與沙子、蛭石以2 1 1的比例充分混勻后經1.01 X IO6Pa 滅菌90min，冷卻后即為培養基質。將松苗猝倒病病原菌絲核菌(Rhizoctonia sp.，編號 Csl)接種到PD培養基中振蕩培養7d,采用無菌紗布過濾獲得菌體，將其與培養基質充分混 勻，即為帶菌培養基質。先在育苗杯中放置1/2的無菌培養基質，再在每個育苗杯中施20g 帶菌培養基質；將黑松苗移栽到育苗杯中，短小芽孢桿菌HRlO菌株接種方法同實施例2，設 不接病原菌為對照(CK)，以校正發病率，每處理20個重復，7天后觀察并統計松苗的發病和 死亡情況。試驗結果表明，短小芽孢桿菌HRlO提高松苗抗猝倒病的能力(表6)。HRlO與Csl 混合接種的松苗猝倒病的發病率僅為15%，死亡率為10% ；而單接種病原菌Csl的黑松其 猝倒病發病率高達80 %，死亡率為65 %。
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表6不同接種處理對黑松猝倒病發病率和死亡率的影響
權利要求
一種外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌HR10，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，其保藏編號是CCTCC NoM2010143，保藏日期2010年6月12日。
2.權利要求1所述的外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌在促進黃色須腹菌(Rhizopogen luteous)生長中的應用。
3.權利要求1所述的外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌在促進黑松生長中的應用。
4.權利要求1所述的外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌與黃色須腹菌 (Rhizopogenluteous)互作在促進黑松生長中的應用。
5.權利要求1所述的外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌在防治由絲核菌 (Rhizoctoniasp.)引起的松苗猝倒病中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株外生菌根輔助細菌短小芽孢桿菌HR10，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，已保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，其保藏編號是CCTCC NoM 2010143，保藏日期2010年6月12日。本發明的短小芽孢桿菌HR10為植物根際促生細菌，不僅對黑樹生長具有直接的促進作用，而且還能夠促進外生菌根真菌黃色須腹菌的生長，其與黃色須腹菌雙接種對黑松也具有明顯的促生效果；短小芽孢桿菌HR10對松樹苗木猝倒病病原絲核菌具有抑制作用；溫室防治試驗表明，短小芽孢桿菌HR10菌株能有效防治松樹苗木猝倒病。
文檔編號C12N1/20GK101914474SQ20101023882
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月28日 優先權日2010年7月28日
發明者侯亮亮, 劉輝, 葉建仁, 吳小芹, 盛江梅 申請人:南京林業大學