專利名稱：一種己酸菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物，尤其是涉及一種能夠應(yīng)用于人工窖泥培養(yǎng)及退化老窖池 養(yǎng)護，快速增加窖泥中主要功能菌數(shù)量，縮短窖池老熟時間的高產(chǎn)己酸菌株。
背景技術(shù)：
濃香型大曲酒發(fā)酵采用獨特的泥窖發(fā)酵工藝，屬于多種微生物群的共同發(fā)酵，是 一個復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)體系。研究發(fā)現(xiàn)，濃香型白酒以己酸乙酯為主體香味物質(zhì)，己酸乙 酯含量多少直接影響大曲酒的質(zhì)量。它來源于棲息在窖泥中一類梭狀芽孢桿菌-己酸菌所 產(chǎn)己酸與酒醅中酵母產(chǎn)生的乙醇的化合。在發(fā)酵過程中，己酸與己酸乙酯的生成主要在窖 泥與酒醅接觸的界面上進行，梭狀芽孢桿菌在環(huán)境條件適宜時，通過下列途徑合成己酸乙 酯(1)乙醇和乙酸結(jié)合生成丁酸，丁酸再與乙醇結(jié)合生成己酸。
CH3CH2OH+CH3COOH—CH3 (CH2) 2C00H+H20
I +CH3CH2OH CH3 (CH2) 4C00H+H20(2)己酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)，生成濃香型白酒的主體香己酸乙酯。CH3 (CH2) 4C00H+CH3CH20H — CH3 (CH2) 4C00C2H5+H20人們很早就在生產(chǎn)實踐過程中發(fā)現(xiàn)，濃香型大曲酒產(chǎn)酒質(zhì)量的優(yōu)劣與泥窖的窖齡 有關(guān)。一般而言，發(fā)酵窖池窖齡越長，產(chǎn)酒質(zhì)量越好。但是，新建窖池依靠自然老熟要達(dá)到 老窖的標(biāo)準(zhǔn)，需要經(jīng)過漫長的歲月，短則數(shù)十年長則幾十年。同時，發(fā)酵窖池由于自然環(huán)境 的變化、窖池內(nèi)生化反應(yīng)作用等綜合原因，使得窖泥中的營養(yǎng)成分的缺失及酸堿度的變化， 己酸菌生長繁殖與代謝受到抑制，引起窖池老化、功能退化，產(chǎn)酒質(zhì)量下降的現(xiàn)象。己酸菌 作為窖泥中關(guān)鍵功能菌，在窖泥中含量多少決定了窖泥的質(zhì)量。濃香型大曲酒廠隨著生產(chǎn)需求的不斷擴大，要構(gòu)建新窖池，但新建窖池并不能馬 上生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)酒，并且老窖池由于各種原因可能也會出現(xiàn)退化。為了使新建窖池和退化老 窖池盡快產(chǎn)出好酒，科研技術(shù)工作者開始對發(fā)酵窖池的研究，利用各種生物科技手段，探 究老窖泥生化功能及發(fā)酵窖泥的老熟機理，以期縮短新建窖池達(dá)到優(yōu)質(zhì)窖泥水平自然老熟 過程及恢復(fù)退化窖池的生化功能。高素潔等人(《生物技術(shù)》1997年第7期《己酸 菌的分離篩選及發(fā)酵條件的研究》) 公開了一株從黑龍江省富裕酒廠的窖泥中分離到高產(chǎn)己酸的菌株，并通過發(fā)酵條件的研 究，該菌株己酸最高產(chǎn)量可達(dá)540mg/100ml。然而，該文獻沒有對該菌株做種屬鑒定，也沒有 公開該菌株的拉丁名稱。吳根福等人(《杭州太學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》1996年7月第23 卷第3期《己酸菌的自然選育及其生物學(xué)特性的初步研究》)公開了一株從杭州酒廠三家村 分廠的大曲酒窖池底泥中分離到產(chǎn)己酸量較高的菌株，經(jīng)初步鑒定為梭狀芽孢桿菌屬，并 推測是克氏控狀芽孢桿菌(Clostridium kluyveri)，其最適生長溫度35°C，最適pH為7. 0左右，最適酵母提取物濃度在生長時為1 %、產(chǎn)酸時為0. 1 %，乙醇濃度在1 % -4%范圍內(nèi)對 生長和產(chǎn)酸影響不大；在醋酸鈉培養(yǎng)基中生長10天，己酸產(chǎn)量最高可達(dá)380mg/100ml。周 春紅等人(《食品與發(fā)酵工業(yè)》，《濃香型大曲酒生產(chǎn)中己酸菌的制備》)公開了從白酒廠的 窖池中提取己酸菌進行人工培養(yǎng)強化，再模仿天然狀態(tài)條件混合窖泥共同厭氧發(fā)酵，以達(dá) 到己酸菌的自然生長條件，并對采用人工窯泥生產(chǎn)的濃香型白酒進行了評定，結(jié)果是，己酸 乙酯的含量最高為3. 05g/L，總酯的產(chǎn)量最高為4. 62g/L。中國專利CN101306020公開了己 酸菌在制備預(yù)防和治療腸癌藥物組合物中的應(yīng)用，包括預(yù)防腸息肉、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸 炎等慢性腸道疾病癌變、晚期不能手術(shù)腸癌的輔助治療、腸癌手術(shù)后的輔助治療等，己酸菌 選自但不限于己酸菌(Clostridium butyricum)CGMCC 0313. 1。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種己酸菌(Clostridium butyricum)GK13。該菌株具有 高產(chǎn)己酸及較好的生長穩(wěn)定性特征，經(jīng)強化功能菌后可用于制備高濃度復(fù)合己酸菌液，應(yīng) 用于人工窖泥的培養(yǎng)，在實際生產(chǎn)中達(dá)到縮短新建窖池老熟周期與退化窖池功能復(fù)壯的效 果，提高了出酒率和優(yōu)品率，解決退化老窖池復(fù)壯及縮短新建窖池老熟時間等問題。發(fā)明人通過大量試驗篩選各地名優(yōu)濃香型大曲酒優(yōu)質(zhì)老窖泥，最終獲得了本發(fā)明 的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13，并于2010年07月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物 保藏中心，保藏號為CCTCC N0.M2010175本發(fā)明的己酸菌(Clostridium butyricum) GK13的形態(tài)特征如下于1000倍顯微鏡觀察高產(chǎn)己酸菌株GK13的菌體形態(tài)，菌株形態(tài)特征為梭狀芽孢 桿菌，短桿端生芽孢，呈鼓錘狀，1. 8 μ m 2. 4 μ m，革蘭氏陰性菌。本發(fā)明的己酸菌(Clostridium butyricum) GK13的培養(yǎng)特征如下分離培養(yǎng)基(乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基，Ethanol acetate Medium, EAM)乙醇 2. 0% (滅菌后使用前加入)、NaAc0. 5%、酵母 0. l%、MgS04 · 7Η20 0. 02%, K2HPO4O. 04%, (NH4)2SO4O. 05%, CaCO3L 0%,自然pH ；固體培養(yǎng)基加入3. 0%的瓊脂(參見圖1)。乙酸鈉培養(yǎng)基CO2厭氧培養(yǎng)箱35°C培養(yǎng)4d，淡褐色，扁平中間稍凸起，質(zhì)地柔軟， 菌落大小(1. 4 2. 0)cm。乙酸鈉培養(yǎng)基真空厭氧培養(yǎng)35°C培養(yǎng)4d，淺黃色，扁平中間稍凸起，質(zhì)地柔軟，菌 落大小(0. 8 1. 6)cm(參見圖2)。本發(fā)明的己酸菌(Clostridium butyricum) GK13的生物學(xué)特性如下己酸菌(Clostridium butyricum) GK13己酸菌菌體芽孢菌數(shù)數(shù)量與產(chǎn)酸量隨著培 養(yǎng)時間增加先后達(dá)到峰值，芽孢菌數(shù)6d 7d達(dá)到高峰，己酸產(chǎn)量則在IOd左右達(dá)到高峰。 生長溫度范圍為25V 45°C，最適培養(yǎng)溫度為32°C 38°C ；對乙醇有較好的耐受性，在乙 醇濃度0 7%范圍內(nèi)均能生長，最適培養(yǎng)乙醇濃度為2. 0% ；在pH2. 0 pH7. 0范圍內(nèi)均 能生長，不適宜在堿性環(huán)境下生長，最適PH值為pH6. 5 pH7. 0。本發(fā)明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13的在EAM培養(yǎng)基35°C培養(yǎng)4d，連 續(xù)傳代數(shù)代培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征及形態(tài)特征均無明顯變化，該菌株的生物學(xué)性狀基本穩(wěn)定。本發(fā)明涉及的微生物，通過強化功能菌方式，而獲得高濃度復(fù)合己酸菌系，運用于 退化老窖池的復(fù)壯與人工窖泥的培養(yǎng)，能夠在較短的周期內(nèi)提高退化窖池與新建窖池的出酒率和優(yōu)質(zhì)率。該操作簡單，效果明顯，不改變原有的生產(chǎn)流程，且酒的質(zhì)量和風(fēng)味都穩(wěn)定。 既經(jīng)濟又環(huán)保，減少企業(yè)開支，提高經(jīng)濟效益。本發(fā)明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌種與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下 有益的技術(shù)效果1)通過實施例2可以看出，含有己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌種的復(fù) 合己酸菌系，產(chǎn)己酸的水平為856. 0mg/100mL，產(chǎn)丁酸的水平為362. Omg/IOOmL,比高素潔 等人(《生物技術(shù)》1997年第7期《己酸菌的分離篩選及發(fā)酵條件的研究》報道的菌株產(chǎn)己 酸量高316. 0mg/100mL,具有顯著的進步。
2)通過實施例3可以看出，利用本發(fā)明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13 菌種制備的復(fù)合己酸菌菌系ZC-21，在人工窖泥培養(yǎng)中的總酸產(chǎn)量水平可高達(dá)1. 15g/L，總 酯產(chǎn)量水平可高達(dá)5. 71g/L，己酸乙酯的產(chǎn)量水平可高達(dá)269. 19mg/100mL。比周春紅等人 (《食品與發(fā)酵工業(yè)》，《濃香型大曲酒生產(chǎn)中己酸菌的制備》)報道的菌株總酯產(chǎn)量高1. 09g/ L。另外，從表2 4實驗結(jié)果表明，應(yīng)用復(fù)合己酸菌ZC-21菌液于人工培養(yǎng)的老窖泥，能夠 有效的維護老窖池中窖泥的營養(yǎng)平衡，穩(wěn)定并增強窖內(nèi)優(yōu)勢菌群，感官評定、理化和微生物 指標(biāo)均與優(yōu)質(zhì)老窖泥質(zhì)量相接近。應(yīng)用于擴建的新窖池中能快速形成窖內(nèi)有益微生物生態(tài) 環(huán)境，窖泥質(zhì)量在短期內(nèi)接近于成熟窖池，第三排便所產(chǎn)原酒的四大酯比例為己酸乙酯 乳酸乙酯乙酸乙酯丁酸乙酯=1 0.63 0. 59 0.096，其比例協(xié)調(diào)，感官評定完全 達(dá)到了優(yōu)質(zhì)基酒的標(biāo)準(zhǔn)。3)通過實施例4可以看出，利用本發(fā)明的己酸菌(Clostridium butyricum)GK13 菌種制備的復(fù)合己酸菌菌系ZC-21，在退化老窖池復(fù)壯中的己酸乙酯產(chǎn)量依然可以高達(dá) 330. 78mg/100mL，總酯的產(chǎn)量可高達(dá)823. 95mg/100mL,比周春紅等人(《食品與發(fā)酵工業(yè)》， 《濃香型大曲酒生產(chǎn)中己酸菌的制備》)報道的菌株總酯產(chǎn)量高3. 62g/L，己酸乙酯產(chǎn)量高出 0.26g/L。另外，表5數(shù)據(jù)結(jié)果表明，復(fù)合己酸菌菌系ZC-21能有效補充了窖內(nèi)優(yōu)勢菌群，提 高了窖泥的生香功能。采用窖泥培養(yǎng)液復(fù)壯窖池，激活和增加了有益微生物菌群，使己酸乙 酯含量顯著提高。四大酯比例較為協(xié)調(diào)，窖內(nèi)發(fā)酵能力增強，生香功能明顯提高。
圖1為本發(fā)明所述的高產(chǎn)己酸菌株GK13在EAM培養(yǎng)基上CO2厭氧培養(yǎng)的菌落2為本發(fā)明所述的高產(chǎn)己酸菌株GK13在EAM培養(yǎng)基上真空培養(yǎng)的菌落3為本發(fā)明所述的高產(chǎn)己酸菌株GK13在1000倍顯微鏡菌體形態(tài)4為本發(fā)明所述的高產(chǎn)己酸菌株GK13在16S rDNA PCR產(chǎn)物電泳圖，其中1為 DNA Marker，2 為 16SrDNA PCR 產(chǎn)物
具體實施例方式以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步作描述，但是本發(fā)明 的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā) 明的保護范圍之內(nèi)。實施例1 己酸菌(Clostridium butyricum) GK13 的制備己酸菌(Clostridium butyricum)GK13是一株分離于濃香型白酒優(yōu)質(zhì)老窖泥的梭狀芽孢桿菌，分離培養(yǎng)基(EAM培養(yǎng)基)乙醇2.0% (滅菌后使用前加入)、NaAc0.5%、酵母 0. 1 %, MgSO4 · 7H20 0. 02%, K2HPO4O. 04%, (NH4)2SO4O. 05%, CaCO3L 0%,自然 pH ；固體培 養(yǎng)基加入3.0%的瓊脂。取各窖泥樣品通過80°C熱處理方式，經(jīng)富集培養(yǎng)做硫酸銅顯色進 行初篩，選取產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況較好的樣品進一步篩選，對產(chǎn)物做氣相色譜定性定量分析，選取 產(chǎn)己酸水平最佳的試樣進行分離純化。取復(fù)篩試樣液lmL，加無菌水10ml，振蕩lmin，接種 環(huán)取少量液體在瓊脂分離培養(yǎng)基上劃線，每樣4皿。在真空條件與CO2厭氧條件下，35°C培 養(yǎng)3d 4d，獲得單菌落。該菌種在平板上純化，確定為單一菌種后，經(jīng)鏡檢觀察選取梭狀 芽孢桿菌，接種于EAM液態(tài)培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)2周，對產(chǎn)物做氣相色譜分析，最終確定篩選菌 株，對該菌株進行生理生化鑒定和性能實驗，該菌最適生長溫度35°C，最適pH范圍pH6. 5 PH7. 0在液體靜止培養(yǎng)時利用乙醇、乙酸鈉與各類微量因子等多種底物生長，生成己酸和丁 酸為主的產(chǎn)物，經(jīng)16S rDNA測序鑒定為己酸菌(Clostridium butyricum)，并命名為己酸菌 (Clostridium butyricum)GK13，已于2010年07月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 保藏號為 CCTCCNO. M2010175。實施例2復(fù)合己酸菌系的制備
取己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌種，復(fù)合甲烷菌與丁酸菌進行強化，采 用80°C熱處理方式對復(fù)合菌系進行復(fù)壯，制備成高濃度復(fù)合己酸菌菌系ZC-21。經(jīng)強化后， ZC-21產(chǎn)酸水平與產(chǎn)芽孢總量菌有較大幅度的提升，并且經(jīng)多次傳代培養(yǎng)結(jié)果分析表明， 該菌系產(chǎn)酸水平及芽孢菌體生長情況未出現(xiàn)退化現(xiàn)象，具有較好的穩(wěn)定性。試驗結(jié)果見表
Io表1復(fù)合己酸菌菌系ZC 21產(chǎn)酸、芽孢的水平
權(quán)利要求
己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌株CCTCC NO.M2010175。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的培養(yǎng)特征為乙醇醋酸鈉培養(yǎng)基厭氧 培養(yǎng)35°C培養(yǎng)4d，菌株為淡褐色，扁平中間稍凸起，質(zhì)地柔軟，菌落大小1. 4 2. Ocm ；乙酸 鈉培養(yǎng)基真空厭氧培養(yǎng)35°C培養(yǎng)4d，菌株為淺黃色，扁平中間稍凸起，質(zhì)地柔軟，菌落大小 0. 8 1. 6cm0
3.如權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的形態(tài)特征為梭狀芽孢桿菌，短桿端生 芽孢，呈鼓錘狀，1. 8 μ m 2. 4 μ m，革蘭氏陰性菌。
4.如權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于它的生物學(xué)特性為所述菌株菌體芽孢菌數(shù) 數(shù)量與產(chǎn)酸量隨著培養(yǎng)時間增加先后達(dá)到峰值，芽孢菌數(shù)6d 7d達(dá)到高峰，己酸產(chǎn)量則在 IOd左右達(dá)到高峰；生長溫度范圍為25°C 45°C;對乙醇有較好的耐受性，在乙醇濃度0 7%范圍內(nèi)均能生長；在pH2. 0 7. 0范圍內(nèi)均能生長，不適宜在堿性環(huán)境下生長。
5.如權(quán)利要求4所述的菌株，其特征在于所述菌株的生長溫度范圍為32°C 38°C。
6.如權(quán)利要求4所述的菌株，其特征在于所述菌株的乙醇耐受濃度為2.0%。
7.如權(quán)利要求4所述的菌株，其特征在于所述菌株在pH6.5 pH7. 0能生長。
8.如權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于所述菌株在EAM培養(yǎng)基35°C培養(yǎng)4d，連續(xù) 傳代數(shù)代培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征及形態(tài)特征均無明顯變化，生物學(xué)性狀穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供一種己酸菌(Clostridium butyricum)GK13菌株CCTCCNO.M2010175。該菌株具有高產(chǎn)己酸及較好的生長穩(wěn)定性特征，經(jīng)強化功能菌后可用于制備高濃度復(fù)合己酸菌液，與應(yīng)用于人工窖泥的培養(yǎng)，在實際生產(chǎn)中達(dá)到縮短新建窖池老熟周期與退化窖池功能復(fù)壯的效果，提高了出酒率和優(yōu)品率，解決退化老窖池復(fù)壯及縮短新建窖池老熟時間等問題。
文檔編號C12N1/20GK101942405SQ20101023810
公開日2011年1月12日 申請日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者方尚玲, 汪江波, 鎮(zhèn)達(dá), 陳茂彬 申請人:湖北工業(yè)大學(xué)