專利名稱：鴨源性冠狀病毒s1蛋白基因及其克隆方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種鴨源性冠狀病毒ZZ2004的Sl蛋白基因 及其克隆方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1937年，冠狀病毒(Coronaviruses)首先從雞身上分離出來(lái)。1965年，分離出第 一株人的冠狀病毒。由于在電子顯微鏡下可觀察到其外膜上有明顯的棒狀粒子突起，使其 形態(tài)看上去像中世紀(jì)歐洲帝王的皇冠，因此命名為“冠狀病毒”。根據(jù)病毒的血清學(xué)特點(diǎn)和 核苷酸序列的差異，目前冠狀病毒科分為冠狀病毒和環(huán)曲病毒兩個(gè)屬。冠狀病毒科的代表 株為禽傳染性支氣管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus，IBV)。該病毒為有囊 膜、呈中等多形性球狀或橢圓形的病毒粒子，表面有桿狀突起。禽傳染性支氣管炎(IB)是由冠狀病毒科的禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的 一種常見(jiàn)多發(fā)的急性高度接觸性傳染病，表現(xiàn)為呼吸型、腎型、腸型、腺胃型等多種病型。該 病可感染所有日齡的雞，導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、死亡、增重和飼料報(bào)酬降低。IBV往往引起復(fù)合感 染，如新城疫(Newcastle Disease, ND)、慢性呼吸道病(CRD)等，并可繼發(fā)細(xì)菌性疾病，如 大腸桿菌病、沙門氏菌病等，從而加重了對(duì)雞群的危害。據(jù)《世界家禽》1999年資料，全世界 的禽病中，以呼吸系統(tǒng)疾病最為嚴(yán)重，其中IB是世界大多數(shù)地區(qū)危害養(yǎng)雞業(yè)的主要疾病。 1988年以來(lái)，IB在我國(guó)大部分地區(qū)相繼流行，疫區(qū)的發(fā)病率可達(dá)100%，死亡率可達(dá)10 30%。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的IBV有26種以上血清型，因血清型及新變型眾多，不同血清型之間 缺乏交叉保護(hù)，新的變異株不斷出現(xiàn)和流行，是造成雞群免疫失敗的原因。這使得IB對(duì)養(yǎng) 雞業(yè)造成的威脅持續(xù)存在。而掌握流行毒株的生物學(xué)特性和流行特點(diǎn)是正確使用疫苗的前 提。2004年5月，河南省鄭州某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生了以腹瀉和生長(zhǎng)遲緩為主要癥狀的疑似IB 疾病，感染雞主要表現(xiàn)精神沉郁，下痢，生長(zhǎng)緩慢及抵抗力下降，發(fā)病率為100%，死亡率達(dá) 10%以上，感染雞群的生產(chǎn)性能顯著降低。調(diào)查中顯示，與雞舍相距僅150米左右處有一個(gè) 1700只的肉鴨群，在第一批雞發(fā)病前約10天左右鴨群發(fā)生過(guò)類似癥狀的疾病，但沒(méi)有造成 大量死亡。死亡雞病變主要為小腸出血，腸壁變薄，有的有潰蕩，小腸絨毛脫落，腺胃乳頭腫 大、粘膜脫落，有的肌胃和腺胃交界處有出血，肌胃有出血或潰蕩，腎臟腫大，呈“花斑腎”， 肺臟無(wú)明顯變化，法氏囊、胸腺等免疫器官萎縮；病鴨剖檢以腎臟腫大，蒼白兼有出血、腿肌 及肝臟出血為主要特征。在同地區(qū)的其他雞場(chǎng)也發(fā)生了同樣癥狀的疾病，雖然經(jīng)過(guò)多種IBV 疫苗的免疫但疫情未得到有效控制。河南科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院開(kāi)展了對(duì)該疫病的研究工 作，結(jié)果從發(fā)病鴨體內(nèi)分離到一株病毒，鑒定為IBV，命名為鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，保 藏編號(hào)為CGMCC NO. 3842，其專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010225577. 4，此為首次有關(guān)家鴨感染IBV的 報(bào)道。IBV粒子含有3種特異性蛋白，即核衣殼蛋白(N)，膜蛋白(M)和纖突蛋白(S) ；S 蛋白位于病毒粒子表面，由等摩爾的Sl和S2兩個(gè)亞單位組成。S蛋白是IBV最重要的保護(hù)
3性抗原，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在病毒吸附細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮作用，在血清學(xué)分類上起決 定性作用。Kochetal (1990)的研究證實(shí)IBV Sl蛋白上存在6個(gè)抗原決定簇，分別為A，B， C，D，E和F，其中Sl上A，B，C三個(gè)決定簇有部分重疊，而只有Sl的D產(chǎn)生的抗體同時(shí)具有 中和作用和血凝抑制作用；S蛋白變異很大，其中變異最突出的部位發(fā)生在Sl上，其中某些 氨基酸的改變將改變抗原決定簇的構(gòu)象，導(dǎo)致新的變異株的產(chǎn)生；研究還表明，Sl蛋白與 宿主細(xì)胞膜粘附后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體及血凝抑制抗體，Sl還能誘導(dǎo)雞的特異性CTL應(yīng) 答；Sl蛋白的高變區(qū)(Hypervariable region,HVR)被認(rèn)為與中和表位相關(guān)；IBV毒株的組 織親和性及其毒力取決于Sl蛋白的N端。所以當(dāng)前深入系統(tǒng)的研究IBV的Sl蛋白基因， 進(jìn)而從分子水平上揭示IBV的流行和變異規(guī)律，對(duì)于研制開(kāi)發(fā)有效基因工程亞單位蛋白疫 苗及防治IB的藥物，進(jìn)而預(yù)防和控制IB的發(fā)生與流行有著重要的意義。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是對(duì)鴨源性冠狀病毒ZZ2004中的Sl蛋白基因進(jìn)行了分 析測(cè)序，給出了一種克隆該Sl蛋白基因的方法，并說(shuō)明了其用途。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 5所示。一種鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因，其氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示。上述鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因的克隆方法，包括以下步驟 1)選取鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，以5 ‘ -GACTGAACAAAAGACCGACT-3 ‘為上游引 物，以 5 ‘ -GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3 ‘為下游引物；以 5 ‘ -GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3 ‘為 上游引物，以5 ‘ -GCAGTAATACCACCAAAAGC-3 ‘為下游引物；2)分別通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增出鴨源性冠狀病毒ZZ2004株Sl蛋白基因全長(zhǎng)片 段，PCR 的擴(kuò)增條件 94°C，5min ；94°C lmin, 53°C lmin，72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)，最后于 72°C 延伸10min，4°C結(jié)束反應(yīng)；3)然后將Sl蛋白基因片段分別與pMDIS-T載體連接。上述鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因在制備IBV基因工程亞單位蛋白疫苗中的應(yīng) 用，該Sl蛋白基因可被克隆到質(zhì)粒載體或真核表達(dá)載體上進(jìn)一步研制出IBV核酸疫苗及活 載體疫苗對(duì)預(yù)防IBV將具有重要意義。上述鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因在制備防治雞傳染性支氣管炎藥物中的應(yīng) 用，該Sl蛋白基因一旦被導(dǎo)入植物，并在植物中表達(dá)出活性蛋白，有望研制出轉(zhuǎn)基因植物 可食疫苗，作為禽類飼料添加劑，家禽食用含有該種抗原的轉(zhuǎn)基因植物，將激發(fā)腸道免疫系 統(tǒng)，從而產(chǎn)生對(duì)IBV的免疫能力。上述鴨源性冠狀病毒(Avianinfectious bronchitis virus，IBV)ZZ2004，已 于2010年4月29日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，其簡(jiǎn)稱為 CGMCC，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該鴨源性冠狀病 毒的保藏編號(hào)為CGMCC NO. 3842，其中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?01010225577. 4。本發(fā)明具有積極有益的效果研究表明，Sl蛋白與宿主細(xì)胞膜粘附后，可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體及血凝抑制抗體，Sl 還能誘導(dǎo)雞的特異性CTL應(yīng)答，Sl蛋白同時(shí)決定著IBV毒株的組織親和性及其毒力。鑒于
4本病毒Sl基因變異突出的特點(diǎn)，同時(shí)本病毒的感染譜明顯不同于其它毒株，所以深入系統(tǒng) 的研究IBV的Sl蛋白基因，進(jìn)而從分子水平上揭示IBV的流行和變異機(jī)制，研制出IBV核 酸疫苗、活載體疫苗及防治雞傳染性支氣管炎藥物，對(duì)于預(yù)防和控制IB的發(fā)生與流行有著 重要的意義。
圖1為鴨源性冠狀病毒ZZ2004的Sl基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比對(duì)圖譜(說(shuō) 明書(shū)附圖第1、2頁(yè)為一幅連續(xù)的圖譜)；圖2為鴨源性冠狀病毒ZZ2004分離株與參考毒株Sl蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；圖3為鴨源性冠狀病毒ZZ2004的Sl基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果，圖中左為Pl引物擴(kuò) 增產(chǎn)物，右為P2引物擴(kuò)增產(chǎn)物。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容并不局限于下述具 體實(shí)施例。下述實(shí)施例中的試驗(yàn)方法，如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的 試驗(yàn)材料，如無(wú)特別說(shuō)明，均購(gòu)自常規(guī)生化試劑商店。實(shí)施例1鴨源性冠狀病毒ZZ2004的Sl基因的克隆方法(I)PCR引物設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)二對(duì)特異性引物，序列如下Pl 上游弓丨物 5 ‘ -GACTGAACAAAAGACCGACT-3 '，下游引物 5 ‘ -GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3 ‘ ；P2 上游引物 5 ‘ -GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3 ‘，下游弓丨 物 5 ‘ -GCAGTAATACCACCAAAAGC-3‘。(2)ZZ2004株的濃縮方法取ZZ2004株感染的尿囊液用滅菌PBS作1 10稀釋，取 0. 2ml接種于9日齡的SPF雞胚絨毛尿囊腔內(nèi)，37°C下孵化36 48h，置4°C 12h后收獲雞 胚尿囊液。分別取50ml ZZ2004株感染的SPF雞胚尿囊液于滅菌的離心管3管，5000rpm離心 20min ；分別棄沉淀，取上清液于另一滅菌的離心管中，12000rpm離心20min ；分別棄沉淀， 取上清液加入50ml的超速離心管，不足的以滅菌PBS補(bǔ)足，40000rpm離心4小時(shí)；棄上清 液，取沉淀用Iml滅菌PBS懸浮后_20°C保存?zhèn)溆谩?3) ZZ2004 株總 RNA 的提取用 DNA/RNA 提取試劑盒(MiniBEST ViralRNA/DNA Extraction Kit Ver. 3. 0)提取RNA，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(4) ZZ2004株基因片段的RT-PCR擴(kuò)增①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在0. 2ml Microtube管中配制下列混合液(表1)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。表1模板RNA/弓丨物反應(yīng)混合液
上述提取的Template RNA8 μ L
Total Volume
IOnL
在PCR儀上進(jìn)行變性、退火反應(yīng)65°C 5min，4°C保存。 離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于Microtube管底。 在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液(表2)。 表2反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液
4°C保存。
眧
在PCR儀上按下列反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)30°C 10min,42°C 30min,95°C 5min, ②PCR反應(yīng)按下列組成在Microtube管中配制PCR反應(yīng)液(表3)。同時(shí)設(shè)空白對(duì) 表3PCR反應(yīng)液 瞬時(shí)離心后，置PCR儀上擴(kuò)增。反應(yīng)條件為94°C，5min ；94°C lmin，55°C lmin， 72°C lmin，共35個(gè)循環(huán)，最后于72°C延伸lOmin，反應(yīng)產(chǎn)物-20°C保存。(5)基因片段回收從1. 0%瓊脂糖凝膠切膠回收不同大小的擴(kuò)增片段，按TaKaRa 公司提供的試劑盒(TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0)操作說(shuō)明進(jìn)行。
(6)連接將回收得到的DNA按如下體系(表4)與pMD18_T載體在16°C下連接 30min,同時(shí)用不連接外源基因的載體作對(duì)照。表4載體連接體系 (7)JM109感受態(tài)細(xì)胞的制備①?gòu)?7°C培養(yǎng)16h的平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到3ml LB培養(yǎng)基中，37°C下振 搖過(guò)夜，次日取菌液Iml接種于100ml LB (A-)培養(yǎng)基中，37°C下振搖2 3h，使0D600值達(dá) 到 0. 3 0. 4 ；②轉(zhuǎn)入預(yù)冷的50ml離心管中，冰浴IOmin ；③4°C下以4000rpm離心lOmin，棄上清液；④將離心管倒置于濾紙上lmin，除盡殘留的培養(yǎng)液；⑤加入預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2 10ml，重懸菌體，冰浴30min ；⑥重復(fù)步驟③、④；⑦用預(yù)冷的0. lmol/L CaCl2 4ml，重懸菌體，(需用于-30°C較長(zhǎng)期保存的含有 15%甘油的0. lmol/L CaCl2)，分裝0. Iml/管，_80°C保存?zhèn)溆?，隨時(shí)使用時(shí)4°C保存?zhèn)溆谩?8)轉(zhuǎn)化將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，按TaKaRa公司生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明操作。(9)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定用無(wú)菌牙簽挑取Amp+/LB瓊脂平板上的單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落(白色菌落)，按菌落編號(hào)順 序接種于含50ug/ml Amp+/LB液體培養(yǎng)基上；37°C下震蕩培養(yǎng)12 16h，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒并采用測(cè)序用通用引 物進(jìn)行鑒定；(10)質(zhì)粒提取按寶生物生物工程(大連)有限公司生產(chǎn)的質(zhì)粒提取試劑盒操作說(shuō) 明進(jìn)行。(11)采用通用引物PCR鑒定陽(yáng)性克隆按下列組成在0. 2ml Microtube管中配制PCR反應(yīng)液(表5)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。表5PCR反應(yīng)液 反應(yīng)程序95°C，3min-MV lmin, 55°C, 30sec, 72°C 30sec，共 35 個(gè)循環(huán)，最后于 72°C延伸5min，4°C保存。反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(12)測(cè)序使用ABI 377全自動(dòng)測(cè)序儀(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)以 通用引物對(duì)插入片段進(jìn)行序列測(cè)定。Sl基因RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3。實(shí)施例2S1基因推導(dǎo)的氨基酸序列同源性比對(duì)ZZ2004毒株Sl蛋白的氨基酸序列與6個(gè)參考毒株的同源率介于73. 7 % 85. 9 % 之間，其裂解位點(diǎn)的氨基酸序列為RRHRR，明顯不同于其他參考毒株(RRF/SRR)；與經(jīng)典毒 株Beaudette株比較其變異區(qū)域主要集中在3 26aa，53 57aa，62 81aa，88 136aa， 199 209aa，270 294aa，382 395aa，487 538aa等區(qū)域內(nèi)，其它區(qū)域仍存在較多散在 的點(diǎn)突變；與同源率最高的SAIBK株比較，其變異區(qū)段主要集中在23 25aa，62 82aa， 89 131aa，175 202aa，455 538aa等區(qū)域，其它區(qū)域還有一些散在的點(diǎn)突變，而大多數(shù) 變異位于前4個(gè)區(qū)域內(nèi)，即在前300個(gè)氨基酸殘基內(nèi)，這符合IBV Sl基因變異的特征，參見(jiàn) 圖1。將ZZ2004株與代表性參考毒株的Sl蛋白的氨基酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化樹(shù)的繪制 與分析，參見(jiàn)圖2。結(jié)果表明分離株Sl蛋白與GD毒株屬同一分支，與腎型毒株SAIBK、 SC021212毒株的親緣關(guān)系較近，與呼吸型Beaudette、經(jīng)典毒株M41、腺胃型毒株ZJ971及腎 型毒株Gray等的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
8
權(quán)利要求
一種鴨源性冠狀病毒的S1蛋白基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。
2.一種鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因，其特征在于，該基因的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示。
3.權(quán)利要求1或2所述鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括 以下步驟1)選取鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，以5'-GACTGAACAAAAGACCGACT-3‘為上游引物， 以 5 ‘ -GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3 ‘為下游引物；以 5 ‘ -GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3 ‘為上 游引物，以 5 ‘ -GCAGTAATACCACCAAAAGC-3 ‘為下游引物；2)分別通過(guò)RT-PCR的方法擴(kuò)增出鴨源性冠狀病毒ZZ2004株Sl蛋白基因全長(zhǎng)片段， PCR 的擴(kuò)增條件 94°C，5min ;94°C lmin，53°C lmin，72°C lmin，共 35 個(gè)循環(huán)，最后于 72°C延 伸10min，4°C結(jié)束反應(yīng)；3)然后將Sl蛋白基因片段分別與pMDlS-Τ載體連接。
4.權(quán)利要求1或2所述鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因在制備IBV基因工程亞單位蛋 白疫苗中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1或2所述鴨源性冠狀病毒的Sl蛋白基因在制備防治雞傳染性支氣管炎 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鴨源性冠狀病毒S1蛋白基因。其具有SEQ ID No.5、6所示的基因序列；其克隆方法為選取鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，以5′-GACTGAACAAAAGACCGACT-3′為上游引物，以5′-GCCATCGCTCTTAGTAACAT-3′為下游引物；以5′-GGTGGCTCTCGTATACAAAC-3′為上游引物，以5′-GCAGTAATACCACCAAAAGC-3′為下游引物；RT-PCR擴(kuò)增S1蛋白基因全長(zhǎng)片段，再與pMD18-T載體連接。與同類冠狀病毒相比，該病毒變異程度大、感染譜廣，研究其S1蛋白基因結(jié)構(gòu)，對(duì)于研制開(kāi)發(fā)基因工程亞單位蛋白疫苗及防治藥物，進(jìn)而防控IB的發(fā)生與流行有著重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101914554SQ201010237670
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2010年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月27日
發(fā)明者劉興友, 劉金華, 姚四新, 王麗榮, 王憲文, 王自良, 王青, 趙坤, 趙樸, 趙淑秋 申請(qǐng)人:河南科技學(xué)院