專利名稱：一種橙色紅曲霉的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物，具體涉及一種能夠產酯化酶，從而提高白酒中酯類物質 的含量的橙色紅曲霉。
背景技術：
濃香型大曲酒發酵屬于多種微生物群的共同發酵，是一個復雜的生物化學反應體 系。研究發現，濃香的來源及香型的形成離不開窖泥中厭氧微生物的作用，老窖泥中的己酸 菌是形成濃香型曲酒的主要功能菌，由它們發酵產生的己酸、丁酸和醋酸與窖內酒醅中的 乙醇，在微生物酯化酶作用下，通過酯化反應生成相應的酯，是濃香型酒香味的主要成份， 也是產生濃香的主要來源。濃香型大曲酒以己酸乙酯為主體香味物質，己酸乙酯的含量直接影響大曲酒的質 量。它來源于棲息在窖泥中梭狀芽孢桿菌-己酸菌所產己酸與酒醅中酵母產生的乙醇的 化合。己酸與乙醇的合成反應不是一個簡單的化學反應，它是由存在于大曲和酒醅中的一 種酶——酯化酶作用的結果。己酸和乙醇在酯化酶作用下合成己酸乙酯是己酸乙酯合成的 主要途徑。而酯化酶則是大曲微生物的代謝產物，酯化酶在大曲中含量多少決定了大曲的 質量。一般生產條件下，發酵糟內微生物所產酯酶的活力不高，醇、酸等反應底物濃度較低， 酯化反應速度緩慢，限制了己酸乙酯等主體香味含量增加。大曲中的有益微生物菌群如產 酯酵母、酒精酵母等微生物類群不穩定，數量、量比關系不固定等缺陷也十分明顯。如果使 用純種紅曲，與不同對象配合，用于提高出酒率和優質率，按一定比例加入純種培養的紅曲 霉，人為控制發酵過程，解決微生物數量足、功能強、類群之間的量比關系穩定等缺點，兩者 配合使用優勢互補，突出己酸乙酯的主體香，使得酒體豐滿協調。酯化酶制劑是生物酶和活菌體的生態混合體，在白酒生產中廣泛的運用，在發酵 過程不僅有傳統大曲的糖化功能，而且還有生香功能，從而達到縮短發酵周期，提高出酒率 和優品率的效果。運用分離純化得到酯化菌種在釀酒行業中應用，釀造出的酒與原工藝酒 比較，口味更加醇厚、幽雅，窖香更濃，味更長。近年來，很多白酒生產廠應用酯化酶技術都 取得了不錯的效果。孟勤燕等人(高產酯力紅曲霉篩選及在西鳳濃香調味酒生產中的試 用，釀酒科技，2006 (5) 52-54)以20多個大曲、酒醅為原料，分離、純篩選得到一株具有較 高酯化性能的紅曲霉M-6。在35°C下酯化30d，pH3. 5，酒精度10% (v/v)，能取得較好的效 果。在釀酒生產試用中，加紅曲霉M-6生產的麩曲發酵酒比對照酒的己酸乙酯高2倍多； 在西鳳濃香酒生產中試用，所產酒己酸乙酯增高，窖香純正濃郁、酒體醇厚爽凈、回味好，質 量優于對照樣。唐現洪等人(SGAS2004. 0001酯化菌的分離及其應用，釀酒科技，2006 (5) 4952)采用透明圈等方法，結合酯化能力、耐酒能力、耐酸能力試驗指標篩選得到一株紅曲 霉菌株SGAS2004.0001，耐己酸濃度為1%，酯化能力達到10% (V/V)以上；該菌株制成 麩曲用于其公司的雙輪底酒生產和公司的制曲生產中，雙輪底酒的己酸乙酯含量平均增 加65mg/100mL，用SGAS-2004. 0001菌種接種的大曲，所產酒己酸乙酯的平均含量增加了 32mg/100mL。
俞艷玲等人(《7種紅曲霉的掃描電鏡觀察》，浙江中醫學院學報2005年1月第 29卷第1期)公開了一種通過掃描電鏡確定7種紅曲霉的超顯微特征的方法，主要涉及發 白紅曲霉5017、巴克紅曲霉5021、煙色紅曲霉5035、紫紅曲霉5032、紅色紅曲霉5029、橙色 紅曲霉(Monascus aurantiacus Lee) 5015和變紅紅曲霉5016這7種菌株的鑒定。該文獻 并沒有公開利用這些菌株進行發酵生產白酒以增加己酸乙酯含量或總酯含量。潘名志等人 (《紅曲霉產酯化酶液體培養基研究》，山地農業生物學報2009年28期)公開了一種對貴州 大學真菌資源研究所提供的4株紅曲霉Monascus ZZ,Monascus ZK、Monasuc GX、Monasucs XM進行液體發酵研究，篩選出產酯化酶能力較高的紅曲霉Monascus ZK，并應用單因素和正 交試驗篩選了培養基配方，連續進行4個批次的穩定性試驗證明，以最佳培養基發酵，酯化 酶平均酶活力為293. 8U mL—1，酶活力提高了 42. 3%。顯然，該文獻沒有公開橙色紅曲霉 (Monascus aurantiacus)MN2，也沒有公開利用所篩選出的紅曲霉Monascus ZK在白酒發酵 后的己酸乙酯含量或總酯含量。中國專利CN1160764公開了一種從江蘇省軍區運西農場所 屬江蘇華威保健品廠紅曲霉菌的曲粉中經選育出的N8Monascus aurantiacus (AS3. 4693)， 保藏號為CGMCCNo. 0285。該發明人采用上述新菌株經培育、發酵、蒸餾、過濾等步驟，可得含 酯300mg/100ml的調味酒。
發明內容
本發明的目的在于提供一種橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2。該菌株所 產的酯化酶具有合成較長直鏈酯的酯化活性，能夠催化濃香型曲酒中的以己酸乙酯為主的 四種酯的合成，從而達到縮短發酵周期，提高出酒率和優品率的目的，同時解決了發酵糟內 微生物所產酯酶的活力不高，以及醇、酸等反應底物濃度較低，酯化反應速度緩慢的問題。發明人通過大量試驗篩選，最終獲得了本發明的橙色紅曲霉 (Monascusaurantiacus)MN2，并于2010年7月20日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏 號為 CCTCC NO. M2010176。本發明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2具有以下形態特征于400倍顯微鏡觀察紅曲霉MN2的菌絲體形態，菌株形態特征為菌絲體分枝甚 繁、有隔，產橙色油滴，直徑3. 0 u m-7. 0 u m，幼時有內含物，分生孢子球形或洋梨形、無色， 子囊果球形、無色、短柄，橢圓形(5.0-7.0) umX (4. 5-5.0) u m0本發明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2具有以下培養特征橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在麥芽汁瓊脂培養基中30°C培養7d，菌 落最大，稍凸起，有細小絨毛，疏松，具較強蔓延性，正面中間淺灰色，周邊棕紅色，背部紫紅 色，菌落大小為(3. 5-4. 5) cmX (5. 5-6. 5) cm，生長速度快(參見圖1)；橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在麩皮瓊脂培養基中30°C培養7d，菌 落較大，凸起，疏松，呈皮膜狀，有放射狀，正面中間淺粉色，背部紅色，菌落大小(3. 0-4. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm,生長速度較快(參見圖2)；橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在PDA瓊脂培養基中30°C培養7d， 菌落較大，稍凸起，疏松，呈絨氈狀，蔓延性一般，正面中間淺粉色，背部深紅色，菌落大小 (3. 0-4. 0) cmX (4. 5-5. 5) cm,生長速度較快(參見圖 3)；橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2在察氏瓊脂培養基中30°C培養7d，菌落小，凸起最高，呈絨氈狀，疏松，蔓延性差，正面淺紅色，背部紅色，菌落大小(2. 5-3. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm,生長速度較慢(參見圖4)。本發明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2的生物學特性如下生長溫度為20°C 45°C，最適生長溫度為30°C 35°C，在pH2. 0 7. 0的范圍內 均能生長，在乙醇濃度是5%左右生長比較好，耐乙醇濃度小于10%。在麥芽汁瓊脂培養基 和PDA瓊脂培養基30°C培養7d,連續傳代數代培養，其培養特征及形態特征均無明顯變化， 該菌株的生物學性狀基本穩定。與現有技術相比，本發明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2菌株具有如 下有益的技術效果1)通過實施例1可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制備的 酯化粗酶制劑，其酯化力可達65. 6mg/g. 100h，而桔霉素含量小于lmg/L或lmg/kg。2)通過實施例2、3可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制備 的酯化粗酶制劑，其對催化己酸合成己酸乙酯的能力最強，合成乙酸乙酯、丁酸乙酯和乳酸 乙酯能力較弱，說明該酶制劑是一類專一性很高的酶。3)通過實施例4、5可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制 備的酯化液應用于回窖發酵試驗中時，其蒸餾前段酒中四大酯含量明顯提高，尤以己酸 乙酯含量增加較多，可達196. 7mg/100mL,總酯含量高達509. 18mg/100mL ；另外，經感官 品評對比可以看出，回窖發酵后的酒，有窖香更濃郁，風味更協調，口感更醇和，余味長等 特點。與中國專利CN1160764公開的N8Monascus aurantiacus (AS3. 4693)菌株相比，本 發明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)麗2發酵生產的白酒，其己酸乙酯含量高達 己酸乙酯的含量可達254. 5mg/100mL,乙酸乙酯含量可達282. 4mg/100mL,總酯含量高達 698. 18mg/100mL，具有顯著的進步。4)通過實施例6可以看出，利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制 備的酯化液應用于串蒸提香試驗時，蒸餾前段酒中四大酯的含量明顯增加，尤其是己 酸乙酯的含量可達254. 5mg/100mL,乙酸乙酯含量可達282. 4mg/100mL,總酯含量高達 698. 18mg/100mL;另外，用不同串蒸方式提香時，香醅串蒸優于底鍋串蒸。從表6中感官 品評可知串蒸后的酒，有酒體香濃、酒味協調、余味長等特點，香醅串蒸酒口感優于底鍋 串蒸。與中國專利Cm 160764公開的N8Monascus aurantiacus (AS3. 4693)菌株相比，本 發明的橙色紅曲霉(Monascusaurantiacus)麗2發酵生產的白酒，其己酸乙酯含量高達 己酸乙酯的含量可達254. 5mg/100mL,乙酸乙酯含量可達282. 4mg/100mL,總酯含量高達 698. 18mg/100mL，具有顯著的進步。本發明的橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2能夠以麩皮和玉米粉作為發酵 基質，通過人工純培養方式獲得紅曲酯化酶，利用酯化酶提高白酒中酯類的含量，可提高出 酒率和優質率。利用本發明的橙色紅曲霉(M0nasCuSaurantiaCuS)MN2的釀酒工藝，操作簡 單，效果明顯，不改變原有的生產流程，且酒的質量和風味都穩定。既經濟又環保，減少企業 開支，提高經濟效益。
圖1為本發明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在麥芽汁瓊脂培養基上的菌落圖
圖2為本發明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在麩皮瓊脂培養基上的菌落3為本發明所述的橙色紅曲霉菌株麗2在PDA瓊脂培養基上的菌落4為本發明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在察氏瓊脂培養基的菌落5為本發明所述的橙色紅曲霉菌株MN2在400倍顯微鏡菌絲體形態圖6為本發明所述的橙色紅曲霉菌株麗2在26S rDNA D1/D2區域PCR產物的電 泳圖，其中 Marker 為 DL-2000 ；1 為 26S rDNA
具體實施例方式以下是本發明的具體實施例，對本發明的技術方案做進一步作描述，但是本發明 的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發明構思的改變或等同替代均包括在本發 明的保護范圍之內。實施例1利用橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2制備酯化粗酶制劑取橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2菌種，在無菌條件下，挑取少許菌絲 體，轉接于無菌麥芽汁試管培養基中，在30°C 32°C培養48h 52h，即為一級試管斜面種 子。在500mL的三角瓶中加入大米培養基20g、無菌水200mL，于121°C高壓滅菌20min，在 無菌條件下，接入試管斜面種子，于32°C、200rpm條件下搖瓶培養48h 52h，即為二級三角 瓶種子。向滅菌好的500L種子罐中加入大米培養基15Kg，無菌水200L，在120°C 125°C 溫度下滅菌30min，待種子罐冷卻至35°C 40°C時，按種子罐中物料體積總量的0. 10% 0. 15% (v/v)接入培養好的三角瓶種子，在轉速240rpm、溫度32°C 34°C、灌壓0.05Mpa 0. 07Mpa、無菌空氣流量8m3/h 10m3/h的條件下，培養48h得三級生產用菌種。將麩皮70%、玉米粉30%投入蒸料罐內，旋轉混合時間lOmin ；向蒸料罐內加水， 料水質量比為1 0. 4 ；然后在121°C溫度下蒸料30min ；在內壓位0，溫度為90°C下涼料， 得基料；將基料從蒸料罐內放出，轉入發酵池，基料溫度冷卻至35°C 40°C，得冷卻好的基 料。向冷卻好的基料中加入三級生產用菌種，接種量為基料的20% (v/w，毫升/克)，混合 拌種，加入基料總量0.1% (v/w，毫升/克)的乳酸，接種后溫度維持32°C 35°C，得拌種 基料。將拌種基料堆厚40cm 50cm，表面覆以滅菌的麻袋，自然室溫，發酵培養10h 15h，得發酵基料。當發酵基料的溫度達到48°C 50°C時，攤薄發酵基料至15cm 20cm，室 溫20°C 25°C，自動通風維持品溫32°C 35°C，發酵培養3d 5d，每天翻料一次，得發酵 好的基料。將發酵好的基料低溫((65°C )烘干至水分< 12%，得低溫烘干基料。將低溫 烘干基料粉碎，細度為100%過40目，得酯化酶粗酶制劑，其水分含量和酯化力參見表1。表1酯化粗酶制劑水分含量和酯化力
權利要求
1.橙色紅曲霉(Monascusaurantiacus)MN2 菌株 CCTCC N0.M2010176。
2.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于它的培養特征為麥芽汁瓊脂培養基上30°C培養7d,菌落稍凸起，有細小絨毛，疏松，具較強蔓延性，正 面中間淺灰色，周邊棕紅色，背部紫紅色，菌落大小為(3. 5-4. 5) cmX (5. 5-6. 5) cm ；麩皮瓊脂培養基30°C培養7d,菌落凸起，疏松，呈皮膜狀，有放射狀，正面中間淺粉色， 背部紅色，菌落大小(3. 0-4. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm ；PDA瓊脂培養基30°C培養7d，菌落稍凸起，疏松，呈絨氈狀，蔓延性一般，正面中間淺粉 色，背部深紅色，菌落大小(3. 0-4. 0) cmX (4. 5-5. 5) cm ；察氏瓊脂培養基30°C培養7d,菌落小，凸起最高，呈絨氈狀，疏松，蔓延性差，正面淺紅 色，背部紅色，菌落大小(2. 5-3. 0) cmX (3. 5-4. 5) cm,生長速度較慢。
3.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于它的形態特征如下在400倍顯微鏡觀察，菌絲體分枝甚繁、有隔，產橙色油滴，直徑3 μ m-7 μ m，幼時有內 含物，分生孢子球形或洋梨形、無色，子囊果球形、無色、短柄，橢圓形(5-7) μ mX (4. 5-5) μ m0
4.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于它的生物學特性為生長溫度為20°C 450C，在pH2. 0 7. 0的范圍內均能生長，在乙醇濃度是5%左右生長比較好，耐乙醇濃度小 于 10%。
5.根據權利要求4所述的菌株，其特征在于它的生長溫度為30°C 35°C。
6.根據權利要求1所述的菌株，其特征在于在麥芽汁瓊脂培養基和PDA瓊脂培養基 30°C培養7d，連續傳代數代培養，它的培養特征及形態特征均無明顯變化，生物學性狀基本穩定。
全文摘要
本發明公開了一種橙色紅曲霉(Monascus aurantiacus)MN2菌株。該菌株所產的酯化酶具有合成較長直鏈酯的酯化活性，能夠催化濃香型曲酒中的以己酸乙酯為主的四種酯的合成，從而達到縮短發酵周期，提高出酒率和優品率的目的，同時解決了發酵糟內微生物所產酯酶的活力不高，以及醇、酸等反應底物濃度較低，酯化反應速度緩慢的問題。
文檔編號C12N1/14GK101993825SQ20101023739
公開日2011年3月30日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者方尚玲, 鎮達, 陳茂彬 申請人:湖北工業大學