專利名稱：經血源性間充質干細胞分離培養及其免疫調節作用的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有自我更新能力和多向分化潛能的多能干細胞，尤其是涉及一種經 血源性間充質干細胞(ERCs)的分離培養，本發明還涉及經血源性間充質干細胞的免疫調 節作用。
背景技術：
間充質干細胞(MSCs)具有低免疫原性、多向分化潛能及歸巢等優點，是組織工程 與細胞移植的重要種子細胞，被廣泛應用于心血管疾病、中樞神經系統疾病、骨科類疾病及 腎臟疾病等疾病的治療。異體器官、組織及細胞移植引起的免疫排斥反應及自身免疫性疾病是醫學工作者 所面臨的難題，傳統藥物等治療方法無法根治該類疾病并可能引起嚴重的毒副作用。近年 來，一些研究表明骨髓間充質干細胞(BMSCs)具有獨特的免疫調節作用，可用于移植治療 同源異體移植引起的免疫排斥反應及自身免疫性疾病。一些研究發現，MSCs在心臟、腎臟、 胰腺、肝臟等多種實體器官移植引起的免疫排斥反應中以及造血干細胞移植導致的移植物 抗宿主病(GVHD)中都具有良好的治療效果，可有效延長移植物生存時間，減輕免疫排斥反 應，提高移植成功率。在自身免疫性疾病治療方面，美國國家衛生部已批準MSCs應用于治 療移植物抗宿主病并進入III期臨床階段。另外在歐洲和北美，MSCs也已被用于治療一些 常見的自身免疫性疾病如全身性硬化癥、系統性紅斑狼瘡等且已進入I/II期臨床試驗階 段。而骨髓間充質干細胞(BMSCs)的創傷性獲取及涉及的倫理、法律等問題又使其應用受 到了限制。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新型MSCs來源的ERCs分離培養，并通過ERCs與植物 凝集素(PHA)刺激下人外周血淋巴細胞及小鼠脾淋巴細胞共培養實驗及檢測免疫相關細 胞因子的分泌情況對ERCs的免疫調節作用進行了研究。為實現上述目的，本發明可采取下述技術方案本發明所述的經血源性間充質干細胞分離培養，包括下述步驟第一步培養基的配制每390ml DMEM高糖培養基加入IOOml滅活后的無支原體胎牛血清、5mll0000U/ml 的青/鏈霉素及5ml 0. 25mg/ml的兩性霉素B，得到體積為500ml的培養基備用；第二步經血源性間充質干細胞的分離與培養材料獲取取月經血5ml，加入0. 2ml 0. 25mg/ml的兩性霉素B、0. 2ml青/鏈霉素， 0. lmlEDTA-Na2防止污染，在材料獲取24_48h內進行下述細胞分離；細胞分離在15ml離心管中緩慢加入5ml比重為1. 077的淋巴細胞分離液，將月經血與等量PBS緩沖液充分混勻后，將經血用滴管沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液分層液面上，細胞 懸液與分離液兩者比例為1 1或2 l、2000rpm/min水平離心20min ；離心后管內液體分 為四層，上層為血漿和PBS緩沖液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液， 在上、中層交界處有單個核細胞層；用移液器吸取單個核細胞層置入另一 15ml離心管中， 加入5倍以上體積的PBS緩沖液，1200rpm/min離心lOmin，洗滌細胞兩次；末次離心后，棄 上清，用5ml培養基充分混勻后置于T25培養瓶中，于37°C、體積分數為5% CO2、飽和濕度 培養箱臥式培養，培養瓶標記日期；換液定期觀察細胞生長情況，細胞培養三天后，將培養瓶取出，在100倍目鏡下觀測細 胞貼壁良好，則可進行換液，棄去其它類型雜細胞及未貼壁細胞，根據細胞生長情況，每3-4 天全量換液1次；
傳代待細胞達到80% 90%融合時，進行傳代，貼壁細胞用PBS洗滌2次，再用含有 0. 25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的細胞消化液于37°C消化30秒到1分鐘，消化過程中，用 倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待細胞大部分胞體回縮、變圓，即加入少量血清終止消化； 然后加適量PBS緩沖液，用吸管反復吹打使細胞絕大部分脫落后，將細胞懸液移入15ml離 心管，lOOOr/min，離心5min，棄去上清，后用培養基制成細胞懸液，充分混勻后按1 3比例 傳代培養，記為Pl代；傳代培養過程中每3-4天全量換液一次，貼壁細胞再次融合鋪滿瓶底 后，重復上述操作，記為P2代，以此類推。所述的ERCs及培養上清對同源及異源淋巴細胞還具有免疫調節作用。本發明的優點在于采用密度梯度離心法從經血中成功分離出ERCs，并對其特異性 表面標記及增殖活力進行了檢測，建立了該細胞穩定的培養方法，由于其來源廣泛，取材方 便，可以無創傷獲取，不涉及倫理問題，為MSCs的臨床應用提供了新的替代來源，具有良好 的應用前景。同時，經研究還發現，ERCs及培養上清對同源及異源淋巴細胞都具有免疫調節作 用，ERCs能顯著降低人外周血淋巴細胞IFN-Y的分泌。表明ERCs免疫調節作用機制可能 與細胞間的直接接觸及抑制淋巴細胞IFN-Y的分泌有關，可以為減少異體移植引起的免 疫排斥反應及治療自身免疫系統疾病提供理論依據。
圖1為本發明采用密度梯度離心分離單核細胞的示意圖。圖2-1為原代ERCs培養24h后的細胞生長圖。圖2-2、2-3、2_4分別為第三代ERCs培養1天、3天、5天的細胞生長圖。圖3為ERCs流式細胞儀分析結果圖。圖4為ERCs的生長曲線圖。圖5-1為ERCs對同源及異源淋巴細胞的增殖抑制作用示圖。圖5-2為ERCs培養上清對T淋巴細胞的增殖抑制作用示圖。圖6為細胞因子IFN- γ的分泌示圖。
具體實施例方式本發明所述的經血源性間充質干細胞(ERCs)分離培養，包括下述步驟第一步ERCs培養基的配制每390ml DMEM高糖培養基加入IOOml滅活后的胎牛血清、5ml 10000U/ml的青/ 鏈霉素及5ml 0. 25mg/ml的兩性霉素B，得到體積為500ml的培養基備用；第二步ERCs的分離與培養材料獲取取年輕、健康女性月經血5ml，加入0. 2ml 0. 25mg/ml的兩性霉素B、0. 2ml青/鏈 霉素，0. Iml EDTA-Na2防止污染，在材料獲取24_48h內進行細胞分離；細胞分離在15ml離心管中緩慢加入5ml比重為1. 077的淋巴細胞分離液，將月經血與等量 PBS緩沖液充分混勻后，將經血用滴管沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液(聚蔗糖-泛影葡 胺分離液，在文章上都直接稱為淋巴細胞分離液或Ficoll分離液)分層液面上，細胞懸液 與分離液兩者比例為1 1或2 l，2000rpm/min水平離心20min。離心后管內液體分為四 層，上層為血漿和PBS緩沖液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、 中層界面處有一白色云霧狀狹窄帶即為單個核細胞層(見圖1)；用移液器吸取單個核細胞 層置入另一 15ml離心管中，加入5倍以上體積的PBS緩沖液，1200rpm/min離心lOmin，洗 滌細胞兩次；末次離心后，棄上清，用5ml培養基充分混勻后置于T25培養瓶中，于37°C、體 積分數為5% CO2、飽和濕度培養箱臥式培養；換液細胞培養三天后，將培養瓶取出，棄去其它類型雜細胞及未貼壁細胞，每3-4天全 量換液1次；傳代待細胞達到80% 90%融合時，進行傳代，貼壁細胞用PBS洗滌2次，再用含有 0. 25%胰蛋白酶和0. 02% EDTA的細胞消化液于37°C消化30秒至1分鐘，消化過程中，用 倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待細胞大部分胞體回縮、變圓，即加入少量血清終止消化； 然后加適量PBS緩沖液，用吸管反復吹打使細胞絕大部分脫落后，將細胞懸液移入15ml離 心管，1000rpm/min,離心5min，棄去上清，后用培養基制成細胞懸液，充分混勻后按1 3比 例傳代培養，記為Pl代；傳代培養過程中每3-4天全量換液一次，貼壁細胞再次融合鋪滿瓶 底后，重復上述操作，記為P2代，以此類推。ERCs免疫表型鑒定選取生長狀態良好的第3代ERCs，棄去培養基，PBS洗滌2遍，消化離心后將細胞 濃度調整為2 X 106/ml，每Eppendof管(一種離心管)加入100 μ L細胞懸液。采用直接法每 管分別加入 20 μ L 鼠抗人 PE-CD29、FITC-CD44、FITC-HLA-ABC、PerCP_CD45、FITC-HLA-DR、 PE-CD34。對照管分別加入等量鼠抗人FITC-IgGl、PerCP-IgGl和PE-IgGl，室溫下避光孵 育30分鐘，PBS洗滌2次，1300prm離心5分鐘，充分混勻后進行流式檢測。ERCs增殖活力檢測取生長狀態良好的Pl，P3，P5ERCs，以0. 25%胰酶+0. 02% EDTA消化后，用ERCs 培養基將ERCs濃度調整為2X 104/ml的細胞懸液。每孔IOOul接種于96孔板，置于37°C，
55% CO2飽和濕度培養箱內培養，分別于細胞培養第1天，3天，5天，7天，9天檢測細胞增殖 活力，每個時間點設5個平行孔，測定前避光下每孔加入lOulCCK-8溶液，置于37°C、5% CO2 培養箱中孵育2小時后使用多功能酶標儀在450nm波長處檢測吸光度值(0D值)，并根據測 得OD值繪制細胞生長曲線。ERCs的凍存與復蘇凍存將體外擴增培養至第3代，生長狀態良好的ERCs消化后收集細胞，以臺盼 藍染色法評估細胞活性，用含10% DMSO和20% FBS的DMEM高糖培養基將細胞濃度調整 為2X106/ml。充分混勻后，細胞懸液以Iml/管置于凍存管中，將凍存管放入程序性凍存盒 于-80°C冰箱過夜，后將凍存管移入液氮罐中保存。復蘇在液氮罐中取出凍存管并立即放入37°C的水浴箱中，Imin內快速融化，待 細胞懸液充分溶解后取出凍存管。75%的酒精消毒后，打開凍存管，用吸管將細胞懸液移入 離心管并加入10倍以上培養液，混勻后lOOOrpm/min，離心5min，棄去上清后，重復洗滌一 次。將細胞用培養基適度稀釋后，以IX IO6/瓶接種T25培養瓶中于37°C，5% CO2飽和濕 度培養箱內培養，次日更換一次培養基以去除殘留DMSO。結果如下ERCs形態學觀察原代ERCs培養24h后可零星見到單個梭形貼壁細胞，(如圖2_1所示)；培養72h 后可見少量梭形和三角形貼壁細胞；全量換液去除未貼壁雜細胞及死細胞，換液培養3-4 天后可見貼壁細胞呈單個分散或細胞集落生長，分布不均。單個細胞以梭形，三角形為主， 夾雜少數多角形和星形細胞及圓形上皮細胞等雜細胞。隨著培養時間的延長，成纖維細胞 樣細胞優勢生長，上皮細胞樣等雜細胞生長被相對抑制，細胞形態逐漸均勻。細胞培養兩周 后，原代細胞達80% -90%融合，可進行傳代。傳代后細胞6小時內即可貼壁，擴增能力較 強，細胞多為梭形和三角形。細胞培養3天后細胞形態為均一梭形細胞，細胞培養5天后細 胞達到80%融合。培養至10代后，細胞的增殖速度減慢，部分細胞體積變大，增殖能力降 低。圖2-2、2-3、2-4為選取生長狀態良好，增殖力較強的第3代ERCs進行實驗的細胞生長 圖。ERCs免疫表型鑒定流式鑒定結果顯示ERCs表現出⑶29強陽性，⑶44陽性，⑶34，⑶45，HLA-DR陰 性，低表達HLA-ABC (表達率見下表)。表明ERCs同樣表達MSCs特異性表面標記物，具有 MSCs的表型特征，流式分析結果詳見圖3。P3 代 ERCs 細胞 CD29，CD44, HLA-ABC, CD34, CD45, HLA-DR 陽性表達率(χ士 s，η = 3，% ) ERCs增殖活力檢測生長曲線結果表明，ERCs傳代培養潛伏期約為3天，細胞增殖速度緩慢；接種第5 天后進入對數生長期，細胞快速擴增；接種第7d左右開始進入平臺期，細胞增殖能力逐漸下降；P1，P3，P5代及復蘇后P3代(P3)ERCs增殖能力均無顯著差異(見圖4)，細胞均具有 良好的增殖活力。本發明所述的ERCs及其培養上清均具有對同源及異源淋巴細胞的免疫調節作 用，其試驗的詳細方法與步驟如下標本外周血由健康志愿者提供，C57小鼠于鄭州大學動物實驗中心購買人外周 血單個核淋巴細胞的分離在15ml離心管中緩慢加入適量比重為1. 077的淋巴細胞分離液，無菌狀態下取 新鮮肝素抗凝健康人靜脈外周血10_15ml，用等量PBS充分混勻，用滴管將外周血沿管壁緩 慢疊加于Ficoll分離液分層液面上，淋巴細胞分離液與稀釋后的血液的體積比為1 1; 1800r/min水平離心20min ；吸取白膜層，置入另一 15ml離心管中，加入5倍以上體積的PBS 緩沖液，充分混勻后1500r/min離心lOmin，重復洗滌細胞1次；末次離心后，棄上清，加入 含有10%胎牛血清的RPMI1640培養基，重懸細胞，調整細胞濃度為lX106/ml備用。小鼠脾單核淋巴細胞的分離取材將小鼠引頸處死，放入75%酒精中消毒。用手術剪在小鼠腹部剪一小口，從 開口處向上剪，在胸腔處橫剪，充分暴露小鼠腹腔。用鑷子夾住脾臟下方結締組織，拉開取 出脾臟。將脾臟放入PBS緩沖液中，徹底除去其它結締組織。脾單核淋巴細胞制備將滅菌后的培養皿放到冰塊上，加入15ml PBS緩沖液，將 脾臟放入含PBS緩沖液，在脾臟一側開一小口，光滑面向上。然后用磨沙玻片一端固定脾 臟，用另一玻片輕輕向外趕，直到脾臟發白為止，用移液器將細胞充分混勻后用滴管沿管壁 緩慢疊加于Ficoll分離液分層液面上進行密度梯度離心，步驟同人外周血單核淋巴細胞 的分離。ERCs與同源及異源淋巴細胞直接共培養接種將培養至P3代生長狀態良好的的ERCs消化，洗滌計數，將細胞濃度分別調 整為 lX105/ml(B、E 組)、5X104/ml(C、F組)、2X104/ml(D、G組)，充分混勻后按 IOOul/ 孔接種于96孔板。去增殖接種后于37°C，5% CO2孵箱內培養72h，待其充分貼壁后，每孔加入5ul絲 裂霉素C (濃度為lug/ul)，37°C孵育30min，棄去上清，PBS洗滌一遍。共培養人外周血淋巴細胞(或小鼠脾淋巴細胞)以IX IO5/孔接種于絲裂霉素 C處理后的ERCs上，并加入5ulPHA(濃度為lug/ul)以刺激人外周血淋巴細胞(或小鼠脾 淋巴細胞)轉化增殖(B、C、D組)。E、F、G組加入等量不經PHA刺激的人外周血淋巴細胞 (或小鼠脾淋巴細胞)。ERCs與淋巴細胞的數量比例分別為1 10、1 20,1 50。設對照取相同細胞數量并經PHA刺激的人外周血淋巴細胞(或小鼠脾淋巴細 胞)單獨培養組為陽性對照(A組)，在96孔培養板中同時以等細胞量不經PHA刺激的人外 周血淋巴細胞(或小鼠脾淋巴細胞)單獨培養組為陰性對照(H組)。以上每組設5個平行 孔。96孔板最邊緣孔加lOOulPBS緩沖液，防止各實驗組液體揮發。檢測各組于37°C，5% CO2孵箱內培養72h后，避光下每孔加入10ulCCK_8溶液， 370C 5% C02孵育2h，用多功能酶標儀在450nm波長處測定各孔光吸收值(0D值)數據經 統計軟件處理，行配對t檢驗并計算WJCs對T淋巴細胞的增殖抑制率，增殖抑制率(％)= 1-[B(C 或 D)-E(F 或 G)]/(D-A) X100%。
ERCs與同源及異源淋巴細胞間接共培養取材生長狀態良好的第三代ERCs融合80%后，進行全量換液，低血清濃度培養 48小時后收集培養上清。共培養分別用含10% FBS的RPMI 1640培養基、含有50% ERCs培養上清、含 10% FBS的ERCs培養上清將人外周血淋巴細胞(或小鼠脾淋巴細胞)濃度調整為1 X IO6/ ml,以IOOul/孔接種于96孔板，分別設為A組，B組，C組，A組為對照組。每組設5個平行 孔，每孔加入5ul PHA(濃度為lug/ul)以刺激人外周血淋巴細胞轉化增殖。檢測將96孔板置于37°C、5% CO2培養72h后，在450nm波長處使用多功能酶標 儀檢測各孔光吸收值(0D值)數據經統計軟件處理，行配對t檢驗并計算ERCs培養上清對 淋巴細胞的增殖抑制率。增殖抑制率(％) = (A-B或C)/AxlOO%。ELISA檢測ERCs培養 上清中IFN-Y表達量變化樣品準備將培養至P3代生長狀態良好的ERCs消化，洗滌計數，將細胞以5 X IO3 接種于24孔板，細胞融合達80%后，每孔加入IOul絲裂霉素C (濃度為lug/ul)，37°C孵育 30min,棄去上清，PBS洗滌二遍。人外周血淋巴細胞以2 X IO5/孔接種于絲裂霉素C處理后 的ERCs上，共培養48h后獲取未貼壁細胞，充分洗滌后將其以2 X IO5每孔接種于24孔板， 加入IOul PHA (濃度為lug/ul) (Α組)。同等接種數量的ERCs單獨培養組設為B組，經PHA 刺激增殖的人外周血淋巴細胞單獨培養組設為C組，各組培養24h后收集細胞上清備用。試劑準備標準品配制使用前每管中加入400ul蒸餾水溶解即可。洗滌液用重蒸水1 20稀釋。底物工作液配制顯色前10分鐘將OPD片放入底物稀釋液中溶解，每片加液5ml。實驗步驟1、實驗開始前20分鐘將試劑盒從冰箱取出，以平衡至室溫(20-25°C )2、建立標準曲線設8個標準孔，每孔各加入IOOul樣品稀釋液，第一孔加標準品 lOOul，混勻后用加樣器吸出lOOul，移至第二孔。如此反復做倍比稀釋至第七孔，最后，從第 七孔中吸出IOOul棄去，使各孔體積均為lOOul。第八孔為空白對照。樣品稀釋時，均需混 勻，混勻時盡量避免起泡。3、加樣每孔分別加入IOOul各組培養上清，每組設三個平行孔。4、將反應板置于37°C，120分鐘，棄去孔內液體，向濾紙上印干5、洗板，每孔加200ul洗滌液，將反應板洗滌4-6次，每次浸泡2分鐘，棄去洗滌液 向濾紙上印干。6、每孔加入第一抗體工作液50ul，將反應板充分混勻后置37°C，放置60分鐘。7、洗板同步驟5。8、每孔加入IOOul酶標抗體工作液，將反應板置于37°C，放置60分鐘。9、洗板，同步驟5。10、每孔加入IOOul底物工作液，置37°C避光放置5-10分鐘。11、每孔加入50ul終止液，充分混勻后用多功能酶標儀在492nm處測吸光值。結果計算與判斷以標準品1000、500、250、125、62. 5、31. 25、15. 62、0pg/ml 之 OD 值在半對數紙上作圖，繪制標準曲線。將濃度作為X軸(對數軸)，OD值作為Y軸(線性
8軸)。根據測得各組培養上清的OD值(測得OD值要減去空白對照孔OD值)在標準曲線上 查出相應的IFN-Y含量。結果如下ERCs對同源及異源淋巴細胞的增殖抑制作用根據多功能酶標儀測得各組OD值，計算ERCs對PHA作用下的淋巴細胞增殖抑制 率(η = 3)，結果顯示，不同數量ERCs無論對PHA刺激下同源人外周血淋巴細胞或異源小鼠 脾淋巴細胞均具有明顯的的抑制作用(P <0.01)；對異源小鼠脾淋巴細胞的抑制作用稍低 于對同源人外周血淋巴細胞的抑制作用。如圖5-1所示。ERCs培養上清對同源及異源淋巴細胞的增殖抑制作用根據多功能酶標儀測得各組OD值，計算ERCs培養上清對PHA作用下的淋巴細胞 增殖抑制率(η = 3)，結果顯示，ERCs培養上清同樣可以抑制PHA刺激下的同源及異源淋巴 細胞的增殖(P < 0. 05)，對異源小鼠脾淋巴細胞的抑制作用同樣稍低于對同源人外周血淋 巴細胞的抑制作用。如圖5-2所示。ERCs對人外周血淋巴細胞IFN- γ的分泌的影響ELISA對在ERCs存在有無的情況下PHA刺激的人外周血淋巴細胞培養上清及 ERCs培養上清中的IFN-Y的含量進行了檢測。結果顯示在有ERCs存在的情況下，與單 純PHA作用下人外周血淋巴細胞相比，人外周血淋巴細胞對細胞因子IFN-Y的分泌明顯下 降(P < 0. 01)。如圖6所示(Α 單獨ERCs培養組，B =ERCs+人外周血淋巴細胞培養組，C 人外周血淋巴培養組)
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權利要求
一種經血源性間充質干細胞分離培養，其特征在于它包括下述步驟第一步培養基的配制每390ml DMEM高糖培養基加入100ml滅活后的胎牛血清、5ml 10000U/ml的青/鏈霉素及5ml 0.25mg/ml的兩性霉素B，得到體積為500ml的培養基備用；第二步經血源性間充質干細胞的分離與培養材料獲取取月經血5ml，加入0.2ml 0.25mg/ml的兩性霉素B、0.2ml青/鏈霉素，0.1mlEDTA Na2防止病原微生物污染，在材料獲取24 48h內進行下述細胞分離；細胞分離在15ml離心管中緩慢加入5ml比重為1.077的淋巴細胞分離液，將經血與等量PBS緩沖液充分混勻后，用滴管沿管壁緩慢疊加于淋巴細胞分離液分層液面上，細胞懸液與分離液兩者比例為1∶1或2∶1；2000rpm/min水平離心20min；離心后管內液體分為四層，上層為血漿和PBS緩沖液，下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層交界處有單核細胞層；用移液器吸取單核細胞層置入另一15ml離心管中，加入5倍以上體積的PBS緩沖液，1200rpm/min離心10min，洗滌兩次；末次離心后，棄上清，用5ml培養基充分混勻后置于T25培養瓶中，于37℃、體積分數為5％CO2、飽和濕度培養箱臥式培養；換液細胞培養三天后，將培養瓶取出，棄去其它類型雜細胞及未貼壁細胞，每3 4天全量換液1次；傳代待細胞達到80％～90％融合時，進行傳代，貼壁細胞用PBS洗滌2次，再用含有0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA的細胞消化液于37℃消化30秒到1分鐘，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待細胞大部分胞體回縮、變圓，即加入少量血清終止消化；然后加適量PBS緩沖液，用吸管反復吹打使細胞絕大部分脫落后，將細胞懸液移入15ml離心管，1000r/min，離心5min，棄去上清，后用培養基制成細胞懸液，充分混勻后按1∶3比例傳代培養，記為P1代；傳代培養過程中每3 4天全量換液一次，貼壁細胞再次融合鋪滿瓶底后，重復上述操作，記為P2代，以此類推。
2.根據權利要求1所述的經血源性間充質干細胞的免疫調節作用，其特征在于所述 經血源性間充質干細胞及培養上清對同源及異源淋巴細胞具有免疫調節作用。
全文摘要
本發明公開了一種經血源性間充質干細胞(ERCs)分離培養及其免疫調節作用。本發明采用密度梯度離心法從經血中成功分離出ERCs，并對其特異性表面標記及增殖活力進行了檢測，建立了該細胞穩定的培養方法，由于來源廣泛，取材方便，可以無創傷獲取，不涉及倫理問題，為MSCs的臨床應用提供了新的替代來源，具有良好的應用前景。同時，經研究還發現，ERCs及培養上清對同源及異源淋巴細胞都具有免疫調節作用，ERCs能顯著降低人外周血淋巴細胞IFN-γ的分泌。表明ERCs免疫調節作用機制可能與細胞間的直接接觸及抑制淋巴細胞IFN-γ的分泌有關，為減少異體移植引起的免疫排斥反應及治療自身免疫系統疾病提供理論依據。
文檔編號C12N5/0781GK101914494SQ20101023717
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月27日 優先權日2010年7月27日
發明者關方霞, 周云帆, 周長輝, 戴建武, 楊波, 田毅, 谷晨熙 申請人:鄭州大學