專利名稱：一種檢測黃牛mgat2基因單核苷酸多態(tài)性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)的檢測，特別涉及 一種檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法。
背景技術(shù)：
基因多態(tài)性是指不同物種或者同一物種內(nèi)的不同個體間基因組序列的差異，這些 差異是由于染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要是包括堿基的替換、插入、缺失 以及重復(fù)序列拷貝數(shù)的變化。單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)是由美國麻省理工學(xué) 院的人類基因組研究中心的學(xué)者Lander(1996)提出的一類遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，就是指基因組 DNA序列中由于單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態(tài)性。它的變異形式有顛換、轉(zhuǎn) 換、插入和缺失等，主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換或者顛換所引起。具有轉(zhuǎn)換型的堿基變異的SNPs 約占2/3。根據(jù)基因組中單核苷酸多態(tài)性產(chǎn)生的位置，可分為以下3類基因編碼區(qū)單核苷 酸多態(tài)性(Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周邊單核苷酸多態(tài)性(Perigenic SNPs, pSNPs)以及基因間單核苷酸多態(tài)性(Intergenic SNPs，iSNPs)。研究表明，位于編碼區(qū)內(nèi)的cSNP比較少，由于它在遺傳性疾病研究中卻具有重要 意義，因此，編碼區(qū)內(nèi)的cSNP的研究更受關(guān)注?；蚓幋a區(qū)內(nèi)的cSNP又可分為2種一 種是編碼區(qū)內(nèi)的同義cSNP (Synonymous cSNP)，即SNP所致編碼序列的改變并不會影響其 所翻譯的蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改變；另一種是編碼區(qū)內(nèi)的非同義cSNP (Non-Synonymous cSNP)，即堿基序列的改變將導(dǎo)致編碼氨基酸的改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)中氨基酸序列的改 變，可能最終影響到蛋白質(zhì)的功能。分子育種，即分子標(biāo)記輔助選擇育種(Molecular Mark-Assist Selection, MAS)，該技術(shù)是借助DNA分子標(biāo)記對遺傳資源或育種材料進(jìn)行選擇，對畜禽的綜合性狀進(jìn) 行品種改良，它是利用現(xiàn)代分子生物學(xué)和傳統(tǒng)遺傳育種相結(jié)合的方法，進(jìn)行新品種選育。在 肉牛育種中，人們期望，通過對生長性狀密切相關(guān)，并且與數(shù)量性狀緊密連鎖的DNA標(biāo)記的 選擇，達(dá)到早期選種和提高育種值準(zhǔn)確性的目的，從而在畜禽育種中獲得更大的遺傳進(jìn)展。分子遺傳標(biāo)記輔助選擇就是將現(xiàn)代生物技術(shù)與常規(guī)選擇方法相結(jié)合，通過對遺傳 標(biāo)記的選擇來間接選擇控制某性狀的數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，使之能夠同時利用標(biāo)記位點(diǎn)信 息和數(shù)量性狀的表型信息，更準(zhǔn)確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，加快育種進(jìn)展。 標(biāo)記輔助選擇主要經(jīng)歷了三個階段第一階段是家畜各性狀間的遺傳分析；第二階段是蛋 白質(zhì)(酶)標(biāo)記對數(shù)量性狀的標(biāo)記階段；第三個階段是分子遺傳標(biāo)記階段。隨著分子標(biāo)記 技術(shù)日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標(biāo)記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實(shí)現(xiàn) 分子標(biāo)記輔助選擇的目標(biāo)。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism, SNP)作為 新的遺傳標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。MGAT2基因是脂肪沉積過程中合成二酰甘油(DAG)的重要基因。食物中的脂肪要
3進(jìn)入體內(nèi)，必須在胰脂肪酶的作用下發(fā)生水解，水解的代謝產(chǎn)物脂肪酸、2-單酰甘油在單酰 甘油轉(zhuǎn)移酶(MGAT)的催化作用下再合成DAG，進(jìn)而被二酰甘油轉(zhuǎn)移酶(DGAT)催化合成三 酰甘油(TAG)而儲存在體內(nèi)。MGAT催化合成DAG，是合成TAG的第一步，因而在一定程度上 MGAT決定了食物中的脂肪能否被機(jī)體所吸收，此外，MGAT催化合成的DAG是合成磷脂的前 體，同時，DAG還是細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子?？傊琈GAT2基因與脂肪代謝、脂類在組織中的 沉積以及細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，因此，研究中國地方黃牛MGAT2基因的遺傳變異和 分子遺傳特征具有重要的理論和實(shí)踐意義。目前，對于MGAT2基因的研究多在小鼠和人類上，并主要對其功能進(jìn)行了大量研 究。中國地方黃牛MGAT2基因遺傳變異領(lǐng)域的研究匱乏，該基因位點(diǎn)的功能研究及其遺傳 變異與經(jīng)濟(jì)性狀(如體重、日增重等性狀)關(guān)聯(lián)的研究仍是空白。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的問題在于提供一種檢測的黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法， 尋找與經(jīng)濟(jì)性狀關(guān)聯(lián)的SNP作為分子標(biāo)記，加快具有優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)性狀黃牛種群的建立。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含MGAT2基因的待測黃牛 全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛MGAT2基因；用限制性內(nèi)切酶HaeIII 消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電 泳結(jié)果鑒定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游弓丨物:cttgaaacgg caacccaccc act 23bp ；下游弓丨物agcccagcct gccttacgta aggc 24bp0所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 4min ；94°C變性 30s，69°C退火 30s，72°C延伸 15s，30 35 個循環(huán)； 72°C延伸 IOmin0所述的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為3%瓊脂糖凝膠電泳。所述根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態(tài)性 為TT基因型表現(xiàn)為237bp條帶；TG基因型表現(xiàn)為237bp和213bp條帶；GG基因型表現(xiàn) 為213bp條帶。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果本發(fā)明根據(jù)MGAT2基因的序列設(shè)計引物，分別以3種黃牛品種的基因組DNA為模 板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序后得到的黃牛MGAT2基因的部分序列與 NCBI公布的序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在MGAT2基因的第495位存在SNP多態(tài)性。當(dāng)MGAT2基因 第495位的T突變?yōu)镚時，導(dǎo)致編碼第28位的密碼子由ATT突變?yōu)锳TG，從而形成錯義密碼 子突變，即由28Ile突變?yōu)?8Met，這樣使得翻譯過程中所編碼的氨基酸發(fā)生了改變。針對上述第495位的SNP多態(tài)性，本發(fā)明還公開了其篩查和檢測方法，通過設(shè)計特 定的引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，用特定的限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，能夠簡單、快速、成本低、精 確的檢測其單核苷酸的多態(tài)性當(dāng)495bp由T突變?yōu)镚時，PCR擴(kuò)增MGAT2基因產(chǎn)物的第494bp 498bp序列為GGCC，形成了限制性內(nèi)切酶HaeIII的酶切位點(diǎn)，當(dāng)在495位點(diǎn)不突變時，PCR擴(kuò)增MGAT2基 因產(chǎn)物的第494bp 498bp序列為TGCC，限制性內(nèi)切酶HaeIII不能識別；這樣就可以對該 位點(diǎn)SNP多態(tài)性進(jìn)行檢測。由于MGAT2基因功能涉及初生重、體重、日增重、體高、體重、體 斜長、坐骨端寬等生長性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為MGAT2基因的SNP與黃牛部分生長性 狀(初生重、體重和日增重)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明該位點(diǎn)能夠作為提高黃牛早期體重的 分子標(biāo)記。以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優(yōu)良 的黃牛種群。
圖1為黃牛MGAT2基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；圖2為黃牛MGAT2基因包含第495位的多態(tài)位點(diǎn)的237bp PCR產(chǎn)物的HaeIII酶 切電泳結(jié)果；圖3a、圖3b和圖3c為黃牛MGAT2基因SNP的不同基因型測序圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過對黃牛MGAT2基因第495位點(diǎn)錯義突變可能產(chǎn)生編碼蛋白構(gòu)象發(fā)生 變化的單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速 建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。下面結(jié)合具體樣本的檢測和性狀關(guān)聯(lián)對本發(fā)明做進(jìn)一步的 詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。a、黃牛MGAT2基因含第一外顯子區(qū)域PCR引物的設(shè)計以 NCBI 所公布的牛(NC_007313. 4，Region :54835024_54847263)序列為參考，利 用Primer 5. 0設(shè)計能夠擴(kuò)增包含黃牛MGAT2基因第一外顯子區(qū)域的PCR引物，其引物序列 如下上游弓丨物:cttgaaacgg caacccaccc act 23 ；下游弓丨物agcccagcct gccttacgta aggc 24 ；以上述引物對黃?；蚪M擴(kuò)增，能夠擴(kuò)增包含黃牛MGAT2基因(NC_007313. 4序 列)5' UTR及第一外顯子區(qū)域第283bp 519bp的237bp的基因片段，擴(kuò)增后片段的電泳 檢測如圖1所示，其中，泳道1 6為檢測片段，泳道M為Marker ；對擴(kuò)增的片段進(jìn)行測序 鑒定后，其中，第471bp 519bp的序列為如下所示CCTGTACTGG ATCTTCTGCT TC !^ΤΤ| GCCTT ACGTAAGGCAGGCTGGGCT ；經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)MGAT2基因第一外顯子區(qū)域第495位(即MGAT2基因⑶S區(qū)第84 位)存在SNP多態(tài)性當(dāng)MGAT2基因第495位的T突變?yōu)镚時，導(dǎo)致編碼第28位的密碼子由 ATT(如框線所示序列)突變?yōu)锳TG，從而形成錯義密碼子突變，即由28Ile突變?yōu)?8Met。當(dāng)495bp由T突變?yōu)镚時，PCR擴(kuò)增MGAT2基因產(chǎn)物的第494bp 498bp序列為 GGCC，形成了限制性內(nèi)切酶HaeIII的酶切位點(diǎn)，當(dāng)在495位點(diǎn)不突變時，PCR擴(kuò)增MGAT2基 因產(chǎn)物的第494bp 498bp序列為TGCC，限制性內(nèi)切酶HaeIII不能識別；這樣就可以對該 位點(diǎn)SNP多態(tài)性進(jìn)行檢測。b、以引物P進(jìn)行PCR擴(kuò)增待測黃牛的MGAT2基因片段1、黃牛樣本的采集本發(fā)明具體以3個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體采集樣本見表1 陜西秦川牛(265)，河南平頂山市郟縣紅牛(428)，河南南陽牛(250)。表1黃牛樣本的采集及其來源
品種樣品 數(shù)樣品名 稱樣品來源采樣方式秦川牛 (QC cattle)265血樣采自陜西省秦川牛場、陜西省秦川牛良 種繁育中心和陜 西省大荔縣靜脈采血 16號針 頭郟縣紅牛 (JX cattle)428血樣采自河南省平頂山市郟縣紅牛育種中 心及各村鎮(zhèn)靜脈采血 16號針 頭南陽牛 (NY cattle)250血樣采自河南省南陽市黃牛良種繁育場(國 家級黃牛保種 場)靜脈采血 16號針 頭2、血樣基因組DNA的分離、提取、純化1)冷凍血樣(主要為血細(xì)胞)室溫解凍，轉(zhuǎn)移500 μ L至1. 5mL Eppendorf離心 管，加入等體積PBS液，充分混勻，12000r/min離心IOmin (4°C )，棄去上清液，重復(fù)上述步驟 至上清液透明、沉淀呈淡黃色；2)在離心管中加入DNA抽提緩沖液500 μ L，搖動，使血細(xì)胞沉淀脫離離心管管壁， 37°C 水浴 Ih ；3)加蛋白酶K至3yL(20mg/mL)并混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補(bǔ)加 ι μ L蛋白酶κ混勻繼續(xù)消化直至澄清；4)將反應(yīng)液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 μ L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻；4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中，重復(fù)一次；5)加氯仿500 μ L，充分混勻20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另 一 1. 5mL離心管中；6)加氯仿、異戊醇混合液(24 1) 500 μ L，充分混勻20min, 4°C，12000r/min離心 lOmin，將上清液轉(zhuǎn)入另一 1. 5mL離心管中；7)加0. 1倍體積的NaAc緩沖液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉(zhuǎn)動離心管， 直至白色的絮狀沉淀析出，_20°C保存30 60min ；8) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀2次；9) 40C，12000r/min離心lOmin，棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈；10)干燥后的DNA溶于80 IOOyL的TE液，4°C保存直至DNA完全溶解，0.8%瓊 脂糖凝膠電泳檢測其質(zhì)量，-80°C保存。11) 500 μ L的DNA溶液中加入10% SDS使其終濃度為0. 1 %，加入蛋白酶K至終濃 度達(dá)到50 μ g/mL ；12) 5 °C 保溫 IOh 左右；13)等體積苯酚、氯仿、異戊醇(25 24 1)和氯仿分別抽提一次；14) 12000r/min離心5min分相，吸取上層水相至另一離心管中；15)加入1/10體積3mol/L醋酸鈉和2倍體積冰冷無水乙醇沉淀DNA ；16)倒掉液體，70%乙醇洗滌后晾干，加入60 μ L滅菌超純水溶解，4°C待檢測。3、PCR 擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系采用混合加樣法，即根據(jù)每一個反應(yīng)體系所需的各種組分的數(shù)量和 1次反應(yīng)所需的PCR反應(yīng)的個數(shù)，算出各種反應(yīng)組分的總量，加入到1個1. 5mL離心管中，充
6分混勻后瞬時離心，再分裝到每個0. 2mLEppendorf PCR管中，然后加入模板DNA，再瞬時離 心后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；15 μ L PCR反應(yīng)體系為包括0. 375U Taq DNA聚合酶(北京天根科技有限公司)， 2 X Buffer 7. 50 μ L (內(nèi)含 Mg2+、dNTPs 等)(北京天根科技有限公司 Mix)，50ng/ μ L 含 MGAT2 基因的黃牛基因組DNA 0. 50 μ L, IOpmol/μ L上、下游引物各0. 30 μ L ；具體為滅菌超純水(H2O)，6·25 μ L ;2 XBuffer(內(nèi)含 Mg2+、dNTPs 等)，7. 50 μ L ； 引物 P 上游引物(10pmol/L) yL，0. 30 ；引物 P 下游引物(10pmol/L)，0. 30 μ L ;Taq DNA 聚 合酶(2. 5U/ μ L) ,0. 15 μ L ；DNA 模板(50ng/ μ L) ,0. 50 μ L ；總體積 15. 00 μ L。PCR反應(yīng)程序95°C 預(yù)變性 5min;
94°C 變性 30 s，
69.0°〇退火30 3，I 30 35個循環(huán)；
72 0C 延伸 15 s，-72°C延伸 IOmin ；4°C保存。對3個黃牛品種的943個樣本的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得943個個體的黃 牛MGAT2基因中包含該SNP位點(diǎn)的237bp的DNA片段。c、HaeIII酶切消化PCR擴(kuò)增的MGAT2基因片段1、HaeIII酶切反應(yīng)消化體系(25 30 μ L) 10 ~ 15μ L PCR產(chǎn)物，IOX緩沖液 (含 BSA)2.5 3.0yL，HaeIII(10U/yL)1.0 1. 5 μ L，滅菌純水(H2O) 11. 5 ~ 16. 5 μ L02、酶切消化條件37°C恒溫培養(yǎng)箱中消化5 10h。d、HaeIII消化PCR產(chǎn)物后瓊脂糖凝膠電泳分析1)制作3%的瓊脂糖凝膠，點(diǎn)樣后120V電壓電泳60min，電泳結(jié)束后EB染色；2)待分子量不同的DNA片段分離清晰時，在BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng) 成像；3)根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析SNP多態(tài)性用BIO-RAD Gel Doc 2000凝膠成像系統(tǒng)照相分析，判斷SNP的多態(tài)性MGAT2基因的第495bp由T突變?yōu)镚時，PCR擴(kuò)增的MGAT2基因產(chǎn)物的第494bp 498bp序列為GGCC，限制性內(nèi)切酶HaeIII識別后在GG/CC對擴(kuò)增片段酶切，將擴(kuò)增片段切 為2段；而MGAT2基因的第495bp沒有發(fā)生突變，限制性內(nèi)切酶HaeIII不能識別，擴(kuò)增片段 不能被切割；由于黃牛為2倍體，所以黃牛基因組的MGAT2基因的第495位的SNP的多態(tài)性的 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果為TT基因型表現(xiàn)為237bp條帶；TG基因型表現(xiàn)為237bp和213bp條帶；GG基因型表 現(xiàn)為213bp條帶；由于25bp較小，在瓊脂糖電泳分析中不太清楚，但通過237bp和213bp這 兩條條帶還是能夠準(zhǔn)確的鑒別TT基因型、TG基因型和GG基因型不包含213bp條帶的為 TT基因型個體；不包含237bp條帶為GG基因型個體；同時包含237bp和213bp條帶為TG 基因型個體。
如圖2所示的酶切后的凝膠電泳檢測結(jié)果，其中，泳道4包含237bp和213bp條 帶，其為TG基因型個體，泳道1、泳道3、泳道5、泳道6和泳道7不包含213bp條帶，為TT基 因型個體，泳道2不包含237bp條帶，為GG基因型個體，泳道M為Marker I (600bp, 500bp, 400bp,300bp,200bp,IOObp)。4)不同基因型個體PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證對不同基因型個體PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行正反雙向測序；同時，進(jìn)行SNP位置分析，結(jié) 果表明包含237bp和213bp條帶的雜合子TG基因型個體其495位的測序圖的確表示為T 或G，如圖3a所示，自左向右第8個峰為兩個峰，而GG基因型、TT基因型分別為G、T，如圖 3b、3c所示。 e、黃牛MGAT2基因SNP位點(diǎn)的頻率統(tǒng)計分析1)基因和基因型頻率基因型頻率是指一個群體中某一性狀的某種基因型個體數(shù)占總個體數(shù)的比率。 Ptt = Νττ/Ν，其中Ptt代表某一位點(diǎn)的TT基因型頻率；Ntt表示群體中具有TT基因型的個體 數(shù)；N為檢測群體的總數(shù)量?；蝾l率是指一個群體中某一基因數(shù)對其等位基因總數(shù)的相對比率。計算的公式
可以寫成PT = (2NTT+NTal+NTa2+NTa3+NTa4+……+NtJ/2N式中，Pt表示等位基因T頻率，Ntt表示群體中具有TT基因型的個體數(shù)量，Nlai表 示群體中具有Tai基因型個體數(shù)量，al-an為等位基因T的η個互不相同的復(fù)等位基因。本研究所涉及的等位基因?yàn)門和G，所以具體的基因頻率計算公式為Pg = (2Ngg+Ntg) /2NPt = (2Ntt+Ntg) /2N式中，PT，Pg分別表示等位基因T和G等位基因的頻率，Ntt、Ntc和Nee分別表示TT、 TG和GG基因型的個體數(shù)量，N表示總?cè)后w數(shù)目。如表2所示的基因頻率分布表，在不同黃牛品種MGAT2基因SNP中的T等位基因 頻率變化幅度在69. 0% 87. 4%，G等位基因頻率變化幅度在12. 6% 31. 0%之間。表2黃牛MGAT2基因第495位SNP基因頻率分布表
黃牛品種基因型的觀測數(shù)目總計等位基因頻率TTTGGG943TG秦川牛2035752650.8740.126郟縣紅牛246171114280.7750.225南陽牛118109232500.6900.310
f、黃牛MGAT2基因SNP位點(diǎn)基因效應(yīng)的關(guān)聯(lián)分析基因型數(shù)據(jù)=HaeIII識別的基因型(TT、TG和GG)生產(chǎn)數(shù)據(jù)南陽牛初生重，以及6月齡、12月齡、18月齡和24月齡的體重和日增重 數(shù)據(jù)。關(guān)聯(lián)分析模型先對數(shù)據(jù)進(jìn)行描述分析，確定是否存在離群值，再利用最小二乘分析對數(shù)據(jù)校正； 根據(jù)數(shù)據(jù)特征，應(yīng)用SAS(9. 1)軟件的GLM過程分析基因型和瓶中對各性狀效應(yīng)。在對基因
型效應(yīng)進(jìn)行分析時采用了固定模型Yijkl = μ +BFi+Monthj+Gk+e^其中Yukl為性狀觀察值，μ為總體均值，BFi為第i個品種和農(nóng)場的固定效， Monthj為第j個月觀測的固定效應(yīng)，Gk為第k個單SNP標(biāo)記基因型的固定效應(yīng)，eiJkl為隨機(jī) 誤差。結(jié)果表明(見表3)在6月齡TT基因型的個體體重和日增重均高于GG和TG基 因型個體且TT基因型與GG基因型間差異到達(dá)了顯著(P <0.05)；而在出生重和12、18、24 月齡三種基因型的個體在體重和日增重性狀上差異不顯著(P >0.05)。說明TT基因型可 以作做為一個提高黃牛早期體重和日增重的候選分子遺傳標(biāo)記。表3MGAT2基因第495位多態(tài)位點(diǎn)與南陽牛各月齡體重和日增重之間的方差分析
年齡生長性狀第495位SNP基因型GG (Mean士 SE)TG (Mean 士 SE)TT (Mean士SE)出生體重(kg)29. 85 ±0. 70829. 463 + . 35430. 2806月齡體重Ckg)143. 300±6· 013β155. 550±3. 007ab160. 313±2. 377a曰增重(kg)0. 630 ±0. 0324b0. 700±0. 0162ab0. 724±0. 0128a12月齡體重Ckg)215. 000±6· 794218. 275±3. 397225. 281 ±2. 686日增重(kg)0. 398±0. 03840. 348±0. 01920. 361±0. 015218月齡體重(kg)299. 900 + 9. 498292. 525±4. 749299. 953 士 3. 754曰增重(kg)0. 472±0· 05080. 413±0. 02540. 415±0. 020124月齡體重Ckg)359. 000±12. 657356. 975±6. 329369. 375 ±5. 003日增重(kg)0. 328±0. 03820. 358±0. 01910. 386±0. 0151 注具有相同字母表示差異不顯著(P >0.05)，字母不同表示差異顯著(P < 0. 05)。
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權(quán)利要求
一種檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，以包含MGAT2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛MGAT2基因；用限制性內(nèi)切酶HaeIII消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態(tài)性；所述的引物對P為上游引物cttgaaacgg caacccaccc act 23bp；下游引物agcccagcct gccttacgta aggc24bp。
2.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述 的PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性4min ；94°C變性30s，69°C退火30s，72°C延伸15s，30 35個循環(huán)；72°C延 伸 IOmin0
3.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，所述 的瓊脂糖凝膠電泳為質(zhì)量濃度為3 %瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權(quán)利要求1所述的檢測黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法，其特征在于，根據(jù) 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態(tài)性為TT基因型表現(xiàn)為 237bp條帶；TG基因型表現(xiàn)為237bp和213bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為213bp條帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測的黃牛MGAT2基因單核苷酸多態(tài)性的方法，以包含MGAT2基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴(kuò)增黃牛MGAT2基因；用限制性內(nèi)切酶HaeIII消化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物之后，再對酶切后的擴(kuò)增片段進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果鑒定黃牛MGAT2基因第495位的單核苷酸多態(tài)性。由于MGAT2基因功能涉及體重、日增重生長等性狀，本發(fā)明提供的檢測方法為MGAT2基因的SNP與生長性狀關(guān)系的建立奠定了基礎(chǔ)，以便用于中國黃牛肉用生長性狀的標(biāo)記輔助選擇，快速建立遺傳資源優(yōu)良的黃牛種群。
文檔編號C12Q1/68GK101921848SQ20101023690
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月26日
發(fā)明者劉俊霞, 屈煉, 楊明娟, 藍(lán)賢勇, 陳宏 , 雷初朝 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)