專利名稱：利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型重組衣殼蛋白亞單位疫苗的方法及其產(chǎn)品的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型重組衣 殼蛋白亞單位疫苗的方法及其產(chǎn)品。
背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus II，PCV2)屬于圓環(huán)病毒科 (circoviridae)圓環(huán)病毒屬(circovirus)，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)感染可損傷豬的免疫 系統(tǒng)，引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等豬圓環(huán)病毒性疾病(Porcine cirvovirus disease,PCVD)0豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)開放性閱讀框2 (0RF2)編碼病毒衣殼蛋白(Cap)， 大小約為30KDa。Cap蛋白上存在抗原表達(dá)位點(diǎn)，具有免疫原性，因此成為PCV2特異性血清 學(xué)檢測(cè)方法和亞單位疫苗、核酸疫苗的基礎(chǔ)。專利CN101180406A中，公開了利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中生產(chǎn)PCV2 Cap蛋白的方法。然而，市售的昆蟲細(xì)胞以及細(xì)胞培養(yǎng)基價(jià)格昂貴，而且大規(guī)模培養(yǎng)細(xì)胞需 要購(gòu)置專門的細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器，投資很大，生產(chǎn)過(guò)程中易受環(huán)境條件的污染，而且細(xì)胞 培養(yǎng)獲得重組蛋白產(chǎn)物翻譯后修飾不能有效進(jìn)行，細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)外源蛋白的效率相對(duì)比較 低。這些都限制了 PCV2 Cap蛋白在昆蟲細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)和應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒 2型重組衣殼蛋白亞單位疫苗的方法，包括以下步驟A克隆豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的0RF2基因，與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體連接，獲得重組 轉(zhuǎn)移載體；B重組轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)物上清經(jīng)噬斑篩選，獲得重組 桿狀病毒；C重組桿狀病毒感染家蠶幼蟲或蠶蛹，在家蠶幼蟲或蠶蛹中表達(dá)重組豬圓環(huán)病毒 2型衣殼蛋白；D回收重組病毒感染的家蠶幼蟲或蠶蛹的血淋巴；E分離純化血淋巴中的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白；F利用純化的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白，輔以佐劑，制備豬圓環(huán)病毒2型亞單 位疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟A中豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的0RF2基因序列包含序列表中 的 SEQ ID NOl。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟B中所述重組桿狀病毒中豬圓環(huán)病毒2型0RF2基因的表達(dá)受 多角體啟動(dòng)子的控制。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟B中所述昆蟲細(xì)胞包括家蠶卵巢細(xì)胞。
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優(yōu)選地，本發(fā)明步驟B中所述的桿狀病毒包括家蠶核型多角體病毒。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟C中所述的家蠶品種包括箐松X皓月或與之相一致的家蠶品 種。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟E中所述的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白序列包含序列表中 的 SEQID N02。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟E中所述的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白為如下三種多肽的 任意一種i)選自序列表中的SEQ ID N02序列的多肽；ii)與i)所述多肽至少80%同源的多肽；iii)i)和ii)所述多肽的免疫原性部分。優(yōu)選地，本發(fā)明步驟F中所述的佐劑為水性佐劑或油性佐劑。本發(fā)明另一方面在于使用本發(fā)明方法生產(chǎn)的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白。本發(fā)明又一方面在于使用本發(fā)明方法的豬圓環(huán)病毒2型重組衣殼蛋白亞單位疫
田ο優(yōu)選地，本發(fā)明方法制備的疫苗每頭份包含至少0. 5微克重組豬圓環(huán)病毒2型衣 殼蛋白。技術(shù)效果本發(fā)明使用了家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)PCV2 Cap蛋白，與采用細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)有技術(shù)相 比，具有很大的優(yōu)越性。首先，我國(guó)已有5000多年的養(yǎng)蠶業(yè)歷史，有豐富的家蠶資源。家蠶易于飼養(yǎng)，成本 低廉；其次家蠶生產(chǎn)蛋白，翻譯后修飾效率高，并且能分泌到血液中，分離純化比較容易。而 且家蠶的血淋巴具有儲(chǔ)存蛋白的能力，淋巴內(nèi)含有蛋白分解酶的抑制物，對(duì)目的蛋白起到 保護(hù)作用。家蠶生產(chǎn)蛋白的效率要遠(yuǎn)高于細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)效率，而且又很容易從家蠶體內(nèi)分 離純化出來(lái)。其次，本發(fā)明構(gòu)建的重組家蠶核型多角體病毒(BmNPV)，帶有完整的PCV2 Cap蛋 白目的基因，位于家蠶核型多角體基因啟動(dòng)子控制下，具有極晚期表達(dá)和表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)。 利用本發(fā)明的家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)PCV2 Cap蛋白的方法，安全可靠，適合大規(guī)模生產(chǎn)，為大 量生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型特異性血清學(xué)檢測(cè)抗原和豬圓環(huán)病毒2型疫苗的抗原成分Cap蛋白 提供了基礎(chǔ)。
圖1為重組家蠶核型多角體病毒構(gòu)建流程圖；圖2為SDS-PAGE鑒定重組PCV2 Cap蛋白的表達(dá)；圖3為Western blot鑒定重組PCV2 Cap蛋白的表達(dá)；圖4為重組PCV2 Cap蛋白表達(dá)量的測(cè)定。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明實(shí)施例中昆蟲細(xì)胞使用了家蠶卵巢細(xì)胞(BmN)，其他類型的昆蟲細(xì)胞，如家 蠶胚胎細(xì)胞，也可使用本發(fā)明之方法生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白亞單位疫苗。
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本發(fā)明實(shí)施例中使用的家蠶品種為箐松X皓月，其他與之相一致的家蠶品種，如 白玉X秋風(fēng)、蘇鎮(zhèn)X春光、皓月X箐松、871Χ872、57Α·57ΒΧ24·26等，也可使用本發(fā)明 之方法生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白亞單位疫苗。本發(fā)明實(shí)施例中使用的佐劑為ISA206油性佐劑，本領(lǐng)域其他類型的水性佐劑或 油性佐劑，及本領(lǐng)域常用的其他乳化方法，也可使用本發(fā)明之方法生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型衣 殼蛋白亞單位疫苗。本發(fā)明實(shí)施例中優(yōu)選了疫苗成品豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的含量為0. 2微克/頭 份、0. 5微克/頭份、1微克/頭份、2微克/頭份、5微克/頭份、10微克/頭份和15微克/ 頭份。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，當(dāng)劑量大于0.5微克時(shí)即可以對(duì)豬產(chǎn)生良好的免疫效果。本發(fā) 明術(shù)語(yǔ)頭份的含義為一般情況下，免疫一頭牲畜所需的疫苗用量。本實(shí)施例中構(gòu)建的重組家蠶核型多角體病毒，帶有完整的PCV2Cap蛋白基因，位 于家蠶核型多角體基因啟動(dòng)子控制下，多角體基因被PCV2 Cap蛋白基因取代，具有極晚期 表達(dá)和表達(dá)量高的優(yōu)點(diǎn)。在家蠶卵巢細(xì)胞、幼蟲和蠶蛹中，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot鑒定，結(jié)果表明構(gòu)建的重組家蠶核型多角體病毒能夠高效表達(dá)PCV2Cap蛋白，大小約 為28kDa。純化的重組PCV2 Cap蛋白輔以佐劑，制備PCV2 Cap蛋白亞單位疫苗。通過(guò)仔豬 攻毒試驗(yàn)，驗(yàn)證該亞單位疫苗僅包含0. 5微克/頭份的重組PCV2 Cap蛋白就具有很好的免 疫保護(hù)作用。本發(fā)明實(shí)施例中重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白為序列SEQ IDN02的多肽；使用本 發(fā)明之方法還可生產(chǎn)如下重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白與所述選自序列SEQ ID N02的多 肽至少80%同源的多肽及上述多肽的免疫原性部分。制備上述多肽的實(shí)施例方法與過(guò)程 與本發(fā)明實(shí)施例相同，下面不再累述。為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。實(shí)施例1家蠶桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白1)克隆豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的基因序列0RF2，與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體連接，獲 得重組轉(zhuǎn)移載體；提取PCV2-SH株(保藏號(hào)為CGMCC No. 2389) DNA作為擴(kuò)增Cap蛋白基因的模板， 貯存于-20°C，備用。根據(jù)GenBank的PCV2全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增PCV20RF2開放性閱讀 框基因序列。分別在上下游引物的5'端加上BamH I和Xhol I酶切位點(diǎn)(下劃線表示)。上游引物5‘ -CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3 ‘；下游引物5‘ -CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCT-3 ‘；利用設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增PCV2 0RF2基因片段，瓊脂糖電泳并回收PCV2 0RF2基因 的條帶。對(duì)膠回收的條帶進(jìn)行BamH I酶和XholI酶雙酶切鑒定回收，同時(shí)將pBacPAK8質(zhì) 粒(購(gòu)自Clontech公司)用BamH I酶和XholI酶同樣進(jìn)行雙酶切鑒定回收。對(duì)回收的目 的片段和PBacPAKS質(zhì)粒進(jìn)行T4連接酶連接，轉(zhuǎn)化到DH5 α大腸桿菌中，篩選陽(yáng)性克隆，提 取質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pBacPAK8-Cap (質(zhì)粒的構(gòu)建參見圖1)，即含PCV2 Cap蛋白基因重 組轉(zhuǎn)移載體。用PCR擴(kuò)增并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank登記的豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白基因一致。因此，由測(cè)序結(jié)果可知，含PCV2 Cap蛋白基因重組轉(zhuǎn)移載體中含0RF2基因序列， 即含序列表中的SEQ ID NOl序列。2)重組轉(zhuǎn)移載體pBaCPAK8-Cap和家蠶核型多角體病毒(BmNPV)共轉(zhuǎn)染家蠶卵巢 (BmN)細(xì)胞；培養(yǎng)物上清經(jīng)噬斑篩選，獲得重組桿狀病毒；BmN細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心(ATCC，CRL-8910)，以2. 5X IO6個(gè)/孔接 種于6孔組織細(xì)胞培養(yǎng)板，于27°C培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。2h后移去培養(yǎng)基，每孔加2ml含10% 胎牛血清(FBS)的TC-100昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基于室溫放置。準(zhǔn)備無(wú)菌的離心管，向其中加入 0. 1 μ g 1 μ g BmNPV DNA, 0. 5yg~1.5yg 重組轉(zhuǎn)移載體 pBacPAK8_Cap、2 μ 1 25 μ 1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin。優(yōu)選方案是BmNPV DNA含量0. 2 μ g ;pBacPAK8_Cap質(zhì)粒含 量1 μ g ；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑含量20 μ 1。充分混合后加入800 μ 1的TC-100培養(yǎng)基，混合后做為轉(zhuǎn)染液。以點(diǎn)滴狀的方式將 其加到BmN細(xì)胞中。將細(xì)胞培養(yǎng)板于27°C培養(yǎng)箱中放置24h后吸盡轉(zhuǎn)染液，每孔加入4ml 含10%胎牛血清(FBS)的TC-100培養(yǎng)基，將平板于27°C培養(yǎng)箱中放置5天。收獲轉(zhuǎn)染細(xì) 胞上清液，4°C保存，該上清中即包含發(fā)生重組的家蠶核型多角體病毒。家蠶卵巢(BmN)細(xì)胞以2. 5X IO6個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于27°C培養(yǎng)箱中 貼壁培養(yǎng)。2h后移去培養(yǎng)基，每孔接種500 μ 1的上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液，感染吸附2h后去掉 感染液。將預(yù)融并42°C保溫的4%低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠與37°C保溫的1. 33XTC-IOOd. 3倍 的TC100培養(yǎng)基)培養(yǎng)基，按1 3的比例充分混合后，以2. 5mL/孔加入上述細(xì)胞培養(yǎng)板 中。待瓊脂糖凝固后，將細(xì)胞培養(yǎng)板倒置于無(wú)菌的濕盒中，27°C培養(yǎng)，逐日觀察結(jié)果。通過(guò)倒置顯微鏡觀察，篩選由細(xì)胞病變產(chǎn)生的病毒噬斑。將挑取的病毒噬斑溶解 于500μ1 TC-100生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，4°C過(guò)夜，讓病毒從瓊脂中釋放出來(lái)。繼續(xù)接種于6孔 組織細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)的BmN細(xì)胞上，進(jìn)行第二輪的噬斑篩選以獲得純的重組病毒，命名為 BmPNV-Cap病毒，用病毒噬斑滴度的方法鑒定病毒的滴度。3)重組BmPNV-Cap病毒感染家蠶幼蟲，生產(chǎn)重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白；重組BmPNV-Cap病毒以感染指數(shù)M. 0. I. = 0.5的劑量感染家蠶卵巢細(xì)胞，27°C 培養(yǎng)5天，收獲病毒液，做為基礎(chǔ)種毒。挑選5日齡家蠶(皓月X箐松)幼蟲，按照感染劑量為IO5Pfu(噬斑形成單位)/ 頭，用微量移液器于家蠶幼蟲腹部第一環(huán)節(jié)或第二環(huán)節(jié)注射。分別于感染72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h和156h后，收獲感染重組桿狀病 毒的幼蟲，-20°C凍存。4)回收重組BmPNV-Cap病毒感染的家蠶的血淋巴；取收獲的感染重組桿狀病毒的幼蟲用組織碾磨器勻漿，用100目網(wǎng)篩(孔徑 0. 150mm),600rpm離心lOmin，過(guò)濾勻漿液，收集濾液。濾液經(jīng)6000rpm于4°C條件下離心 30min后取上清。5)分離純化血淋巴中的重組PCV2 Cap蛋白；在收集的上清中，加入4倍體積的lmol/1的檸檬酸緩沖液(pH5. 0)，充分?jǐn)嚢?h 后于4°C條件下12，OOOrpm離心30min后取上清，轉(zhuǎn)至真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干，于_70°C 進(jìn)行保存。取感染家蠶幼蟲72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h和156h后收獲的樣品進(jìn)行
6SDS-PAGE電泳和紫外分光光度計(jì)測(cè)定重組PCV2Cap蛋白及其含量。結(jié)果見附圖4，結(jié)果顯 示至少感染后120h，重組PCV2 Cap蛋白表達(dá)產(chǎn)率有大幅提高，感染后第132h表達(dá)量達(dá)到峰 值，超過(guò) 700μ g/ml。同時(shí)取凍干后樣品進(jìn)行SDS-PAGE鑒定重組蛋白的鑒定，結(jié)果見圖2 ；其中，第1孔 為家蠶血淋巴陰性對(duì)照；第2孔為蛋白質(zhì)Marker ；第3孔為家蠶感染重組病毒后第120h血 淋巴樣品；第4孔為家蠶感染重組病毒后第96h血淋巴樣品。SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳凝膠觀 察到大小約為28.2KDa的特異性條帶，即為PCV2 Cap蛋白，與預(yù)計(jì)結(jié)果一致。將目的蛋白 進(jìn)行測(cè)序，由測(cè)序結(jié)果可知，PCV2 Cap蛋白含序列表中的SEQ ID N02序列。采用Western blot鑒定表達(dá)的重組PCV2 Cap蛋白。取凍干樣品感染后第96h樣 品、第120h樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素 膜上，封閉液封閉后，加上針對(duì)PCV2 Cap蛋白的單抗，再加上帶有標(biāo)記物的二抗。然后判定 重組PCV2 Cap蛋白的表達(dá)。結(jié)果見附圖3，其中，第1孔為家蠶感染重組病毒后第120h后 血淋巴樣品，第2孔為家蠶感染重組病毒后第96h后血淋巴樣品，第3孔為家蠶血淋巴陰性 對(duì)照樣品。結(jié)果顯示，在第120h和第96h樣品中，硝酸纖維素膜上都能觀察到一條分子量 大小與預(yù)期大小一致的特異性條帶，而家蠶血淋巴陰性對(duì)照樣品中未觀察到任何特異性條 帶。說(shuō)明表達(dá)的重組PCV2 Cap蛋白能夠同豬圓環(huán)病毒2型抗體特異性結(jié)合，說(shuō)明重組PCV2 Cap蛋白具有特異的豬圓環(huán)病毒2型免疫原性。6)利用重組PCV2 Cap蛋白，輔以佐劑，制備重組PCV2 Cap蛋白亞單位疫苗；準(zhǔn)備不同濃度的抗原稀釋物，并與ISA206佐劑混合乳化。ISA206佐劑經(jīng)121°C、 60min高壓濕熱滅菌，按照抗原/佐劑體積比例46 54混合。使用德國(guó)產(chǎn)IKA 2000/4型乳 化機(jī)，先將佐劑加入乳化機(jī)料筒內(nèi)，在攪拌狀態(tài)下(IOOrpm)緩緩將抗原水相滴入佐劑中， 滴完后，繼續(xù)攪拌5min。用乳化機(jī)5000rpm，循環(huán)乳化4min，得到PCV2 Cap蛋白亞單位疫苗 成品。優(yōu)選地，疫苗成品PCV2 Cap蛋白的含量為0. 2微克/頭份、0. 5微克/頭份、1微 克/頭份、2微克/頭份、5微克/頭份、10微克/頭份和15微克/頭份。制備好的疫苗經(jīng)粘度檢測(cè)、離心檢測(cè)、劑型檢測(cè)、穩(wěn)定性檢測(cè)后，各項(xiàng)指標(biāo)均符合 規(guī)定。疫苗保存于4°C。每劑量體積為2ml。本發(fā)明方法生產(chǎn)的PCV2 Cap蛋白抗原還可以與其他的油性佐劑、水性佐劑或其他 佐劑混合使用，如本領(lǐng)域常見的白油佐劑、鋁膠佐劑、弗氏佐劑等等。實(shí)施例2重組PCV2 Cap蛋白亞單位疫苗的效力檢測(cè)篩選10 14日齡的豬圓環(huán)病毒、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病病毒、豬細(xì)小病毒等主要病 原陰性豬。將符合條件的仔豬隨機(jī)分為9組，每組10頭，7組給予包含不同量重組Cap蛋 白的亞單位疫苗(分別包含重組衣殼蛋白0. 2微克/頭份、0. 5微克/頭份、1微克/頭份、 2微克/頭份、5微克/頭份、10微克/頭份和15微克/頭份)，1組做為攻毒對(duì)照，另1組 做為陰性對(duì)照。其中，第1組給予包含重組Cap蛋白0. 2微克/頭份的亞單位疫苗；第2組 給予包含重組Cap蛋白0. 5微克/頭份的亞單位疫苗；第3組給予包含重組Cap蛋白1微 克/頭份的亞單位疫苗；第4組給予包含重組Cap蛋白2微克/頭份的亞單位疫苗；第5組 給予包含重組Cap蛋白5微克/頭份的亞單位疫苗；第6組給予包含重組Cap蛋白10微克 /頭份的亞單位疫苗；第7組給予包含重組Cap蛋白15微克/頭份的亞單位疫苗；第8組做為攻毒對(duì)照組，不給予任何包含重組Cap蛋白的亞單位疫苗。第1 7組進(jìn)行兩次免疫， 間隔2周。在第二次免疫后21天對(duì)第1 8組進(jìn)行病毒攻擊，毒株選用PCV2-SH株(CGMCC No. 2389) (106 0TCID50/ml)，每頭豬滴鼻1ml，頸部肌肉注射2ml，隔離飼養(yǎng)。攻毒后第4、7天 分別在兩腋下和兩臀部注射弗氏不完全佐劑乳化的鑰匙孔血藍(lán)蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹 腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。在第11天和19天腹腔注射巰基乙酸培養(yǎng)基10ml。攻毒后 25天進(jìn)行剖殺。第9組做為陰性對(duì)照組，單獨(dú)隔離飼養(yǎng)，在第1 8組攻毒后25天進(jìn)行剖 殺。所有豬只在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前收集血樣。在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前對(duì)所有豬只收集血樣，通過(guò)ELISA法進(jìn)行PCV2 血清抗體分析。攻毒后25天剖檢全部豬只，觀察各組織器官病理變化、拍照記錄。符合以 下3項(xiàng)中的任何2項(xiàng)，即可判為發(fā)病。A.臨床癥狀仔豬體溫升高(彡400C )，應(yīng)至少持續(xù) 3日，出現(xiàn)明顯食欲減退、精神沉郁、被毛粗亂、消瘦和生長(zhǎng)速度減緩；B.病理變化腹股溝 和氣管淋巴結(jié)水腫、肺臟輕度水腫，腎臟發(fā)黃或有點(diǎn)狀壞死。組織學(xué)病變?yōu)榱馨徒Y(jié)有明顯淋 巴細(xì)胞侵入，或有多核巨細(xì)胞；C.病毒檢測(cè)用PCR檢測(cè)淋巴結(jié)組織，檢測(cè)到PCV2。結(jié)果本實(shí)施例結(jié)果如下。表1是各組試驗(yàn)豬在第1次在第1次免疫前、攻毒前和剖殺前對(duì)所有豬只收集的 血樣進(jìn)行ELISA檢測(cè)血清中PCV2特異性抗體的結(jié)果。表1.各組試驗(yàn)豬PCV2血清抗體分析結(jié)果
組別PCV2抗體陽(yáng)性率(％)第1次免疫前攻毒前剖殺前第1組0100100第2組0100100第3組0100100第4組0100100第5組0100100第6組0100100第7組0100100第8組00100第9組000表2.是各組試驗(yàn)動(dòng)物在剖殺前觀察臨床表現(xiàn)和剖殺后進(jìn)行病理變化檢測(cè)和淋巴 結(jié)PCR檢測(cè)病毒的試驗(yàn)結(jié)果。表2.各組試驗(yàn)動(dòng)物發(fā)病判定結(jié)果
8 結(jié)果分析根據(jù)試驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀、剖檢病理變化檢測(cè)和病原的PCR檢測(cè)判斷結(jié) 果，其中第8組攻毒對(duì)照組仔豬全部發(fā)病。第1組試驗(yàn)動(dòng)物有2只發(fā)病，亞單位疫苗保護(hù)率 為80%，第2 7組試驗(yàn)動(dòng)物均沒(méi)有發(fā)病，保護(hù)率均為100%。第2組亞單位疫苗效果好于 第1組，可以推斷必須包含0. 5微克抗原或者更多抗原的亞單位疫苗可以給動(dòng)物提供足夠 的保護(hù)，以能有效的保護(hù)畜群對(duì)抗PCV2。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精 神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
一種利用家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型重組衣殼蛋白亞單位疫苗的方法，其特征在于，包括以下步驟A克隆豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的ORF2基因，與桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體；B重組轉(zhuǎn)移載體與桿狀病毒共同轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，培養(yǎng)物上清經(jīng)噬斑篩選，獲得重組桿狀病毒；C重組桿狀病毒感染家蠶幼蟲或蠶蛹，在家蠶幼蟲或蠶蛹中表達(dá)重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白；D回收重組病毒感染的家蠶幼蟲或蠶蛹的血淋巴；E分離純化血淋巴中的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白；F利用純化的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白，輔以佐劑，制備豬圓環(huán)病毒2型亞單位疫苗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟A中豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白 的0RF2基因序列包含序列表中的SEQ IDNOl。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟B中所述重組桿狀病毒中豬圓 環(huán)病毒2型0RF2基因的表達(dá)受多角體啟動(dòng)子的控制。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中所述昆蟲細(xì)胞包括家蠶卵巢細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟B中所述的桿狀病毒包括家蠶核型多 角體病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟C中所述的家蠶品種包括箐松X皓 月或與之相一致的家蠶品種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟E中所述的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼 蛋白序列包含序列表中的SEQ ID N02。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟E中所述的重組豬圓環(huán)病毒2型 衣殼蛋白為如下三種多肽的任意一種i)含有序列表中的SEQ ID N02序列的多肽； )與i)所述多肽至少80%同源的多肽； iii)i)和ii)所述多肽的免疫原性部分。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟F中所述的佐劑為水性佐劑或油 性佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 8任意一項(xiàng)方法生產(chǎn)的重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白。
11.根據(jù)權(quán)利要求1 9任意一項(xiàng)方法生產(chǎn)的豬圓環(huán)病毒2型重組衣殼蛋白亞單位疫苗。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述疫苗，其特征在于，所述疫苗每頭份包含至少0.5微克重組豬 圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供一種家蠶生物反應(yīng)器生產(chǎn)豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。該方法以家蠶核型多角體病毒為載體，通過(guò)轉(zhuǎn)移載體中的核型多角體病毒同源臂與家蠶核型多角體病毒(BmNPV)基因同源重組的方式將豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白基因整合至家蠶核型多角體病毒多角體啟動(dòng)子下進(jìn)行目的蛋白表達(dá)。通過(guò)噬斑篩選的方法獲得含目的蛋白基因的重組家蠶核型多角體病毒，以家蠶生物反應(yīng)器進(jìn)行目的蛋白的大規(guī)模表達(dá)，制備成含有重組豬圓環(huán)病毒2型衣殼蛋白的亞單位疫苗。通過(guò)仔豬攻毒試驗(yàn)，驗(yàn)證該亞單位疫苗具有良好的免疫保護(hù)作用。該方法具有表達(dá)效率高、目的蛋白活性好、生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)，適于規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N7/01GK101920012SQ20101023664
公開日2010年12月22日 申請(qǐng)日期2010年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月22日
發(fā)明者喬榮岑, 孫進(jìn)忠, 張?jiān)S科 申請(qǐng)人:洛陽(yáng)普萊柯生物工程有限公司