專利名稱：日本血吸蟲反轉座子dna靶序列在血吸蟲病診斷中的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和遺傳學領域，更具體地，本發明涉及血吸蟲反轉座子及 其應用。
背景技術：
血吸蟲病在非洲、亞洲和南美洲發展中國家嚴重危害人類健康并造成巨大經濟 損失。日本血吸蟲在生態學和生物學方面明顯有別于其它血吸蟲，是對人體健康危害最 為嚴重、防治難度最大的血吸蟲病之一，在中國已有2100多年的歷史。解放初期，廣 泛流行于我國長江流域的12個省、直轄市和自治區，中間宿主釘螺分布面積148億平方 米。近年來，由于經濟體制和長江流域生態環境的變化和流動人口的增加，使得釘螺滋 生面積擴大，傳染源擴散，我國的血吸蟲病疫情出現上升趨勢，局部地區明顯回升，并 向城市逐步蔓延。血吸蟲疫情的反復引起了國家的高度重視，國家衛生部已將其列為4個重大傳 染病之一。2004年2月國務院成立國家血吸蟲病防治工作領導小組，提出了 “要抓住源 頭，綜合治理，依靠科技進步，堅決遏制血吸蟲病疫情回升勢頭”的要求。2004年5月 召開了全國血吸蟲病防治會議中提出，“作好血吸蟲病防治工作關系到人民的身體健康 和生命安全，關系到社會經濟發展和社會穩定。”血吸蟲病的診斷長期以來依賴病原體的直接檢測，即檢查糞便蟲卵作為主要確 診手段之一。由于從糞便中排出的蟲卵只占產卵總量的17%，多數發生在晚期病人， 雖然在蟲卵的檢查方法上有了許多的改良，但在流行疫區的實際操作中還是較為繁瑣和 不便，特別是其診斷的敏感性較差，對早期感染、輕度和反復化療后的病人的漏檢率較 高。自上世紀20年代以來，免疫技術已應用到血吸蟲病的診斷，例如，用皮內反應診斷 血吸蟲病，取得了較好的效果。隨后，經過廣泛的研究和不斷的改進，目前已有了幾十 種免疫學檢測方法，而且還發展了檢測血吸蟲循環抗原和循環免疫復合物的新方法，極 大地推動了血吸蟲免疫學檢測方法的深入發展。由于血吸蟲感染宿主的免疫調節作用，導致感染宿主體內的循環抗原、循環抗 原抗體免疫復合物和特異抗體的動態很不一致，到目前為止，還缺乏有效的血吸蟲病現 癥感染診斷手段，特別是療效考核的方法。近年來，從日本血吸蟲全基因組中發掘反轉座子的研究越來越引起人們的重 視，許多學者已經做了大量的研究。迄今為止，已知的日本血吸蟲反轉座子極為有限。
發明內容
本發明的目的在于提供一類血吸蟲反轉座子。本發明的另一目的在于提供對應于所述的血吸蟲反轉座子的引物對和試劑盒。本發明的另一目的在于提供所述的血吸蟲反轉座子的應用。在本發明的第一方面，提供一種分離的多核苷酸，所述的多核苷酸具有選自SEQ ID NO 1-25中任一所示的核苷酸序列。在另一優選例中，所述的多核苷酸具有 SEQ ID NO 19或SEQ ID NO 10所示的核苷酸序列。本發明的第二方面，提供所述的多核苷酸的用途，其作為血吸蟲病檢測標志 物，或者用于所述的多核苷酸作為血吸蟲病檢測標志物，或用于制備檢測血吸蟲的試劑 盒或DNA芯片。此外，本發明的反轉座子還可用于血吸蟲遺傳關系的確定；血吸蟲基因的定 位；血吸蟲各種或各亞種間的保守性分析；血吸蟲的進化分析；或血吸蟲的品種或地域 種群鑒定。在另一優選例中，所述的血吸蟲是日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)。在本發明的第三方面，提供一種引物對，所述引物對擴增獲得的擴增產物具有 選自SEQIDNO 1-25中任一所示的反轉座子序列。在另一優選例中，所述的引物(對)是擴增SEQ IDNO : 19或10所示核苷酸序 列或其片段的引物，更佳地，所示引物(對)具有選自SEQIDNO : 26-29所示的序列或 SEQ ID NO 30-31所示的序列。在本發明的第四方面，提供所述的引物對的用途，它們被用于制備檢測血吸蟲 基因組中是否存在對應于本發明第一方面中所述的反轉座子的多核苷酸的試劑盒。在本發明的第五方面，提供一種確定兩種或多種樣品中血吸蟲之間的遺傳關系 的方法，所述方法包括(1)以所述的反轉座子序列作為標記；(2)用特異性擴增⑴的反轉座子序列的引物，分別對所述兩種或多種樣品中血 吸蟲的基因組DNA進行擴增，從而獲得相應的擴增產物；(3)比較兩種或多種樣品中血吸蟲的擴增產物的異同，從而確定兩種或多種樣品 中血吸蟲之間的遺傳關系。在另一優選例中，通過電泳分析擴增產物的條帶數目和/或位置情況，擴增產 物的條帶數目和/或位置一致性越高，表示兩種或多種血吸蟲之間的遺傳關系越近；擴 增產物的條目數目和/或位置差異越大，表示兩種或多種血吸蟲之間的遺傳關系越遠。在本發明的第六方面，提供一種檢測試劑盒，所述的試劑盒中含有本發明第三 方面中所述的特異性引物對。在另一優選例中，所述的試劑盒中還含有選自下組的材料PCR擴增試劑，電 泳試劑，或序列分析軟件。在本發明的第七方面，提供一種用于遺傳分析的多核苷酸集(set)，所述的多核 苷酸集包括SEQ ID NO 1-25中任一序列所示的反轉座子序列。在另一優選例中，所述的多核苷酸集包括SEQ ID NO: 1_25中25種所示的反轉 座子序列。在本發明的第八方面，提供了一種DNA芯片，所述DNA芯片具有基片以及固 定于所述基片上的核苷酸序列如SEQ ID NO 1-25中任一所示的反轉座子或其特異性片 段。應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中 具體描述的各技術特征可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。例如，就某一大范圍(如10-100)的上限可以與另一優選的較小范圍(如20-80)的下限20進行組合， 從而構成另一范圍(例如20-100)，反之亦然。限于篇幅，在此不再一一累述。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
圖1顯示了 SjCHGCS19.Pl_P2靶序列的示意圖。圖2顯示了 SjCHGCS19.Pl-P2靶序列檢測敏感性。圖中各泳道如下M: IOObp DNA Ladder分子量標準品；1:未稀釋的成蟲模板DNA; 2 9:分別為1 10
1 IO8稀釋后的蟲體模板DNA;最高檢測靈敏度為1 10T(21.47fg/ul) ； 10.空白對照。圖3顯示了 SjCHGCS19.P3-P4靶序列巢式PCR檢測敏感性。圖中各泳道如下 M IOObp DNA Ladder分子量標準品；1 8:分別為1 10 1 IO8稀釋后的蟲體 模板DNA。最高檢測靈敏度為1 107(21.47fg/ul)。圖4顯示了構建TA克隆質粒DNA檢測敏感性。圖中各泳道如下 M IOObpDNA Ladder分子量標準品；1 14 為質粒經1 10 1 IO14稀釋后的 DNA檢測結果。結果表明，檢測靈敏度為2.02個拷貝(對應于1 IO11的稀釋度)。圖5顯示了 SjCHGCS19.Pl_P2靶序列檢測特異性。圖中各泳道如下 M IOObpDNA Ladder分子量標準品；1 雄蟲；2 肝組織；3 肝吸蟲。結果表明， 擴增條帶的大小為303bp，并且與肝吸蟲無交叉反應。圖6顯示了 SjCHGCS19.Pl_P2靶序列檢測50條尾蚴日本血吸蟲感染兔血清DNA 的結果。圖中各泳道如下M IOObp DNA Ladder分子量標準品；1:正常兔血清；
2感染3天；3 9 感染1周 7周；10 18 感染9周 24周(間隔1周檢測)； 19:陽性對照。圖7顯示了 SjCHGCS19.Pl-P2靶序列檢測日本血吸蟲感染兔血清DNA的療效考 核結果。圖中各泳道如下M IOObp DNA Ladder分子量標準品；1:陰性對照(正常 兔的血清)；2-18:依次為感染日本血吸蟲尾蚴后8周-24周的外周血清；19-21:為吡 喹酮治療后第18周-20周(感染后25周-27周)血清DNA連續3周轉陰；22 :陽性對 照(日本血吸蟲成蟲)。圖8顯示了 SjCHGCS10.Pl_P3靶序列的檢測敏感性。圖中各泳道如下 M IOObp DNA Ladder分子量標準品；1未稀釋的成蟲模板DNA ； 2 7 分別為 1 10 1 IO7稀釋后的蟲體模板DNA;最高檢測靈敏度為1 106(214.7fg/ul)8.空
白對照。圖9顯示了基于SjCHGCS19.Pl-P2靶序列通過巢式PCR法檢測日本血吸蟲病人 血清DNA結果。圖中各泳道如下1 22:感染日本血吸蟲不同病人血清的DNA模板 (條帶反應強度與感染度EPG成正相關)；P:陽性對照；N:陰性對照。
具體實施例方式本發明人經過廣泛而深入的研究，通過對日本血吸蟲基因組和轉錄組的研究， 發現了 25種不同類型新的反轉座子序列，其中包括18種LTR反轉座子(SjCHGCSl SjCHGCS 18)，4 種 Non-LTR 反轉座子(SjCHGCS19 SjCHGCS22)禾Π 3 種 Penelope 型 的反轉座子(Sj-penelopel Sj_penelope3)。研究表明，這25種新的反轉座子在日本血 吸蟲基因組中的完整序列拷貝數從1個到130個不等，而不完整序列拷貝數(只有反轉座 子的部分序列)則從15個到6384個不等。如此眾多的拷貝數，使得這25種新的反轉座 子占據整個日本血吸蟲基因組的17%。同時發現其中21種反轉座子都具有表達活性。 提示這些活動性反轉座子(mobile elements)可能在血吸蟲進化，致病性和寄生性方面起 著重要的作用。在此基礎上完成了本發明。如本文所用，術語“含有”或“包括”包括了 “包含”、“主要由......構成”、
“基本上由......構成”、和“由......構成”。如本文所用，所述的“反轉座子序列”和“反轉座子”可互換使用，均是指具 有選自SEQ ID NO 1-25中任一所示的核苷酸序列。如本文所用，所述的“多核苷酸集”是一種多核苷酸的集合，其中含有SEQID NO 1-25中任一序列所示的多核苷酸。在用于遺傳分析時，可以從所述的多核苷酸選 出一條或多條所述的多核苷酸，作為反轉座子標記物。如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物 質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分 離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為 分離純化的。引物根據本發明反轉座子兩端的序列，可設計一對特異引物，通過PCR技術將反轉 座子序列擴增出來，利用測序或電泳分析等技術就可獲得其長度多態性。因此，本發明提供了可用于擴增所述的反轉座子的引物(對)。所述的引物 (對)根據這些反轉座子兩端的保守序列進行設計。引物的設計方法為本領域技術人員 所熟知的方法。通常，可以針對一個反轉座子，根據其兩端序列設計不同種引物，通過 PCR試驗確定最合適的引物。更特別的，在設計引物時，采用相近的Tm溫度，以便使 這些引物能夠在高通量的擴增和檢測中使用。此外，確保引物擴增的位點的唯一性是必 要的。一般而言，18_26bp的寡核苷酸引物具有較好的特異性。采用所述的引物，可擴增出血吸蟲(特別是日本血吸蟲)基因組中相應的反轉座 子。并且，采用相同的引物對，以不同來源的血吸蟲的基因組DNA為模板，可獲得包含 多態性反轉座子結構(如反轉座子重復次數不同、或長度不同等)的多核苷酸。應用本發明的反轉座子及其相應的引物具有多種用途，其中包括但不限于用于血 吸蟲遺傳關系的確定；血吸蟲基因的定位；血吸蟲各種或各亞種間的保守性分析；血吸 蟲的進化分析；或血吸蟲的品種鑒定。遺傳分析方法在得知了本發明提供的各反轉座子或其對應的特異性引物后，本領域人員可采 用多種本領域已知的技術來確定血吸蟲的遺傳關系(或親緣關系)，定位血吸蟲的基因， 對血吸蟲各種或各亞種間進行保守性分析，進行血吸蟲進化分析，或進行血吸蟲的品種 鑒定，或血吸蟲地域種群鑒定。由于反轉座子的PCR擴增是特異性擴增，其穩定性和重現性都較好。檢測PCR擴增后的產物的方法可以采用本領域人員熟知的技術，最常用最簡便 的方法是采用瓊脂糖凝膠電泳技術。通過比較擴增條帶的數目和/或大小來確定擴增產 物的差異。該方法操作簡單，成本低廉。另一種更為精細的方法是通過測序儀的基因掃描，從而可很好地分辨出PCR產 物大小上1-2堿基的差異。基因掃描可采用本領域人員已知的一些軟件，例如GenMapper 4.0軟件。檢測試劑盒或系統本發明還提供了一種檢測試劑盒或系統，所述的試劑盒或系統中含有可特異 性擴增選自SEQ ID NO 1-25中任一所示的反轉座子序列的引物(對)。此外，所述的試劑盒中還含有各種分析血吸蟲遺傳關系、定位血吸蟲基因、血 吸蟲各種或各亞種間保守性分析、血吸蟲進化分析或血吸蟲品種鑒定所需的其它材料。 例如可以包含選自下組的材料PCR擴增試劑，電泳試劑，PCR產物純化試劑，或序列 分析軟件。這些試劑均可以是本領域人員常規使用的。此外，所述的試劑盒中還可含有的使用說明書，以說明所述試劑盒的使用方 法，給出較合適的使用條件。本發明的優點和效果1.開發出一類血吸蟲特異的反轉座子，所述的反轉座子有助于闡明日本血吸蟲 種群之間的遺傳差異。2.針對各反轉座子的特異性引物(對)，所述引物擴增效果良好，擴增產物唯
ο下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按 照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室指南(New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明， 否則百分比和份數按重量計算。實施例1反轉座子的獲得以及引物設計1.日本血吸蟲成蟲樣本DNA的抽提采用DNA的酚抽提和乙醇沉淀法1)取單條蟲置入200 μ 1提取緩沖液洗滌蟲體3次，2000g離心2min分離洗液；2)吸干洗滌液，加入20 μ 1抽提緩沖液，用RNAase-free的滅菌小碾磨棒，碾磨 蟲體至勻漿；3)加入提取緩沖液至終體積50 μ 1 ；4)加入 0.5 μ 1 RNAasedOug/μ 1)，5μ1 SDS(10% ), 0.5 μ 1 蛋白質消化酶，用
槍反復混勻；5)在復式水浴恒溫振蕩器中110轉/分56°C消化Ih ；6)加入等體積50 μ 1苯酚氯仿異丙醇為25 24 1的混合液，混勻， IOOOOg,離心 5min ；7)取上清，加入50 μ 1氯仿異丙醇為24 1的混合液，混勻，lOOOOg，離心5min ；8)取上清，加入80 μ 1無水乙醇，混勻，-30°C過夜；9)加入 Iml 70% 乙醇，IOOOOg,離心 15min ；10)取下層溶液加入10 μ 1 ddH20,待用。或采用蛋白酶K消化法1)用200 μ 1 GNT緩沖液洗滌蟲體3次，2000g，離心2min分離洗滌液；2)吸干洗滌液，加入20 μ IGNT緩沖液，用一根RNAase_free的滅菌小碾磨棒，
碾磨蟲體至勻漿；3)加入40 μ 1 GNT緩沖液，旋轉IOs ；14)加入1 μ 1蛋白酶消化酶，用移液器反復混勻，在復式水浴恒溫振蕩器中110 轉/分于56°C消化Ih;5) IOOOOg,離心5min，室溫放置，轉移上清至一只干凈1.5ml EP管中；6)加入50 μ 1 NID緩沖液，振蕩30s，置室溫3min ；7)旋轉混合30s，95°C 15min滅活蛋白酶消化酶；8) IOOOOg,離心5min，取上清至一干凈1.5ml EP管中，待用。2.反轉座子的獲得對提取的DNA進行測序，獲得基因組序列數據。然后從基因組數據庫獲取初始 數據，經過進一步分析、實驗和選擇，最后獲得25個反轉座子，它們的序列依次如SEQ ID NO 1-25 所示。基于SEQ ID NO: 1_25所示的序列，采用Primer 5.0軟件設計引物，分別合成
25對特異性引物。以日本血吸蟲樣本的全基因組DNA為模板，擴增出相應的對于25種 反轉座子的擴增產物。PCR 循環條件為95 °C 5min ； 94 "C 45s，55 "C 45s，72 "C 45s，30 個循環； 72°C lOmin。PCR反應體系為25ng基因組DNA，2個單位的SBS Taq聚合酶，雙向引 物各 10pm，1.25mM MgCl2, 1 μ IlOX 反應緩沖液，0.5 μ 1 dNTPs(2.5mM，TaKaRa)。用常規方法對PCR產物進行純化，然后進行遺傳學特征分析，遺傳分析方法如 下(1).對PCR產物進行電泳鑒定通過電泳分析擴增產物的條帶數目和/或位置情況，擴增產物的條帶數目和/或 位置一致性越高，表示兩種血吸蟲之間的遺傳關系越近；擴增產物的條目數目和/或位 置差異越大，表示兩種血吸蟲之間的遺傳關系越遠。(2).樣本的基因掃描 PCR 產物用 ABI 3730XL 自動測序儀分離，以 ABI Genescan_500LIZ (Applied Biosystems)分子內標測定PCR產物的DNA片段的確切長度。并用ABI 3730XL和 GenMapper 4.0 軟件(AppliedBiosystems)進行初始數據處理。結果25種不同類型新的反轉座子序列(如表1所示)，其中包括18種LTR反轉座子 (SjCHGCSl SjCHGCS 18)，4 種 Νοη-LTR 反轉座子(SjCHGCS 19 SjCHGCS22)和 3 種Penelope型的反轉座子(Sj-penelopel Sj_penelope3)。研究表明，這25種新的反轉座子在日本血吸蟲基因組中的完整序列拷貝數從1個到130個不等，而不完整序列拷貝 數(只有反轉座子的部分序列)則從15個到6384個不等。如此眾多的拷貝數，使得這 25種新的反轉座子占據整個日本血吸蟲基因組的17%。同時發現其中21種反轉座子都 具有表達活性。提示這些活動性反轉座子(mobileelements)可能在血吸蟲進化，致病性 和寄生性方面起著重要的作用。
權利要求
1.一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸具有選自SEQ ID NO: 19、 1-18和20-25中任一所示的核苷酸序列。
2.權利要求1所述的多核苷酸的用途，其特征在于，所述的多核苷酸作為血吸蟲病檢 測標志物，或用于制備檢測血吸蟲的試劑盒或DNA芯片。
3.—種引物對，其特征在于，所述引物對擴增獲得的擴增產物具有選自SEQIDNO 1-25中任一所示的反轉座子序列。
4.如權利要求3所述的引物對的用途，其特征在于，用于制備檢測血吸蟲基因組中是 否存在對應于權利要求1所述的反轉座子的多核苷酸的試劑盒。
5.—種確定兩種或多種樣品中血吸蟲之間的遺傳關系的方法，其特征在于，所述方 法包括以下步驟(1)以權利要求1所述的反轉座子序列作為標記；(2)用特異性擴增(1)的反轉座子序列的引物，分別對所述兩種或多種樣品中血吸蟲 的基因組DNA進行擴增，從而獲得相應的擴增產物；和(3)比較兩種或多種樣品中血吸蟲的擴增產物的異同，從而確定兩種或多種樣品中血 吸蟲之間的遺傳關系。
6.—種檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中含有權利要求3所述的引物對。
7.如權利要求6所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中還含有選自下組的 材料PCR擴增試劑，電泳試劑，或序列分析軟件。
8.—種用于遺傳分析的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集包括SEQID NO: 1-25中任一序列所示的反轉座子序列。
9.如權利要求8所述的多核苷酸集，其特征在于，所述的多核苷酸集包括SEQID NO 1-25中25種所示的反轉座子序列。
10.—種DNA芯片，其特征在于，所述DNA芯片具有基片以及固定于所述基片上的 核苷酸序列如SEQ ID NO 1-25中任一所示的反轉座子或其特異性片段。
全文摘要
本發明公開了日本血吸蟲反轉座子DNA靶序列在血吸蟲病診斷中的應用。具體地，本發明提供了具有選自SEQ ID NO1-25中任一序列所示的核苷酸序列的反轉座子。所述反轉座子可作為血吸蟲病檢測標志物。本發明還提供了特異性擴增所述的反轉座子序列的引物(對)。
文檔編號C12N15/11GK102010861SQ20101023653
公開日2011年4月13日 申請日期2010年7月16日 優先權日2009年7月16日
發明者夏超明, 王升躍, 許靜, 鄭華軍, 郭俊杰 申請人:上海人類基因組研究中心, 蘇州大學