專利名稱:一種在真菌中表達(dá)鑒定外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因育種方法,具體涉及一種利用CaMV 35S啟動(dòng)子在真 菌中表達(dá)外源基因,快速鑒定基因功能的方法。
背景技術(shù):
在現(xiàn)有技術(shù)的植物轉(zhuǎn)基因育種方法中,待轉(zhuǎn)入的外源基因通常需要首先在真核生 物中進(jìn)行表達(dá)和功能驗(yàn)證,再導(dǎo)入目標(biāo)植物中。目前常用的方法是通過轉(zhuǎn)化模式植物,如 煙草或擬南芥,檢測其表達(dá)情況及初步功能,再將該基因轉(zhuǎn)到目標(biāo)植物中。這個(gè)過程鑒定周 期較長,一般需要6-8個(gè)月才能完成,并且費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。真菌是最簡單的真核生物。與轉(zhuǎn)化植物相比,真菌的遺傳轉(zhuǎn)化省去了播種、收獲、 組織培養(yǎng)等繁瑣的操作過程,并且周期短,操作簡便易行。因此,如果能夠在真菌中實(shí)現(xiàn)外 源基因的表達(dá)和功能初步鑒定,將大大縮短轉(zhuǎn)基因育種進(jìn)程。用作真菌轉(zhuǎn)化的方法很多,但 目前公認(rèn)的方法是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)(侵染)的轉(zhuǎn)化。實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化過程已經(jīng)是成熟的技術(shù),通 過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化真菌和轉(zhuǎn)化植物的原理基本相同。目前,用于高等植物遺傳轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體,其標(biāo)記基因和功能基因所使用的啟動(dòng) 子均為CaMV35S啟動(dòng)子。CaMV35S是來自花椰菜病毒的一種強(qiáng)啟動(dòng)子,可以被植物識別,被 廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因育種中。但是,遺憾的是,多數(shù)真菌對其無法識別,如果將植物表達(dá) 載體轉(zhuǎn)入真菌,則會(huì)導(dǎo)致其所帶有的抗性標(biāo)記基因和功能基因無法在真菌中表達(dá)。所以,當(dāng) 科學(xué)家從原核生物(如細(xì)菌)中獲得一個(gè)有用的基因后,必需先在擬南芥這樣的模式植物 中去做初步表達(dá)和功能鑒定,然后再轉(zhuǎn)入需要的植物中,因?yàn)閿M南芥的遺傳轉(zhuǎn)化非常容易、 方便(植物轉(zhuǎn)化比較難,主要難在組織培養(yǎng)成苗過程),然而,就是這個(gè)目前被認(rèn)為最方便 快捷的過程也需要半年以上。因此,在真核生物中建立一個(gè)更加快速、簡便易行的外源基因 表達(dá)鑒定方法很有必要。有人發(fā)現(xiàn),尖孢鐮刀菌可以識別CaMV35S啟動(dòng)子,現(xiàn)有技術(shù)中,尚未見有人將其用 于在真菌中對外源基因的表達(dá)和功能鑒定。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的最終目的是建立一種能夠快速、省時(shí)、省力地在真菌中對來自原核生物 的新的功能基因進(jìn)行表達(dá)和功能鑒定的方法。本發(fā)明的直接目的是利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)和CAMV35S啟動(dòng)子表達(dá)外源基因和進(jìn)行功 能初步鑒定。為了解決絕大部分真菌不識別植物表達(dá)載體所用的CAMV35S啟動(dòng)子的問題,本發(fā) 明人對尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)可以識別CaMV35S啟動(dòng)子進(jìn)行了研究。利用了 這個(gè)特點(diǎn),本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在真菌中快速對外源基因進(jìn)行表達(dá)鑒定的目的。尖孢鐮刀菌屬于半知菌亞門、鐮刀菌屬。有人發(fā)現(xiàn),尖孢鐮刀菌可以識別CAMV35S 啟動(dòng)子。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)證明,常用的植物表達(dá)載體PCAMBIA1300可以直接轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)獲得具有潮霉素抗性的突變體,表明尖刀鐮孢菌的確可以識別植物 表達(dá)載體潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因帶有的CaMV35S啟動(dòng)子。這是迄今為止報(bào)道的唯一一個(gè)可 以識別CaMV35S啟動(dòng)子的絲狀真菌,這一發(fā)現(xiàn)使目前適用于植物轉(zhuǎn)化的雙元載體不需要任 何修改就可以用來轉(zhuǎn)化真菌。本發(fā)明方法的技術(shù)手段是利用CaMV35S啟動(dòng)子在真菌中進(jìn)行基因表達(dá)和鑒定的方法,其操作步驟如下1、將目的基因克隆至帶有CaMV35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體上;2、將步驟1所得的載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌中;3、用步驟2所得到的農(nóng)桿菌侵染尖孢鐮刀菌,篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子;4、對步驟3所述陽性轉(zhuǎn)化子中含有的目的基因進(jìn)行表達(dá)和初步功能鑒定。上述步驟1中,所述植物表達(dá)載體可以是本領(lǐng)域常用的植物表達(dá)載體,如pBI121 或pCAMBIA系列等;步驟3中,可以選用潮霉素抗性為篩選標(biāo)記。在運(yùn)用本方法的一個(gè)實(shí)例中,發(fā)明人構(gòu)建了高抗草甘膦的EPSP合酶基因植物表 達(dá)載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法,轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌EPSPs基因敲除的突變體,可以 使其恢復(fù)對草甘膦的耐受性。發(fā)明人從原核生物中獲得了一個(gè)新型高抗草甘膦的EPSP合 酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶)基因,采用本發(fā)明提供的方法快速對該基因在真 核生物中進(jìn)行了表達(dá)和功能快速鑒定。主要操作步驟如下1、將EPSP合酶基因的開放閱讀框序列5'端連接CAMV35S啟動(dòng)子,3'端連接nos 終止子;2、將連接好的完整的EPSP合酶基因克隆至PCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn)(圖1);3、得到的重組質(zhì)粒(表達(dá)載體)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL-I中;4、用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染尖孢鐮刀菌草甘膦抗性缺失的突變體菌株,用潮 霉素抗性標(biāo)記篩選陽性轉(zhuǎn)化子,并獲得單孢培養(yǎng)(圖2);5、提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA,在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物,采用PCR方 法對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分子驗(yàn)證(圖3);6、提取轉(zhuǎn)化子的總RNA,反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行基因表達(dá)鑒定;7、在含有草甘膦的基本培養(yǎng)基平板上,進(jìn)行目的基因的功能鑒定;8、綜合分析評估EPSP合酶基因的表達(dá)和功能情況。具體操作過程和結(jié)果詳見實(shí)施例。本發(fā)明主要的創(chuàng)新點(diǎn)是選用了尖孢鐮刀菌。因?yàn)橐话愕恼婢蛔R別CAMV35S啟動(dòng) 子,所以常用的轉(zhuǎn)植物的表達(dá)載體不能用做真菌轉(zhuǎn)化,無法用作重要功能基因的表達(dá)和功 能鑒定。而本發(fā)明利用尖孢鐮刀菌可以識別CAMV35S啟動(dòng)子的特點(diǎn),將植物重要功能基因 轉(zhuǎn)移的表達(dá)鑒定過程,從常用的轉(zhuǎn)模式植物擬南芥變成通過轉(zhuǎn)化真菌進(jìn)行鑒定。由于真菌 和擬南芥都是真核生物,所以在真菌里的鑒定結(jié)果可以代表在擬南芥中的鑒定結(jié)果,這種 改變或方法創(chuàng)新,簡便、快速,縮短了植物轉(zhuǎn)基因育種的進(jìn)程。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)1、技術(shù)操作簡單、省力
省去了在溫室種苗、種子收獲、純合子篩選、或組織培養(yǎng)成苗(煙草)等繁瑣的步 驟,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)就可以完成。2、周期短、快速、省時(shí)一般在植物表達(dá)載體構(gòu)建完成后,14天內(nèi)可以得到陽性轉(zhuǎn)化子,18天內(nèi)可以得到 經(jīng)過分子驗(yàn)證的轉(zhuǎn)化子純培養(yǎng)菌株,包括農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化2天、需轉(zhuǎn)化的鐮刀菌培養(yǎng)2-3天、共 培養(yǎng)2天、轉(zhuǎn)化子篩選4天、獲得單菌落4天和分子驗(yàn)證4天(詳見實(shí)施例1);在獲得經(jīng)過 分子驗(yàn)證的單菌落后,7天內(nèi)可以完成基因的表達(dá)和功能初步鑒定,包括搖菌培養(yǎng)及RNA提 取、反轉(zhuǎn)錄及表達(dá)鑒定(為節(jié)約時(shí)間,可與分子驗(yàn)證同時(shí)進(jìn)行菌株培養(yǎng))?;蚬δ荑b定一 般在6天之內(nèi)完成(為節(jié)省時(shí)間,可與表達(dá)鑒定同時(shí)進(jìn)行)。具體時(shí)間計(jì)算參見表1。因此, 在表達(dá)載體構(gòu)建完成后,采用本發(fā)明方法進(jìn)行基因表達(dá)和功能鑒定可在25天之內(nèi)完成,與 目前常用的轉(zhuǎn)化擬南芥方法進(jìn)行鑒定相比,鑒定周期縮短了半年左右。
圖1是用含有植物表達(dá)載體pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌,直接侵染尖孢鐮刀菌,以潮霉 素抗性作為篩選標(biāo)記,所得到尖孢鐮刀菌轉(zhuǎn)化子。說明尖孢鐮刀菌可以識別植物表達(dá)載體 帶有的CAMV35S啟動(dòng)子。圖2是將帶有CAMV35S啟動(dòng)子目的基因克隆至植物表達(dá)載體使用植物轉(zhuǎn)基因常用的啟動(dòng)子CAMV35S控制目的基因的表達(dá),構(gòu)建完成后,直接 轉(zhuǎn)化尖孢鐮刀菌進(jìn)行初步鑒定,根據(jù)鑒定結(jié)果,確定是否轉(zhuǎn)化植物。圖3是陽性轉(zhuǎn)化子分子鑒定的電泳圖譜在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的內(nèi)部設(shè)計(jì)引物,產(chǎn)物大小為800bp,以轉(zhuǎn)化子的基因組 DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用1. 0%的瓊脂糖凝膠電泳(1-7為不同的轉(zhuǎn)化子)。圖4是轉(zhuǎn)IrrE基因的尖孢鐮刀菌在不同鹽濃度的匪培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天以后孢子 濃度的數(shù)據(jù)。原始接種孢子濃度在0. IXlOVml左右。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中,用高抗草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶) 基因進(jìn)行了具體實(shí)驗(yàn),證明本發(fā)明方法有效。但需要說明的是,本領(lǐng)域技術(shù)人員按照本發(fā)明 的精神,采取本方法,也可用于其它目的基因的表達(dá)檢測和功能鑒定。因此,本專利的范圍 并不限于如下實(shí)施例的內(nèi)容。以下實(shí)施例中所用的部分材料來源如下尖孢鐮刀菌菌株來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所“中國農(nóng)業(yè)微生物菌種 保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China,ACCC) ”,菌株保藏編號 31352。需要說明的是,用任何尖孢鐮刀菌菌株,都可達(dá)到本發(fā)明的目的。CaMV35S啟動(dòng)子來自花椰菜病毒的一種強(qiáng)啟動(dòng)子,可以被植物識別,已經(jīng)被廣泛 應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因育種中外源基因的啟動(dòng)表達(dá),其序列已知。pCAMBIA系列植物表達(dá)載體從澳大利亞Cambia研究所購得。pBI121 是植物轉(zhuǎn)基因常用的表達(dá)載體,可以從質(zhì)粒載體服務(wù)商處購得。
潮霉素B 美國Amresco公司產(chǎn)品。EPSP合酶基因是申請人通過采集草甘膦極端污染環(huán)境中土壤樣品,分離樣品總 DNA,構(gòu)建粘粒文庫,篩選草甘膦抗性轉(zhuǎn)化子,序列分析,人工合成而得到的高抗草甘膦的 DNA片段。Nos終止子是國際通用的真核基因的表達(dá)終止元件。pCAMBIA1300植物表達(dá)載體購自澳大利亞Cambia研究所。農(nóng)桿菌AGL-I 真菌或植物轉(zhuǎn)基因常用的農(nóng)桿菌菌株之一,可從專業(yè)菌株服務(wù)商 處購得。實(shí)施例1來自原核生物的新的抗草甘膦基因的表達(dá)和功能鑒定本發(fā)明所用的植物表達(dá)載體pCAMBIA1300來自澳大利亞Cambia研究所,其上所 帶的CAMV35S啟動(dòng)子是來自花椰菜病毒的一種強(qiáng)啟動(dòng)子,已被廣泛應(yīng)用于植物轉(zhuǎn)基因育種 中。本發(fā)明從原核生物中獲得了一個(gè)新型高抗草甘膦的EPSP合酶(5-烯醇式丙酮莽 草酸-3-磷酸合酶)基因,其開放閱讀框核苷酸序列全長為1335個(gè)堿基,編碼全長為445 個(gè)氨基酸。采用本發(fā)明提供的方法可以快速對該基因在真核生物中的表達(dá)和功能進(jìn)行快速 鑒定。操作步驟如下1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1以含有上述高抗草甘膦的EPSP合酶基因的質(zhì)粒為模板,對該EPSP合酶基因的 開放閱讀框進(jìn)行PCR擴(kuò)增,所使用的5'端引物添加25個(gè)堿基與CAMV35S啟動(dòng)子3'末端 互補(bǔ),3'末端引物引入HindIII酶切位點(diǎn);1.2設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CAMV35S啟動(dòng)子,5'端引物引入BamHI酶切位點(diǎn),3'端引物添 加25個(gè)堿基與EPSP合酶基因閱讀框的5'端互補(bǔ);1. 3利用融合PCR技術(shù)將CAMV35S啟動(dòng)子序列與EPSP合酶基因的開發(fā)閱讀框相 連,得到帶有CAMV35S啟動(dòng)子的EPSP合酶基因片段;1. 4將步驟3獲得的帶CAMV35S啟動(dòng)子的EPSP合酶基因片段,用BamHI和 Hindi 11酶切后,連入相同酶切的載體pET28a得到重組質(zhì)粒pETGR-79并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL2l(Promega 公司);1. 5將pETGR-79和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300分別用BamHI和HindIII酶切,回 收目的片段并連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,得到帶有CAMV35S啟動(dòng)子的EPSP合酶基因的植物表達(dá) 載體(圖1)。2、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌需2天時(shí)間。2. 1用常規(guī)方法制作農(nóng)桿菌AGL-I的感受態(tài)細(xì)胞;2. 2向每管感受態(tài)細(xì)胞中加入大約1 μ g構(gòu)建好的表達(dá)載體,冰浴30min.,液氮速 凍 lmin,37°C^^t3min。2. 3加入800 μ 1 YEP液體培養(yǎng)基,于28°C 150rpm恢復(fù)培養(yǎng)3h后,5000rpm離心 Imin.收集菌體。2. 4將收集到的農(nóng)桿菌菌體涂布于YEP平板(含卡那霉素)上,28°C培養(yǎng)2_3天, 挑取長出的單菌落,鑒定轉(zhuǎn)化子。
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3、侵染尖孢鐮刀菌前農(nóng)桿菌的培養(yǎng)農(nóng)桿菌的培養(yǎng)過程需2-3天時(shí)間。3. 1取50ml三角瓶一個(gè),加入匪液體培養(yǎng)基20ml,分別加入50mg/ml的Kan和 Rif各20 μ 1。接種含有植物表達(dá)載體的新鮮的農(nóng)桿菌一環(huán),28°C,200rpm振蕩培養(yǎng)48h。3. 2取兩個(gè)滅菌的1. 5ml EP管,吸取1. 5ml培養(yǎng)好的菌液,lOOOOrpm,離心30s,用 Iml IM液體培養(yǎng)基重懸菌體,重復(fù)離心操作,然后再用Iml IM重懸菌體。3. 3吸取200 μ L菌液,用IM稀釋10倍,測定OD600值,根據(jù)測得的0. D值計(jì)算IOml 培養(yǎng)物菌液用量,使最終菌液0D_ = 0. 15。3. 4在IOml上述菌液中添加AS,使終濃度為200 μ M/L。28°C,200rpm搖床培養(yǎng) 12h,使OD6tltl值在0. 5-0. 7之間,備用。4、侵染前尖孢鐮刀菌的準(zhǔn)備尖孢鐮刀菌培養(yǎng)需2-3天時(shí)間,但可以和農(nóng)桿菌培養(yǎng)同時(shí)進(jìn)行。4. 1取IOOml三角瓶一個(gè),加入CM液體培養(yǎng)基20ml,接種平板或試管保存的、準(zhǔn)備 用于轉(zhuǎn)化的尖孢鐮刀菌EPSPs突變體適量。4. 2 25°C,150rpm搖床培養(yǎng)2-3天。取少量菌液,用無菌水稀釋10倍鏡檢,計(jì)算孢
子數(shù)量;4. 3根據(jù)鏡檢結(jié)果,用無菌水稀釋至孢子濃度為IX 106Cfu/ml左右,備用。5、尖孢鐮刀菌的遺傳轉(zhuǎn)化從侵染開始至獲得轉(zhuǎn)化子純培養(yǎng),共需12天,包括以下幾個(gè)步驟。5.1共培養(yǎng)(2天)(1)制備IM(誘導(dǎo)培養(yǎng)基)平板數(shù)塊,其中每塊平板(25ml)含20mMAS 50 μ L,小 心將滅菌的微孔濾膜放在平板上,使盡量不存在氣泡。(2)分別吸取準(zhǔn)備好的農(nóng)桿菌和尖孢鐮刀菌孢子懸浮液100 μ L混勻。(3)將200 μ L農(nóng)桿菌和尖孢鐮刀菌混合液均勻涂布于微孔濾膜上,超凈臺吹干, 25 °C恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h。5. 2陽性轉(zhuǎn)化子的篩選(4天)(1)制備PDA平板數(shù)塊,其中每塊平板(25ml)含IOOmM Cef 50 μ L, 50mg/ml Hygl5 μ L,并將完成共培養(yǎng)的濾膜轉(zhuǎn)至該P(yáng)DA平板上。(2)繼續(xù)25°C培養(yǎng)4d,直至轉(zhuǎn)化子菌落出現(xiàn)。(3)將得到的轉(zhuǎn)化子單菌落轉(zhuǎn)接至含有Cef和Hyg的PDA平板上,繼續(xù)觀察其生長 情況(圖2)。5. 3轉(zhuǎn)化子純培養(yǎng)的獲得(4天)將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子菌體適量,用無菌水懸浮,鏡檢計(jì)算孢子數(shù)量,并根據(jù)孢子濃 度用無菌水進(jìn)行梯度稀釋,取少量菌液涂平板(PDA+Hyg),使每塊平板的菌落數(shù)在30-50之 間,25°C培養(yǎng)4天后得到單菌落(純培養(yǎng))。6、轉(zhuǎn)化子的分子驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子單菌落搖菌培養(yǎng)4天,一部分用于提取基因組DNA,另一部分用于提取總 RNA。用OMEGA公司真菌基因組提取試劑盒,提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA,在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物,以轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板,采用PCR方法對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分子 驗(yàn)證(圖3)。7、基因表達(dá)鑒定這個(gè)過程大約需要7天。用步驟6培養(yǎng)好的菌株進(jìn)行總RNA提取。用上海朗頓真菌RNA小量提取試劑盒,提取陽性轉(zhuǎn)化子總RNA。用promega公司的 RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)(K1002S),進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR,未轉(zhuǎn)化的尖孢鐮刀菌EPSPs突變體為對 照,進(jìn)行基因表達(dá)半定量鑒定。在導(dǎo)入的外源基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,導(dǎo) 入的新的高抗草甘膦的基因在CAMV35S啟動(dòng)子的控制下實(shí)現(xiàn)了正常表達(dá),而對照尖孢鐮刀 菌EPSPs突變體未擴(kuò)增出任何條帶。8、基因功能鑒定這個(gè)過程大約需要6天。但可以和分子驗(yàn)證、基因表達(dá)鑒定同時(shí)進(jìn)行。尖孢鐮刀菌EPSPs突變體在基本培養(yǎng)基(MM)中不能生長,而轉(zhuǎn)入高抗草甘膦基 因的陽性轉(zhuǎn)化子則能夠生長。將經(jīng)過鑒定的陽性轉(zhuǎn)化子分別接種在含有0,20,50,80,100, 120,150,200,250,300mM草甘膦濃度的基本培養(yǎng)基中,25°C培養(yǎng)3天,通過檢測孢子濃度, 進(jìn)行目的基因的功能鑒定。結(jié)果表明,在草甘膦濃度為200mM時(shí),陽性轉(zhuǎn)化子仍然能夠正常 生長,250mM時(shí)生長緩慢,說明其耐草甘膦的水平在200-250mM之間。9、基因表達(dá)和功能評估綜合分析評估EPSP合酶基因的表達(dá)和功能請況說明,構(gòu)建的植物表達(dá)載體 CAMV35S啟動(dòng)子可以正常啟動(dòng)外源基因的表達(dá),新的高抗草甘膦基因的具有抗性功能,可以 用于植物的轉(zhuǎn)基因育種。實(shí)施例2來自原核生物的新的與抗鹽相關(guān)基因的表達(dá)和功能鑒定本發(fā)明從極端耐腐蝕異常球菌中獲得了一個(gè)全局調(diào)控基因IrrE,該基因可以提高 大腸桿菌的耐鹽能力。采用本發(fā)明提供的方法可以快速對該基因在真核生物中的表達(dá)和功 能進(jìn)行快速鑒定。操作步驟如下1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建1. 1以D. radiodurans Rl的基因組DNA為模板,對IrrE基因的開放閱讀框進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,所使用的5'端引物添加25個(gè)堿基與CAMV35S啟動(dòng)子3'末端互補(bǔ),3'末端引物 引入HindIII酶切位點(diǎn);1.2設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增CAMV35S啟動(dòng)子,5'端引物引入BamHI酶切位點(diǎn),3'端引物添 加25個(gè)堿基與EPSP合酶基因閱讀框的5'端互補(bǔ);1. 3利用融合PCR技術(shù)將CAMV35S啟動(dòng)子序列與IrrE基因的開發(fā)閱讀框相連,得 到帶有CAMV35S啟動(dòng)子的IrrE基因片段;1. 4將步驟3獲得的帶CAMV35S啟動(dòng)子的IrrE基因片段,用BamHI和HindIII酶切 后,連入相同酶切的載體pET28a得到重組質(zhì)粒pETIrrE并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (Promega 公司);1. 5將pETIrrE和植物表達(dá)載體pCAMBIA1300分別用BamHI和HindIII酶切,回 收目的片段并連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌,得到帶有CAMV35S啟動(dòng)子的IrrE基因的植物表達(dá)載體 (圖 1)。2、農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化
3、侵染尖孢鐮刀菌前農(nóng)桿菌的培養(yǎng)操作方法同實(shí)施例1,但尖孢鐮刀菌菌株使用野生型。4、侵染前尖孢鐮刀菌的準(zhǔn)備5、尖孢鐮刀菌的遺傳轉(zhuǎn)化6、轉(zhuǎn)化子的分子驗(yàn)證4、5、6三項(xiàng)操作方法同實(shí)施例1。7、基因表達(dá)鑒定轉(zhuǎn)IrrE基因陽性轉(zhuǎn)化子單菌落總RNA提取,使用TRIzol試劑(GIBC0-BRL), RNase-free DNase (TaKaRa公司)被用于去除DNA污染。用promega公司的RT-PCR反應(yīng)系 統(tǒng)(K1002S),進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和RT-PCR,野生型尖孢鐮刀菌為對照,進(jìn)行基因表達(dá)半定量鑒定。 在導(dǎo)入的IrrE基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增結(jié)果表明,導(dǎo)入的新的IrrE基因在CAMV35S 啟動(dòng)子的控制下實(shí)現(xiàn)了正常表達(dá),而對照尖孢鐮刀菌野生型未擴(kuò)增出任何條帶。8、基因功能鑒定野生型尖孢鐮刀菌菌株在液體基本培養(yǎng)基(MM)中能夠正常生長。將經(jīng)過鑒定的 陽性轉(zhuǎn)化子(以野生型菌株為對照),分別接種在含有0,10,15,20,25,30,40,50,75,IOOmM NaCI濃度的液體基本培養(yǎng)基中,25°C培養(yǎng)4天,通過檢測孢子濃度,進(jìn)行目的基因的功能鑒 定。結(jié)果表明,野生型菌株在NaCI濃度為15mM時(shí),生長速度受到抑制,25mM以上時(shí)不能生 長。而轉(zhuǎn)基因陽性轉(zhuǎn)化子在25mM時(shí)生長基本正常,其完全被抑制的鹽濃度在30mM以上,說 明其IrrE基因的導(dǎo)入提高了尖孢鐮刀菌的耐鹽水平(圖4)。表1本發(fā)明方法進(jìn)行基因表達(dá)和功能鑒定所需時(shí)間
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權(quán)利要求
一種在真菌中表達(dá)外源基因的方法,其特征是利用尖孢鐮刀菌識別CaMV35S啟動(dòng)子,并啟動(dòng)基因表達(dá)。
2.權(quán)利要求1所述的方法,其操作步驟如下1)將目的基因克隆至帶有CaMV35S啟動(dòng)子的植物表達(dá)載體上;2)將步驟1)所得的載體轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌中;3)用步驟2)所得到的農(nóng)桿菌侵染尖孢鐮刀菌,篩選獲得陽性轉(zhuǎn)化子;4)對步驟3)所述陽性轉(zhuǎn)化子中含有的目的基因進(jìn)行表達(dá)和功能鑒定。
3.權(quán)利要求2所述的方法,步驟1)所述植物表達(dá)載體是PBI121或pCAMBIA系列;
4.權(quán)利要求2或3所述的方法,步驟3)用潮霉素抗性為篩選標(biāo)記。
5.一種在真菌中表達(dá)高抗草甘膦的EPSP合酶基因和功能快速鑒定的方法,主要操作 步驟如下1)將EPSP合酶基因的開放閱讀框序列5'端連接CAMV35S啟動(dòng)子,3'端連接nos終 止子;2)將連接好的完整的EPSP合酶基因克隆至pCAMBIA1300的多克隆位點(diǎn);3)得到的重組質(zhì)粒(表達(dá)載體)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌AGL-I中;4)用含有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染尖孢鐮刀菌草甘膦抗性缺失的突變體菌株,用潮霉素 抗性標(biāo)記篩選陽性轉(zhuǎn)化子,并獲得單孢培養(yǎng);5)在潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因內(nèi)部設(shè)計(jì)引物,采用PCR方法對陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分子驗(yàn)證;6)分別提取轉(zhuǎn)化子的基因組DNA和總RNA進(jìn)行基因表達(dá)鑒定;7)在含有草甘膦的基本培養(yǎng)基平板上,進(jìn)行目的基因的功能鑒定。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種植物轉(zhuǎn)基因育種方法,利用尖孢鐮刀菌識別CaMV 35S啟動(dòng)子在真菌中表達(dá)外源基因,快速鑒定基因功能。本方法簡便、快速,縮短了植物轉(zhuǎn)基因育種的進(jìn)程,24天內(nèi)可以完成基因的表達(dá)和功能初步鑒定。
文檔編號C12N15/54GK101914567SQ20101023272
公開日2010年12月15日 申請日期2010年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月16日
發(fā)明者張維, 徐榮旗, 林敏 , 陸偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所