專利名稱：一種炭疽菌菌株及含有其孢子的生物除草試劑的制作方法
技術領域：
本發明為一種炭疽菌屬真菌及其用于生物除草的方法，屬于微生物用于農業植物 保護、防除農作物雜草的技術領域，專用于農田雜草的防除。
背景技術：
隨著人們對化學除草殘留、環境污染以及耐藥和抗藥性雜草發展的認識、綠色食 品和有機農業的大力推廣，研制生物除草劑防除雜草已成為生產上的迫切需求，它具有投 資少、研制周期短、專一性強、對環境安全、不產生污染等優點。目前，商業化的生物除草劑 品種有80年代初研制出的DeVine和Collego以及90年代末推出的Comperico和Biochon。 這些除草劑在控制相對的目標雜草上起到了重要作用，如DeVine的持效性可以保證使用 一次，2-3年無須再除草。有希望商業化的生物除草劑項目有數十項，其中防除稗草、野荸薺 等雜草的生物除草劑品種具有十分誘人的前景。單子葉雜草馬唐(Diditaria sanguinaris)是世界上公認的18種惡性雜草之一， 廣泛分布于世界熱帶和溫帶地區，是玉米、高粱、大豆、花生等秋熟旱作物田的惡性雜草，對 棉花、煙草、麻類、甘 等幼苗生長危害也十分嚴重，同時也是蔬菜田、果園、草坪和園藝作 物田的優勢雜草。在中國，馬唐的危害面積大約在6千萬公頃左右，由其引起的作物損失 占秋熟旱作物田雜草總損失的一半以上。該雜草繁殖能力強，生長速度快，生長期長，消耗 地力、遮光、耐藥性強，人工、機械防除比較困難。目前，化學防除雖然有效，但是，化學除草 劑的長期使用引起抗性雜草的產生和嚴重的環境污染，導致土地退化。因此研制生物除草 劑防除馬唐不僅可以有效防除該雜草，而且對環境安全性高。目前，關于馬唐真菌除草劑 的研究，美國已申請了利用彎孢霉屬(Curvularia intermedia Boedijn)菌株(國際真菌 學會收藏，保藏號為 361688 (MT-5)，361689 (CG-L)，375263 (MT-6)，375264 (MT-7))生物控 制馬唐的專利，專利號為US 5，635，444和UA 5，952，264。但該專利文獻在提出其使用技 術與生產方法時，僅明確對大豆、棉花比較安全，而對玉米和水稻等單子葉作物的安全性及 其使用并未提及。此外，國內南京農業大學已申請了利用雙曲孢霉(Nakataea Hara)菌株 QZ-2000 (保藏號=CGMCC NO. 0640)生物控制馬唐的專利(ZL專利號01134002. 9)，但其單 菌株防效不理想，需由幾個單株的孢子按比例混合后噴施才能達到較好的防除效果，這就 增加了生產的難度。同時，真菌除草劑的一個重要特點就是它對環境條件的要求較為苛刻， 只有當在能充分滿足該菌劑對水分和溫度的要求條件下，才能保證該菌株對雜草的有效侵 染，才能取得良好的防除效果，而對異地生態條件不一定能適應，易具有一定的地域性，因 此，為解決這一難題只有選擇對寄主侵染時所要求的環境條件較寬，易能滿足的寄生真菌 菌株，才具有較寬廣的推廣應用前景。
發明內容
本發明目的是針對棉花、玉米、大豆、花生等作物田惡性雜草——馬唐，篩選獲得 的炭疽菌菌株，用于生物除草，能安全有效的控制和防止惡性雜草馬唐，對農作物安全，尤其是對單子葉作物安全，應用適應性廣，無污染。本發明提供一種保藏號為CGMCC No. 2867的炭疽菌菌株。炭疽菌菌株Cds0501 的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址北京市朝陽區北辰 西路1號院中科院微生物研究所；保藏日2009年1月12日；保藏號CGMCC No. 2867， 分類學命名炭疽菌(Colletotrichum sp.))。屬半知菌類(Fungi Imperfecti)，腔孢綱 (Coelomycetes)，黑盤抱目(Melanconiales)，炭疽菌屬(Colletotrichum Corda)。將CGMCC No. 2867的菌株在PDA平板上緊貼平板表面生長，菌落初呈白色，后 轉為灰白或灰色。分生孢子單細胞，鐮刀形，培養物后期形成黑褐色菌核，生有褐色剛 毛。孢子在PE膜上可生成橢圓或棍棒狀附著胞，邊緣光滑或有裂瓣，有黑色素沉積。從 發病部位刮取的小黑點，經顯微鏡觀察為分生孢子器，周圍生有褐色剛毛，具2-3個分隔， 52. 41-112. 75 X 3. 08-7. IOym ；分生孢子單細胞，12. 24-31. 82 X 3. 07-5. 96 μ m, 一端略尖， 無色，呈鐮刀形，直或彎曲，含1至多個油球。本發明還提供一種將上述炭疽菌菌株用于單子葉作物中馬馬唐的生物除草的方 法，該方法包括利用保藏號為CGMCC No. 2867的炭疽菌菌株的分生孢子為每毫升IO5至 109，或者用該菌的分生孢子與1/5至1/20常規用量的化學除草劑配合使用。上述化學除 草劑主要指阿特拉津、丁草胺、精禾草克、百草枯等。發明人在對馬唐的生物防治研究過程中發現了田間馬唐的自然發病現象，故對 其寄生真菌進行篩選研究。首先分離獲得了炭疽菌菌株，其編號為Cds0501(保藏號碼為 CGMCC No. 2867)，研究發現其專化性強，對作物和其他絕大多數植物安全，但對馬唐有很強 的感染致病率，兩周后馬唐的死亡率達到70%左右，感病率達到100%。菌株的培養條件、 大批量生產方法均已進行了詳細的研究；該菌的感染致病條件也進行了專門的研究工作。 顯示出該菌有較大的潛力開發成商品化生物除草劑。可用于棉花、玉米、大豆、花生、西瓜等 作物田控制馬唐。目前，國內外鮮有用炭疽菌屬真菌防除馬唐的報道，這方面的研究對解決該草的 防除將提供一個新的優良的途徑。本發明采集到的馬唐罹病植株葉片和莖干上有褐色小 點、橢圓形或梭形大病斑，病斑最大可達6. 5-8X22-24mm，周圍有黃色暈圈，外緣褐色，中部 凹陷呈灰色或缺刻，有些在病部形成輪紋狀排列小黑點。葉鞘基部病斑擴展后常連接愈合 導致植株易折斷倒伏。在顯微鏡下觀察，病葉可見大小不一的分生孢子子座密布表面，子座 上密生黑褐色的剛毛，還發現彎鐮形的分生孢子。經分離得到一炭疽菌，其培養特征與致病 特征如下PDA平板上緊貼平板表面生長，菌落初呈白色，后轉為灰白或灰色。分生孢子單細 胞，鐮刀形，和原植物發病組織上的特征一致。培養物后期形成黑褐色菌核，生有褐色剛毛。 孢子在PE膜上可生成橢圓或棍棒狀附著胞，邊緣光滑或有裂瓣，有黑色素沉積。以分離的 純培養物的分生孢子懸浮液噴霧接種3-4葉期馬唐植株。接種后3d，在葉片、葉鞘等部位 開始出現明顯的水漬狀斑點；之后斑點逐漸擴大，至第7d葉片上多個病斑相互粘連；至第 12d，大量葉片干枯。切取病斑組織經重新分離、培養，所得分離物于原接種的病原物形態特 征一致。從而完成了 Koch’ s法則的驗證，確定所得的分離物為導致馬唐病害的病原物。按其特征鑒定為半知菌類(Fungi Imperfecti)，腔孢綱(Coelomycetes)，黑盤孢 目(Melanconiales)，炭疽菌屬(Colletotrichum Corda)。致病真菌的分離、篩選與鑒定
4從浙江新昌采集到罹病馬唐葉片，剪取病健交界處葉片，用6%次氯酸鈉溶液進行表面消 毒，然后置于PSA培養基上，在25°C恒溫箱中培養，一周后進行單菌分離純化，進而，進行單 菌株產孢子量、防除馬唐等單子葉雜草效果試驗，從中篩選出高產高效菌株Cds0501，并在 PSA培養基上觀察該病原菌的顯微形態和形態特征。另外，本發明還提供一種生物除草劑，包括以編號為CGMCC No. 2867的炭疽菌 (Colletotrichum Corda)菌株的產孢菌種。在一個方式中，該生物除草劑還包括化學除草 劑或輔助試劑。在一個優選的方式中，該除草劑的組分與各組分的重量百分比含量為編號為Cds0501的炭疽菌純孢子 80-95%化學除草劑0-18%輔助劑2-5%。其中，所述的化學除草劑為阿特拉津、丁草胺、精禾草克、百草枯中的一種或幾種。所述的輔助劑為吐溫20、吐溫80、葡聚糖、植物油、纖維素、聚醚硅油等中的種或 幾種。該生物除草劑的制備方法，按以下步驟進行(1)培養基的準備菌株Cds0501可用PDA固體培養基、麩皮液體培養基活化并誘 導分生孢子的產生；(2)菌株Cds0501的活化培養挑取少許保存的該菌菌絲塊PDA平板培養基中， 28°C恒溫暗培養，活化菌株；(3)菌株種子液的培養挑取少許步驟(2)培養的菌塊，接入麩皮液體培養基的 三角瓶中，28°C，150rpm，振蕩培養3-4天至產生豐富分生孢子；(4)菌種孢子的生產培養與收集在無菌條件下，吸取步驟(3)中液體培養的分生 孢子接種于IL麩皮液體培養基的三角瓶中，置于28°C，150rpm振蕩培養3_4天，用雙層紗 布過濾除去菌絲體，孢子懸浮液經7000rpm離心10分鐘，收集沉淀，干燥備用；(5)將按配方秤取的純孢子、化學除草劑和輔助劑，混合成生物除草劑，分裝，密 封，即成產品。將上述炭疽菌株Cds0501除草劑用于防除雜草的方法為可用濃度為3_50g/L的炭疽菌菌株Cds0501的純分生孢子水懸浮液對雜草進行葉 面噴施或種子處理；或將該菌的分生孢子加以各類輔助劑配成水懸浮液使用；或分生孢子 與輔助劑的混合物與5-20%常規用量的化學除草劑混合水懸浮液使用；或者與其他雜草 上分離得到的致病性菌株聯合使用，其配合使用方法都是本領域技術人員所掌握的常規技 術。本發明與現有技術相比，其有益效果如下1、菌株Cds0501對小麥、大豆、棉花、豇豆、向日葵、玉米、花生、水稻等作物的小苗
都安全，對狗尾草、稗草、牛筋草等雜草有部分感染，而對馬唐是嚴重感染，二周后的控制效 果在70%左右，該菌的寄主范圍相對專一，對農業生產是安全的(見表2)；故采用本發明 馬唐炭疽菌菌劑不僅可用于防除大豆、棉花、花生等雙子葉作物田塊雜草，也可用于防除水 稻、玉米和麥子等單子葉作物田塊雜草，這明顯優于幾乎不能在單子葉作物與單子葉雜草 間進行選擇的常規防除單子葉雜草的化學除草劑，因此，也就優于現有技術中的美國專 利。
2、與相關輔助劑配合使用，該菌劑對目標雜草馬唐的控制效果可以達到 85% -100%，特別是3葉齡以下的植株。3、本發明篩選獲得的菌株Cds0501，作為制備菌劑的生產用種，其對培養條件適應 性廣，在15-35°C，pH5-12均可生長和產孢，培養基原料易得，成本低廉，利用常用的農業基 礎產品即可進行大批量生產，孢子產量高(5. OX IO6個孢子/mL液體培養基)；而作為防除 雜草的感病菌劑，其在田間致病條件較寬，10-40°C孢子均可萌發，失活溫度為53°C，容易感 染防除對象，研究顯示該菌有較大的潛力開發成商品化生物除草劑，可用于大多數作物田 控制雜草馬唐。因此，本發明利用炭疽菌菌株Cds0501發展生物除草劑控制馬唐，該菌株對主要 農作物安全性高，不感染禾本科作物和闊葉植物，應用范圍廣，因而該生物除草劑具有極為 顯著的經濟和社會效益。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，但這并不對本發明構成任何意義 上的限定。實施例1 防除馬唐高效菌株Cds0501的篩選從自然發生于浙江新昌地區的野外馬唐病害植株上，采集馬唐的病葉，用PDA培 養基進行病原真菌的分離培養，從中分離出數種真菌菌株，并對它們的致病性進行了如下 試驗；在顯微鏡下挑取各菌株的單孢子，分別接種在PDA培養基上，于黑暗、28°C下培養，觀 察病原真菌純培養的菌落特征；另取直徑6mm的各菌落圓片接種在PDA平板中央，分別于7 天后測量各菌落直徑；將各菌株配制成濃度為1 X IO6個/mL的孢子懸浮液噴施2葉1心 馬唐植株上，處理4天后，觀察各菌株的致病特性(見表1)，從中選擇出發病死亡率強、對作 物安全的彎孢霉屬菌株Mds0404、炭疽菌菌株Cds0501，保存；馬唐罹病植株葉片病斑初為 圓點狀，后擴大為大小不等的扁橢圓形或梭形病斑，病斑最大可達6. 5-8 X 22-24mm,周圍有 黃色暈圈，外緣褐色，中部凹陷呈灰色或缺刻，有些在病部形成輪紋狀排列小黑點。葉鞘基 部病斑擴展后常連接愈合導致植株易折斷倒伏。表1馬唐病原真菌菌落特征及其對馬唐致病率的比較 實施例2 菌株Mds0404寄主范圍的測定經寄主范圍測定明確，菌株Cds0501對棉花、向日葵、大豆、豇豆、花生、玉米、小麥
6及水稻等作物安全；稗草、牛筋草及狗尾草有感染，而馬唐為嚴重感染(見表2)，一周后的 控制效果在65%左右。表2馬唐炭疽菌菌株Cds0501的寄主范圍測定 注NS表示沒反應；LS表示有感染；HS表示嚴重感染實施例3 本發明一種生物除草劑及其制備方法1按配方稱取菌株Cds0501純孢子83克、阿特拉津15克、吐溫2克，混合成生物除 草劑100克。該劑的制備方法按以下步驟進行(1)培養基的準備菌株Cds0501可用以下任一種培養基活化并誘導分生孢子的
產生PDA培養基馬鈴薯150g，葡萄糖10g，瓊脂18g，水IL ；PSA培養基馬鈴薯150g，蔗糖10g，瓊脂18g，水IL ；麩皮培養基麩皮50g，瓊脂18g，水IL ；玉米粉培養基玉米粉50g，瓊脂18g，水IL ；淀粉酵母培養基淀粉10g，酵母粉2g，瓊脂ISgjjC IL ；Czapek 培養基=KNO3 2g ；K2HPO4 Ig ；KCl 0. 5g ；MgSO4. 7H20 0. 5g ；FeSO4 0. Olg ；蔗 糖30g ；瓊脂18g ；水IL0(2)菌株Cds0501的活化培養挑取少許保存的該菌菌絲塊至步驟(I)PDA平皿培 養基中，28°C恒溫暗培養，活化菌株；(3)菌株種子液的培養挑取少許步驟(2)培養的菌塊，接入盛有步驟(I)PD培養 液(PDA培養基不加瓊脂即成)的三角瓶中，28°C，150rpm，振蕩培養3_5天至菌液產生豐
7富菌絲球，待用；(4)菌種孢子的生產培養與收集采用液體培養的方法；在無菌條件下，將 Cds0501菌株種子液用四層擦鏡紙過濾，調節孢子懸浮液的濃度為1乂106個/!^，用移液 槍吸取1 μ L上述孢子懸浮液，移入裝有600mL麩皮液體培養基的IL容量三角瓶中，28°C、 160rpm黑暗振蕩培養3-4d，用紗布過濾除去菌絲體，7000rpm離心收集沉淀即可得孢子，干 燥后保存備用；(5)將按配方稱取的純孢子、阿特拉津、吐溫，混合成生物除草劑，分裝，密封，即成產品。實施例4 本發明生物除草劑及其制備方法2按配方稱取菌株Cds0501純孢子95克、植物油5克，混合成生物除草劑100克；該 劑的制備方法同于實施例3。實施例5 本發明生物除草劑及其制備方法3按配方稱取菌株Cds0501純孢子90克、丁草胺7克、聚醚硅油3克，混合成生物除 草劑100克；該劑的制備方法同于實施例3。實施例6 純孢子防除馬唐草效果試驗將菌株Cds0501在麩皮液體培養基，280C、160rpm振蕩培養3_4天后，通過紗布過 濾除去菌絲體，收集濾液并鏡檢孢子濃度(1 X IO6個/ml)，用手持噴霧器噴施濾液，接種到 1葉1心至3葉1心期的馬唐上，保濕48小時，處理10天后，對該草的控制效果達到90% 以上。這種孢子接種在馬唐上的致病癥狀為在葉片、葉鞘等部位初現明顯的水漬狀斑點， 之后斑點逐漸擴大，葉片上多個病斑相互粘連，大量葉片干枯。經觀察，病葉表面的孢子與 所噴施的炭疽菌Cds0501孢子一樣。以上實驗條件下的發病癥狀與自然病癥相似。實施例7 孢子+輔助劑+5-20%常規用量的化學除草劑除馬唐草效果試驗按實施例3或5方法，先配制出添加有輔助劑的孢子懸浮液，再添加常規用量 5-20%的阿特拉津、丁草胺、精禾草克、百草枯等，均勻噴施在2. 5-3. 5葉齡期的馬唐上，分 別保濕12小時和不保濕兩組處理；處理后10天，保濕一組的馬唐被控制100%，未保濕一 組的馬唐被控制70-90%。
權利要求
一種生物除草劑，其特征在于，包括保藏號為CGMCC No.2867的炭疽菌(Colletotrichum Corda)菌株產生的孢子。
2.如權利要求1所述的生物除草劑，其特征在于，該除草劑還包括化學除草劑或輔助 試齊LU
3.如權利要求2所述的生物除草劑，其特征在于，該除草劑的組分與各組分的重量百 分比含量為保藏號為CGMCC No. 2867的炭疽菌純孢子 80-95% ；化學除草劑0-18%輔助劑2-5%。
4.如權利要求3所述的生物除草劑，其特征在于，其中，所述的化學除草劑為阿特拉 津、丁草胺、精禾草克、百草枯中的一種或幾種；所述的輔助劑為吐溫20、吐溫80、葡聚糖、 植物油、纖維素、聚醚硅油等中的一種或幾種。
5.一種制備權利要求1所述生物除草劑的方法，其特征在于，包括(1)培養基的準備保藏號為CGMCCNo. 2867菌株可用PDA固體培養基、麩皮液體培養 基活化并誘導分生孢子的產生；(2)菌株的活化培養挑取少許保存的該菌菌絲塊PDA平板培養基中，28°C恒溫暗培 養，活化菌株；(3)菌株種子液的培養挑取少許步驟(2)培養的菌塊，接入麩皮液體培養基的三角瓶 中，28°C，150rpm，振蕩培養3_4天至產生豐富分生孢子；(4)菌種孢子的生產培養與收集在無菌條件下，吸取步驟(3)中液體培養的分生孢子 接種于IL麩皮液體培養基的三角瓶中，置于28°C，150rpm振蕩培養3_4天，用雙層紗布過 濾除去菌絲體，孢子懸浮液經7000rpm離心10分鐘，收集沉淀，干燥獲得純孢子。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，該方法所使用的菌株來自本馬唐罹病植株 葉片和莖干上有褐色小點、橢圓形或梭形大病斑，周圍有黃色暈圈，外緣褐色，中部凹陷呈 灰色或缺刻。
7.一種使用權利要求1所述試劑生物除草的方法，其特征在于將保藏號為CGMCC No. 2867的炭疽菌(Colletotrichum Corda)菌株在麩皮液體培養基，28°C、160rpm振蕩培 養3-4天后，通過紗布過濾除去菌絲體，收集濾液并鏡檢孢子濃度，讓其孢子濃度為1 X IO6 個/ml，用手持噴霧器噴施濾液，接種到1葉1心至3葉1心期的馬唐上，保濕48小時。
全文摘要
本發明提供一種包括保藏號為CGMCC No.2867的炭疽菌(Colletotrichum Corda)菌株產生的孢子的生物除草劑，以及如何獲得該除草試劑的方法和如何使用該試劑進行作物中雜草的去除。特別的，提供一種除去作物中馬唐的生物除草劑，包括保藏號為CGMCC No.2867的炭疽菌菌株產生的孢子。利用該生物除草劑不僅可以防治雙子葉植物中的雜草，還可以防治單子葉植物中的雜草；特別的，該菌劑對目標雜草馬唐的控制效果可以達到85％-100％，特別是3葉齡以下的植株。
文檔編號C12N1/14GK101919412SQ20101023163
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者姜華, 孫國昌, 張震, 杜新法, 柴榮耀, 毛學琴, 王教瑜, 王艷麗, 邱海萍 申請人:浙江省農業科學院