專利名稱：一種從豬血中提取超氧化物歧化酶sod的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，特別涉及一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD 的方法。
背景技術：
超氧化物歧化酶(SOD)是一種能催化超氧陰離子自由基歧化反應的金屬酶，其主要作用是能專一地清除生物氧化過程中產生的超氧陰離子自由基，是生物體防御活性氧毒害的關鍵性防線，能預防或治療由超氧陰離子自由基引起的多種疾病，是一種很有用途的藥用酶，對人體血栓癥、動脈硬化、高血糖有一定的預防和輔助治療作用，還具有抗衰老、抗輻射和防止細胞突變等作用具有能夠清除體內過多氧自由基的特性，從而在醫學、食品、化妝品等領域得到廣泛的應用。自1969年首次從牛紅細胞中分離出SOD以來，人們相繼從牛、豬、羊、馬等動物紅細胞、肌肉、肝臟組織以及植物中分離和純化出SOD。現在我國大部分都是采用生化方法提取S0D，如基因合成、微生物發酵以及化學提取，同時在SOD純化中大多使用瓊脂糖凝膠法和陰陽離子樹脂交換法等方法，這些方法普遍存在生產工藝復雜、成本高、周期長等缺點。我國作為豬肉產業大國，擁有豐富的豬血資源，但大部分豬血除了進行簡單加工做飼料用外，則被直接拋棄，不僅極大地浪費了豬血資源，還嚴重污染了環境。豬血中的的營養成分豐富，除含有豐富的蛋白外，還含用超氧化物歧化酶(SOD)等活性物質，對豬血進行SOO的有效提取將極大提高豬血的附加值，產生良好的經濟效益。
發明內容
本發明的目的就在于克服上述常規方法中存在的不足，而提供一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，該方法工藝簡單、生產周期短、適合工業化生產。如上構思，本發明的技術方案是一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法， 其特征在于依照如下步驟進行(1)向豬血中加入抗凝劑，離心3000rpm離心10 30min去血漿，收集紅細胞；然后加入紅細胞體積3 5倍的0. 9% NaCl溶液進行清洗，離心4000rpm離心10 30min， 棄去上清液后，收集紅細胞并加入紅細胞體積1 3倍體積的去離子水，0 4°C水浴下靜置10-1 后得到溶血液；(2)向溶血液中緩慢加入4°C以下冷預過的95%乙醇后，再緩慢加入預冷過的的氯仿，然后攪拌、靜置、離心后收集上清液獲得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后攪拌、離心，取沉淀物；(4)將沉淀物用加入1-3倍體積的去離子水進行溶解，并進行熱處理后，迅速冰浴至4°C以下，然后，加入K2HPO4緩沖液，攪拌、離心后獲得上清液；(5)采用螺旋梯度洗脫技術對上清液進行純化處理，獲得純化酶液；(6)將純化酶液通過透析工藝除去鹽離子，并最終將精致酶液進行冷凍干燥，可以獲得最終的豬血SOD成品。上述抗凝劑采用草酸鉀溶液，其濃度為2 5%，其體積是豬血體積的10%。上述去離子水的pH = 9。上述步驟O)中95%乙醇的加入量是溶血液體積的0. 2 0. 5倍，氯仿的加入量是溶血液體積的0. 1 0. 5倍，溶血液加入95%乙醇和氯仿后攪拌10-20min、靜置0. 5_lh、 4000rmp離心10 30min，收集上清液獲得粗酶液。上述步驟(3)中丙酮的加入量是粗酶液體積的1 3倍，粗酶液加入丙酮后攪拌 10-15min,4000rmp 離心 10 30min，取沉淀物。上述步驟中熱處理的條件為溫度40 70°C、時間10 30min ；K2HPO4緩沖液的加入量是沉淀物體積的20 30倍，沉淀物加入K2HPO4緩沖液后攪拌5-8min，然后 4000rmp離心10 30min，獲得上清液。上述步驟(5)中螺旋梯度洗脫技術采用濃度為2 50mmol/L、pH值為7. 2 9. 0 的K2HPO4緩沖液通過梯度鹽析原理使雜質逐級沉淀的方法來實現SOD酶的純化。本發明的優點是本發明綜合生物與化學方法，采用高效分離、提取及純化技術， 生產方法簡單、周期短、污染小，適用于大規模工業化生產。經檢測，采用本方法提取的豬血 Cu/Zn-SOD，其單位酶活可以達到6000U/mg以上。
具體實施例方式實施例1 向豬血中加入10%體積的2 5%的草酸鉀溶液，3000rpm離心20min去血漿， 收集紅細胞。然后加入5倍的0. 9% NaCl溶液進行清洗，期間不斷攪拌后，4000rpm離心 20min。棄去上清液后，收集紅細胞并加入2倍體積比的去離子水(pH = 9)，4°C水浴下靜置 IOh后得到溶血液；向溶血液中緩慢加入4°C下冷預過的0. 25體積的95%乙醇后，再緩慢加入預冷過的0. 2體積的氯仿，攪拌15min。靜置0.證后，4000rmp離心20min，收集上清液獲得粗酶液；向粗酶液中加入3倍體積的丙酮，攪拌IOmin后，4000rmp離心20min，取沉淀物；將沉淀物用加入2倍體積的去離子水進行溶解，并在60°C溫度下熱處理15min后，迅速冰浴至4°C以下。然后，加入20倍體積的K2HPO4緩沖液，攪拌5min后，4000rmp離心20min， 獲得上清液。采用濃度為8. 5mmol/L、pH值為8. 2的K2HPO4緩沖液通過梯度鹽析原理使雜質逐級沉淀，可以獲得純化酶液；將純化酶液通過透析工藝除去鹽離子，并最終將精致酶液進行冷凍干燥，可以獲得最終的豬血SOD成品。實施例2 向豬血中加入10%體積的2 5%的草酸鉀溶液，3000rpm離心30min去血漿， 收集紅細胞。然后加入3倍的0. 9% NaCl溶液進行清洗，期間不斷攪拌后，4000rpm離心 20min。棄去上清液后，收集紅細胞并加入3倍體積比的去離子水(pH = 9)，4°C水浴下靜置IOh后得到溶血液；向溶血液中緩慢加入4°C下冷預過的0. 5體積的95%乙醇后，再緩慢加入預冷過的0. 5體積的氯仿，攪拌15min，靜置0. 5h后，4000rmp離心30min，收集上清液獲得粗酶液；向粗酶液中加入2倍體積的丙酮，攪拌IOmin后，4000rmp離心20min，取沉淀物；將沉淀物用加入2倍體積的去離子水進行溶解，并在50°C溫度下熱處理20min后，迅速冰浴至4°C以下。然后，加入25倍體積的K2HPO4緩沖液，攪拌5min后，4000rmp離心20min，獲得上清液。采用濃度為8. 5mmol/L、pH值為8. 2的K2HPO4緩沖液通過梯度鹽析原理使雜質逐級沉淀，可以獲得純化酶液；將純化酶液通過透析工藝除去鹽離子，并最終將精致酶液進行冷凍干燥，可以獲得最終的豬血SOD成品。
權利要求
1.一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于依照如下步驟進行(1)向豬血中加入抗凝劑，離心3000rpm離心10 30min去血漿，收集紅細胞；然后加入紅細胞體積3 5倍的0. 9% NaCl溶液進行清洗，離心4000rpm離心10 30min，棄去上清液后，收集紅細胞并加入紅細胞體積1 3倍體積的去離子水，0 4°C水浴下靜置 10-15h后得到溶血液；(2)向溶血液中緩慢加入4°C以下冷預過的95%乙醇后，再緩慢加入預冷過的的氯仿， 然后攪拌、靜置、離心后收集上清液獲得粗酶液；(3)向粗酶液中加入丙酮，然后攪拌、離心，取沉淀物；(4)將沉淀物用加入1-3倍體積的去離子水進行溶解，并進行熱處理后，迅速冰浴至 40C以下，然后，加入K2HPO4緩沖液，攪拌、離心后獲得上清液；(5)采用螺旋梯度洗脫技術對上清液進行純化處理，獲得純化酶液；(6)將純化酶液通過透析工藝除去鹽離子，并最終將精致酶液進行冷凍干燥，可以獲得最終的豬血SOD成品。
2.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述抗凝劑采用草酸鉀溶液，其濃度為2 5%，其體積是豬血體積的10%。
3.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述去離子水的PH = 9。
4.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步驟O)中95%乙醇的加入量是溶血液體積的0. 2 0. 5倍，氯仿的加入量是溶血液體積的0. 1 0. 5倍，溶血液加入95%乙醇和氯仿后攪拌10-20min、靜置0. 5_lh、4000rmp 離心10 30min，收集上清液獲得粗酶液。
5.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步驟(3)中丙酮的加入量是粗酶液體積的1 3倍，粗酶液加入丙酮后攪拌10-15min， 4000rmp離心10 30min，取沉淀物。
6.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步驟(4)中熱處理的條件為溫度40 70°C、時間10 30min ;Κ2ΗΡ04緩沖液的加入量是沉淀物體積的20 30倍，沉淀物加入K2HPO4緩沖液后攪拌5-8min，然后4000rmp離心 10 30min，獲得上清液。
7.根據權利要求1所述的一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，其特征在于 上述步驟(5)中螺旋梯度洗脫技術采用濃度為2 50mmol/L、pH值為7. 2 9. 0的K2HPO4 緩沖液通過梯度鹽析原理使雜質逐級沉淀的方法來實現SOD酶的純化。
全文摘要
該發明公開了一種從豬血中提取超氧化物歧化酶SOD的方法，該方法采用分離、清洗、破碎一步分離法與分離血漿與血球并得到溶血液，經乙醇-氯仿溶解沉淀法得到粗酶液，再經丙酮沉淀法沉淀得到SOD的粗蛋白，對上清液熱變性，取上清棄去沉淀，采用螺旋梯度洗脫技術對上清液進行進一步的分離與純化提高單位酶活，得到純化的SOD酶液，經過膜過濾除鹽，最后進行冷凍干燥，達到純化的SOD的產品，簡化了生產工藝和設備，適合工業化大規模生產的要求。
文檔編號C12N9/08GK102337252SQ201010230060
公開日2012年2月1日 申請日期2010年7月19日 優先權日2010年7月19日
發明者盧進峰, 吳明文, 宋古全, 王雅靜 申請人:天津寶迪農業科技股份有限公司