專利名稱：用于誘導白血病細胞分化的小分子rna的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種雙鏈RNA分子及其應用，特別是一種能夠誘導白血病細胞紅系分 化雙鏈RNA分子及其應用。
背景技術：
根據腫瘤干細胞理論(例如見C. T. Jordan, Μ. L. Guzman, Μ. Noble, Cancer Stem Cells, N. Engl. J. Med. 355 (2006) 1253-1261)及腫瘤細胞分化障礙異常的研究進 展，近年來提出了腫瘤治療的新思路腫瘤誘導分化治療，即，利用分化誘導劑使腫瘤 細胞向正常細胞方向分化，減輕或逆轉腫瘤細胞的惡性表型，從而治療腫瘤(例如見 M.Leszczyniecka 等’ Differentiation therapy of human cancer :basic science and clinicalapplications, Pharmacol. Therapeut. 90(2001) 105-156)。其中維甲酸和砷劑誘 導分化治療早幼粒細胞性白血病，對初診患者的臨床緩解率可達90% (例如見C. Massard 等 Tumour stem cell-targeted treatment :eliminationor differentiation，Annal. Oncology 17(2006) 1620-1624)。盡管實驗研究已發現不少誘導分化劑，但現有的誘導分化劑主要是維甲類、 二甲基亞砜等小分子化合物及一些細胞因子(例如見D. Zhmg等，A critical role for the co—repressor N-CoR in erythroid differentiation andheme synthesis, Cell Res. 17(2007)804-814 ；F.Wolter Resveratrolenhances the differentiation induced by Butyrate in Caco—2 colon cancer cells，J. Nutr. 132(2002)2082—2086 ; B.Zochodne 等，Epo regulates erythroidproliferation and differentiation through distinct signaling pathways -implication for erythropoiesis and Friend virus-induced erythroleukemia, Oncogene 19 (2000)2296-2304)。其中，小分子化合物對人體多有一定的毒性，存在容易復發和產生耐藥性的問題， 例如全反式維甲酸可引起維甲酸綜合癥，嚴重者可危及生命(例如見P. Montesinos等， Differentiation syndrome in patients withacute promyelocytic leukemia treated with all-trans retinoic acid andanthracycline chemotherapy characteristics, outcome, and prognostic factors, Blood 113(2009)775—783)；又例如臨床化療中 常用的抗癌藥物阿糖孢苷，具有很強的骨髓抑制作用(例如見M. C. Cha等，Low dose docosahexaenoicacid protects normal colonic epithelial cells from araC toxicity, BMCPharmaco1. 23(2005)7)。除小分子化合物類藥物外，一些細胞因子可誘導腫瘤細胞的分化(例如見 B. Zochodne 等,Epo regulates erythroid proliferation and differentiationthrough distinct signaling pathways imp 1i cat ion for erythropoiesis and Friendvirus-induced erythroleukemia, Oncogene 19 (2000) 2296-2304)，但細胞因子價 格非常昂貴，極大地限制了其在臨床上的應用。此外，一些基因也可誘導腫瘤細胞的分化(例如見D. C. Tomlinson等，FGFRlpromotes proliferation and survival via activation of the MAPKpathway in bladder cancer, Cancer Res. 69(2009)4613-4620 ;J. H. Schulte 等，Lysine-specific demethylase 1 is strongly expressed in poorIydifferentiated neuroblastoma implications for therapy, Cancer Res. 69 (2009) 2065-2071)，但由于基因治療存在的基 因轉染效率差、持續時間短、基因整合位點隨機等問題尚未解決，因而基因治療手段短期內 還很難在臨床普及。近年來得到廣泛研究的小片段干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)和非 編碼微RNA(microRNA，miRNA)因其對序列同源的靶基因表達的特異性高效抑制作用已成 為基因表達抑制技術的重要成員，并開辟了利用小分子RNA制備核酸藥物的新領域(例如 JAL S. M. Elbashir Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in culturedmammalian cells, Nature 411(2001)494-498·)。與傳統的化合物類藥物和基因治療相比，利用小分子RNA制藥具有以下優點小 分子RNA以序列互補的方式識別靶基因并抑制其表達，因而可以推論能夠作用于靶基因從 而發揮生物學效應的小RNA (有效小RNA)的數量比傳統的化合物類藥物更多；可利用基因 工程技術及文庫技術對小分子RNA進行大規模高通量篩選；與外源大分子基因需依靠細胞 內表達不同，小分子RNA可由化學合成、體外轉錄、細胞內表達等多種方式獲得，且成本較 低；與表達外源大分子基因不同，小分子RNA的分子小，易于導入細胞發揮作用；對小分子 RNA易于進行基因工程改造及化學修飾，可提高其作用的特異性、有效性、穩定性、靶向細胞 特異性等。因此小分子RNA在核酸制藥和基因治療中顯示出巨大的應用潛力。目前已報道的與K562細胞系或與其相應的紅白血病細胞分化有關的siRNA都是 針對已知基因序列設計的，包括針對3種基因PU. 1、CATU BPl的siRNA。其中，PU. IsiRNA 僅對小鼠紅白血病細胞系MEL有紅系分化中作用(例如見M. Papetti等，Reprogramming Leukemia Cells toTerminal Differentiation and Growth Arrest by RNA Interference of PU. 1, Mol. Cancer Res. 5 (2007) 1053-1062 ；R. Blaybel 等，Downregulation of theSpi-l/PU. 1 oncogene induces the expression of TRIM 10/HERF 1, a key factorrequired for terminal erythroid cell differentiation and survival, Cell Res. 18 (2008) 834-845)，該細胞系是從Friend病毒誘導產生的小鼠紅白血病細胞中分離 出的細胞系，由于該小鼠紅白血病的發生、發展及表現與人類紅白血病有較大差異，因此其 對人類白血病治療的效果尚難預計。此外，已報道的CATl siRNA僅有影響K562的細胞生長速度的效果(例如見 T· MAEDA 等，Changes of Differentiation and Proliferation in K562Cells with Various Levels of Knockdown of Cationic Amino Acid Transporterl, Drag Metab. Pharmacokinet. 23(2008) 181-187)。BPl siRNA僅對K562細胞有升高β -珠蛋白表達量的效果(例如見0. P. Zoueva 等，Inhibition of beta protein lexpression enhances beta-globinpromoter activity and beta-globin mRNA levels in the human erythroleukemia(K562) cell line, Exp. Hemato1. 32(2004)700—708)。同時，由于已知可作為疾病靶標的基因十分有限，因而針對已知基因序列設計 siRNA的可能性被限制在很窄的范圍內。
4
因此，需要提供這樣的SiRNA腫瘤誘導分化分子不僅能具有SiRNA的廉價、無毒 副作用、持續時間長、轉染效率高等有利效果，而且與現有siRNA誘導劑相比作用強、對腫 瘤細胞的多種指標有效。
發明內容
為了解決現有分化誘導劑存在的上述問題，擴展可用于治療白血病等腫瘤 的siRNA序列，本發明人利用基因工程技術從大容量隨機siRNA文庫(見本發明人的 W02004/001044 禾口 M. Chen 等 A universal plasmidlibrary encoding all permutations of small interfering RNA, Proc. Natl. Acad. Sci. 102 (2005) 2356-2361，其全部內容以援 引方式并入本文)中篩選出可誘導人慢性髓樣白血病K562細胞系向紅細胞方向分化(紅 系分化)的siRNA。<1>本發明提供了一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補序列分別是含有以下序列的序 列SEQ NO. 1 :5，ACAUGUACAUAGGGAUAUC3，；禾口SEQ N0. 2 5' GAUAUCCCUAUGUACAUGU3，，其中在SEQ NO. 1和SEQ N0. 2的5，端和/或3，端延伸有1 3個任意核苷酸。<2>本發明的另一方案是一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補序列分別是以下的序列SEQ NO. 1 :5，ACAUGUACAUAGGGAUAUC3，；禾口SEQ N0. 2 5' GAUAUCCCUAUGUACAU⑶3，。<3>本發明還提供了如上<1>或<2>所述的雙鏈RNA分子在制備誘導腫瘤細胞系 K562紅系分化的藥物中的應用。<4>本發明的雙鏈RNA分子能夠使腫瘤細胞系K562的⑶235表達增加、ε -珠蛋 白表達增加、Y “珠蛋白表達增加、β “珠蛋白表達增加、GATA-2表達降低、和/或細胞增殖 速度減慢。<5>本發明還涉及如<1>或<2>所述的雙鏈RNA分子在制備治療人慢性髓樣白血 病的藥物中的應用。<6>本發明還提供了編碼如<1>或<2>所述的雙鏈RNA分子的DNA分子。<7>本發明還提供了包含如<5>所述DNA分子的核酸載體。<8>本發明還提供了如<5>所述的DNA分子和/或如<6>所述的核酸載體在制備 誘導腫瘤細胞系Κ562紅系分化的藥物中的應用。<9>本發明的DNA分子和/或核酸載體能夠使腫瘤細胞系Κ562的⑶235表達增 加、ε-珠蛋白表達增加、Y-珠蛋白表達增加、β-珠蛋白表達增加、GATA-2表達降低、和 /或細胞增殖速度減慢。<10>本發明還提供了如<5>所述DNA分子或如<6>所述的核酸載體在制備治療人 慢性髓樣白血病的藥物中的應用。令人驚訝的是，本發明的可誘導人慢性髓性白血病Κ562細胞向紅細胞方向分化 (紅系分化)的clone-67 siRNA的序列目前尚未有報道。本發明的clone-67siRNA具有誘 導人慢性髓性白血病K562細胞向紅細胞方向分化(紅系分化)的作用，使K562細胞分化 程度增高，減慢其增殖速度，從而減輕其惡性表型。
本發明的cl0ne-67siRNA是從大容量隨機siRNA文庫中篩選出來的，不與已知的 任何基因具有同源性，因此不同于現有的治療白血病或誘導白血病細胞體外分化的siRNA。
下面將結合附圖對本發明進行具體描述，附圖中圖1顯示經隨機挑選的12個siRNA轉染的K562細胞的⑶235陽性細胞比例；圖2顯示clone_67siRNA轉染增加K562細胞的CD235表達；圖3顯示clone-67siRNA轉染增加K562細胞的ε -珠蛋白、γ -珠蛋白和β -珠
蛋白表達量；圖4顯示clone-67siRNA轉染后K562細胞的GATA-2和GATA-1表達量的改變；圖5.轉染clone_67siRNA后K562細胞的增殖速度。
具體實施例方式本發明使用的大容量隨機siRNA文庫是本發明人建立的大容量隨機siRNA文 庫(見 W02004/001044 ；禾口 M.Chen 等，A universal plasmid libraryencoding all permutations of small interfering RNA，Proc. Natl. Acad. Sci. 102(2005)2356-2361，其 全部內容以援引方式并入本文)，該siRNA文庫中有大約3xl07個不同的siRNA序列。本發明使用的K562細胞系(購自ATCC，貨號CCL-243)是從人慢性髓樣白血病患 者的腫瘤細胞中分離出的一個細胞系，屬于紅白血病細胞系，是研究白血病細胞分化的常 用細胞模型。K562細胞向紅細胞方向分化(紅系分化)后會出現一系列的特征性改變例 如⑶235、珠蛋白表達增高，并且隨著分化進程的推進，GATA-2的表達逐漸降低，而GATA-I 的表達逐漸增加；K562細胞向紅細胞方向分化(紅系分化)后隨著分化進程的推進，細胞 增殖速度逐漸減慢，進入終末分化后最終將退出細胞周期不再增殖。本文中的術語“紅系分化”是指分化程度低的腫瘤細胞經過一系列相關基因表達 的調控過程，向具有紅細胞性質的無惡性的高分化細胞轉變的過程。紅系分化是本領域中 常用于評價細胞分化程度和藥物對腫瘤細胞分化調控效果的指標之一。⑶235在造血前體細胞中不表達，而K562細胞向紅細胞方向分化(紅系分化)后 會出現的特征性改變之一是CD235開始表達并逐漸增加，成熟紅細胞保持高水平的CD235 量。血紅蛋白的產生是紅系分化的重要標志之一，血紅蛋白由血紅素及珠蛋白組成， 組成血紅蛋白的主要是α-珠蛋白和β-珠蛋白，β-珠蛋白分5種ε-珠蛋白、γ(Α和 G)-珠蛋白，δ-珠蛋白及β-珠蛋白。Κ562細胞向紅細胞方向分化(紅系分化)后會出 現的特征性改變之一是某些種類的珠蛋白的表達增加。GATA-2和GATA-1是紅系分化過程中重要的轉錄因子。Κ562細胞向紅細胞方向分 化(紅系分化)后隨著分化進程的推進，GATA-2的表達逐漸降低，而GATA-I的表達逐漸增 加。利用實施例1中的篩選方法從上述大容量隨機siRNA文庫中以Κ562細胞為對象 篩選出CD235陽性的細胞，對這些陽性細胞中所含的siRNA編碼序列進行測序，可得知引起 ⑶235表達增高的siRNA的序列，再進一步對這些siRNA導入Κ562細胞后的作用進行鑒定。
6
以上述方法，我們從隨機SiRNA文庫中篩選到一個可誘導K562細胞向紅細胞方向 分化(紅系分化)的siRNA :clone-67，它的兩條互補鏈的DNA編碼序列分別為(方向為從 5，至Ij 3，)ACATGTACATAGGGATATC 禾口 GATATCCCTATGTACATGT。不過，本發明并不限于clone-67的序列本身，本發明還包括clone-67siRNA的 序列為基礎，在其序列兩端各添加1 3個任意核苷酸的序列，這是因為siRNA的作用機 制是對同源序列的調控，已表明siRNA的作用效果主要取決于其中間的核心序列，而靠近 兩側的堿基序列對其作用效果的影響較小(例如見Q. Du等，A systematic analysis of the silencingeffects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites, Nucleic Acids Res. 33 (2005) 1671-1677.)，且在 siRNA 的兩側添加 1 3 個核苷酸不但不會減弱該siRNA的作用效果，還會增強siRNA的效果(例如見S. D. Rose 等，Functional polarity is introduced by Dicer processing ofshort substrate RNAs, Nucleic Acids Res. 33(2005)4140-4156.及 D-H Kim 等，Synthetic dsRNA Dicer sustrates enhance RNAi potency and efficacy, Nature Biotech.23 (2005)222-226.)。實施例實施例1 12個陽性siRNA的篩選K562細胞用添加10%胎牛血清(購自Sigma，貨號12003C)的IMDM培養基(購 自Thermo-Fisher，貨號SH30228. 01B)在37°C 5%二氧化碳的細胞培養箱(購自三洋)中 培養(除非另外指出，以下各實施例中K562細胞培養方式與此相同)，將包含3xl07個不同 siRNA編碼序列的隨機siRNA文庫混合質粒用Lipofectamine 2000 (購自Invitrogen，貨 號11668-019)轉染入6. 7xl07個K562細胞，轉染后48小時，向培養液中加入G418 (購自 Merck，貨號345810 ；終濃度800ug/ml)殺死未被轉染的細胞；14天后，將細胞濃度調整為 IxlO7個細胞/ml，按照每IO6個細胞加入抗體Iug的比例用抗⑶235抗體(購自R&D，貨號 MAB1228)在 4°C標記細胞半小時，再加入Dynabeads Pan Mouse IgG (購自 Invitrogen， 貨號110-41)磁珠，按照磁珠說明書的方法(即，用IOml試劑盒中的溶液1洗細胞一次，將 細胞重懸于溶液1中，濃度IxlO7個細胞/ml，加入磁珠1ml，4°C半小時，加一倍體積溶液1， 磁珠吸2分鐘，棄上清，用溶液1洗磁珠3次，棄上清，得到⑶235陽性的細胞)篩選出⑶235 陽性的細胞。提取以上篩選出的⑶235陽性細胞中的DNA，PCR擴增出其中的siRNA編碼序列， 克隆入pCUH載體，連接產物轉化大腸桿菌，從轉化子中隨機挑取100個測序，再從測序得到 的siRNA編碼序列中隨機挑取12個進行單獨驗證(實施例2中詳述)，即分別將這12個 siRNA按照其編碼序列化學合成與其相對應的雙鏈siRNA (由Invitrogen合成)，以排除載 體可能對細胞產生的非特異性影響，以驗證每個siRNA誘導紅系分化的作用。實施例2 :12個siRNA使K562細胞的⑶235表達不同程度增加除12個隨機合成的siRNA之外，設立一個陰性對照組(Con)轉染時只加轉染試 劑 HiPerFect Transfection Reagent，不力卩 siRNA 組。以實施例1的方法培養K562細胞，并在細胞達到(匯合度約60%時)時，用 HiPerFect Transfection Reagent (購自 Qiagen，Cat#301704)將這些 siRNA 雙鏈分別單 獨瞬時轉染K562細胞，每次轉染時siRNA的濃度為25nM，第一次轉染后60小時進行第二次 轉染，以第二次轉染后48小時72小時收集細胞，用于檢測紅系分化的指標，從而鑒定這些SiRNA誘導紅系分化的作用。檢測分別以12個SiRNA瞬時轉染的K562細胞的⑶235表達各組細胞兩次轉染 后72小時收集細胞，用FITC標記的抗CD235抗體(購自BD Pharmingen，貨號559943) 4°C 染色1小時，PBS (磷酸鹽緩沖液)洗細胞3次后用Accuri公司的Accuri C6流式細胞儀 檢測⑶235的表達。測試結果如圖1所示，圖1是各SiRNA轉染后⑶235陽性細胞比例的流式細胞儀 檢測圖，從中可以看出，12個siRNA中有6個瞬時轉染K562細胞后72小時可使⑶235陽性 細胞百分比較陰性對照(Con)增加到1.5倍以上，其中cl0ne-67siRNA使陽性細胞百分比 升高的程度最高，因此預計cl0ne-67siRNA對K562細胞具有最強的誘導紅系分化能力，選 取該clone-67進行以下多個紅系分化指標的檢測。實施例3 :clone-67siRNA使K562細胞的CD235表達增加CD235細胞的培養方式和轉染方式同實施例2，除實施例2中獲得的 cl0ne-67siRNA之外，所有鑒定實驗均設立兩個陰性對照組(除非另外指出，以下各實施 例中的陰性對照與此相同)轉染時只加轉染試劑HiPerFect Transfection Reagent，不 加siRNA組(Con組)；轉染不作用于任何基因的陰性對照Allstars negative control siRNA(購自 Qiagen，Cat#1027280)組(Allstars 組)。檢測以clone_67siRNA、Con和Allstars瞬時轉染的K562細胞的CD235表達各 組細胞兩次轉染后72小時收集細胞，用FITC標記的抗⑶235抗體(購自BD Pharmingen, 貨號559943) 4°C染色1小時，PBS (磷酸鹽緩沖液)洗細胞3次后用Accuri公司的Accuri C6流式細胞儀檢測⑶235的表達。測試樣品制備和測定方法100ulPBS緩沖液中5x10s 個細胞，加0. 5ug抗體，流式細胞儀在525nm處用儀器設定程序Protocol :525nm. PRO收集 20000個細胞進行分析。以上實驗均獨立重復3次以上。測試結果如圖2和表1所示，圖2A是⑶235表達量的流式細胞儀檢測圖，其中左圖 是Con的細胞流式分析，中間圖是Allstars的細胞流式分析，右圖是cl0ne-67siRNA的細 胞流式分析，圖2B是上述3個分析結果的疊加圖，圖2C是顯示上述3組的⑶235陽性細胞 的百分比的柱狀圖。圖中的平均值士標準差是3次獨立重復實驗的平均值和標準差。** 代表顯著性t檢驗ρ < 0. 01。從中可以看出與Con陰性對照相比，clone-67siRNA瞬時轉 染K562細胞后72小時可使⑶235陽性細胞百分比從平均16. 57%增加到平均61. 46%，統 計學分析有顯著差異，且細胞的CD235表達強度顯著增加，而Allstars陰性對照對K562細 胞的⑶235表達無明顯改變。表1.⑶235陽性細胞的百分比 實施例4 :clone-67siRNA使K562細胞的ε -珠蛋白、γ -珠蛋白和β -珠蛋白的 表達增加⑶235細胞的培養方式和轉染方式同實施例2，檢測以clone-67siRNA、Con和Allstars瞬時轉染的K562細胞的ε-珠蛋白、Y-珠蛋白和β _珠蛋白的相對表達以 Taqman熒光定量PCR法檢測珠蛋白相對于內參基因β -肌動蛋白的表達量，Taqman引物及 探針(表2)由ABI公司的PrimerExpress 2. 0軟件設計。引物由Invitrogen公司合成， 探針由Takara公司合成。以Trizol (購自Invitrogen，貨號15596-026)提取細胞總RNA，提取方法為按 每3. 5cm直徑的培養皿面積加Trizol 1ml，充分混勻裂解細胞，室溫放置5分鐘，每Iml Trizol加0. 2ml氯仿，劇烈混勻，室溫放置3分鐘，4°C下12000g離心15分鐘，取上層液相， 按每Iml Trizol量加0. 5ml異丙醇，充分混勻，室溫放置10分鐘，4°C下12000g離心10分 鐘，吸棄上清，用75%乙醇洗RNA沉淀一次，將RNA沉淀晾干，用無RNase水溶解，紫外定量。 取 3ug 總 RNA用superscript II Reverse Transcriptase (購自 Invitrogen)按照說明書 的方法反轉錄為cDNA，反應體積為20ul，從產物中取出Iul用iQ Multiplex Powermix (購 自Bio-Rad)在Biorad公司的iQ5熒光定量PCR儀上進行二重熒光定量PCR反應(儀器參 數)，熒光定量PCR反應參數第一步95°C 3分鐘，第二步95°C 15秒，第三步57°C 55秒， 第二、第三步重復40個循環。珠蛋白的表達量先以內參基因肌動蛋白為標準進行標準 化，轉染cl0ne-67siRNA組的標準化珠蛋白表達量再進一步以Con組的標準化珠蛋白表達 量(設定為1.0)為標準進行標準化，結果表示為珠蛋白的相對表達倍數。以上實驗均獨立 重復3次，結果表示為3次實驗數據的平均值士標準差。表2用于定量PCR實驗的Taqman引物和探針序列 引物及探針序列均為5’ 一 3’測試結果如圖3所示，A顯示了上述3組的ε -珠蛋白的相對表達量，B顯示了上 述3組的Y-珠蛋白的相對表達量，C顯示了上述3組的β-珠蛋白的相對表達量，均表 示為均值士標準差(η = 3)。**代表顯著性t檢驗ρ <0.01。由圖可知與Con陰性對照 相比，clone-67siRNA瞬時轉染K562細胞后72小時可使細胞的ε-珠蛋白、γ-珠蛋白和 β-珠蛋白的表達分別增加1.9、1. 6及2倍，統計學分析有顯著差異。Allstars陰性對照 對Κ562細胞的珠蛋白表達無明顯改變。實施例5 :clone-67siRNA使K562細胞的GATA-2表達降低
⑶235細胞的培養方式和轉染方式同實施例2，檢測以clone-67siRNA、Con和 Al 1 stars瞬時轉染的K562細胞的GATA-2和GATA-1表達。按照標準Western法進行 檢測，其中抗GATA-2和GATA-I多克隆抗體及抗β _肌動蛋白單克隆抗體均購自Santa Cruz (貨號 sc-9008 及 sc-13053)。二抗為 Goat anti-rabbit IgG-HRP 禾口 goat anti-mouse IgG-HRP (均購自 SantaCruz，貨號 sc-2004 及 sc-2005)。顯色試劑盒為 ECL Plus Western BlottingDetection Reagents (購自 Amersham&Phamacia，貨號 RPN2132)。具體實驗步驟 為常規聚丙稀酰胺凝膠電泳，電泳結束后利用轉膜儀(購自Bio-Rad，貨號170-3940)按 轉膜儀說明書將電泳蛋白轉至PVDF膜上，用脫脂奶封閉液室溫封閉膜1小時，用孵育液將 一抗1 400稀釋，將膜浸入一抗稀釋液中，4°C過夜，用TBS洗液室溫洗膜3次，每次15分 鐘，用孵育液將二抗1 4000稀釋，將膜浸入二抗稀釋液中，室溫1小時，用TBS洗液室溫 洗膜 3 次，每次 15 分鐘，將膜取出，按 ECL Plus Western BlottingDetection Reagents 試 劑盒說明書，用試劑盒中的ECL試劑覆蓋膜，室溫放置1分鐘后，曝光X光片。以上Western blot所用的封閉液、孵育液及TBS洗液的具體配方按照分子生物學教科書配置。以上實驗 均獨立重復3次。檢測結果如圖4所示，A顯示對GATA-2的表達量的影響，B顯示對GATA-I的表達 量的影響。從圖中可知，與Con陰性對照相比，clone-67siRNA瞬時轉染K562細胞后72小 時可使細胞的GATA-2表達降低，而GATA-I的表達無明顯改變，Allstars陰性對照對K562 細胞的GATA-2和GATA-I表達均無明顯改變。實施例6 :clone-67siRNA使K562細胞在軟瓊脂和液體培養基中的增殖速度減慢⑶235細胞的培養方式和轉染方式同實施例2，軟瓊脂集落生長實驗按照 CytoSelect 96-ffell Cell Transformation Assay kit (購自 CellBiolabs)的說明書 進行實驗。每組(每組3個孔)細胞均按3000個/孔的密度接種于96孔板上，37°C 5% C02條件下培養8天后對集落中的細胞數用FLUOstar多功能微板測試儀(購自BMG)在 485/520nm (激發/發射)波長處進行定量檢測。液體培養基中細胞增殖速度的檢測按照CellTiter 96 aqueousone-solution cell proliferation assay kit (購自Promega)的說明書進行實驗，用FLUOstar多功能微 板測試儀(每組3個孔)(購自BMG)在492nm處測量吸光值。以上實驗均獨立重復3次。實驗結果如圖5所示，A是各組細胞在軟瓊脂上的增殖速度，B是各組細胞在液體 培養基中的增殖速度。從中可以看出，與Con陰性對照相比，clone-67siRNA瞬時轉染K562 細胞48小時后細胞在軟瓊脂上的增殖速度減慢，統計學分析有差異；在液體培養基中的增 殖速度也減慢，統計學分析有顯著差異。結果表示為3次實驗數據的平均值士標準差。** 代表顯著性t檢驗ρ < 0. 01，*代表顯著性t檢驗ρ < 0. 05。本領域技術人員將意識到，根據以上描述中公開內容和具體實施方式
可以容易地 設計其它等同實施方式的基礎，從而實現與本發明相同的目的，例如以cl0ne-67siRNA的 序列為基礎，進行在其序列兩端各添加1 3個任意核苷酸也會取得同樣的誘導分化效果， 這是因為siRNA的作用機制是對同源序列的調控，已表明siRNA的作用效果主要取決于其 中間的核心序列，而靠近兩側的堿基序列對其作用效果的影響較小，且在siRNA的兩側添 加1 3個核苷酸不但不會減弱該siRNA的作用效果，還會增強siRNA的效果。本領域技術 人員還會意識到，這種等同實施方式不背離所附權利要求書中闡明的本發明精神和范圍。
權利要求
一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補序列分別是含有以下序列的序列SEQ NO.15’ACAUGUACAUAGGGAUAUC3’；和SEQ NO.25’GAUAUCCCUAUGUACAUGU3’，其中在SEQ NO.1和SEQ NO.2的5’端和/或3’端延伸有1～3個任意核苷酸。
2.一種雙鏈RNA分子，其雙鏈互補序列分別是以下的序列 SEQ NO. 1 :5’ ACAUGUACAUAGGGAUAUC3’ ；禾口SEQ NO. 2 :5’ GAUAUCCCUAUGUACAU⑶3’。
3.如權利要求1或2所述的雙鏈RNA分子在制備誘導腫瘤細胞系K562紅系分化的藥 物中的應用。
4.如權利要求3所述的應用，其中所述雙鏈RNA分子使腫瘤細胞系K562的CD235表達 增加、ε-珠蛋白表達增加、Y-珠蛋白表達增加、β-珠蛋白表達增力口、GATA-2表達降低、 和/或細胞增殖速度減慢。
5.如權利要求1或2所述的雙鏈RNA分子在制備治療人慢性髓樣白血病的藥物中的應用。
6.編碼如權利要求1或2所述的雙鏈RNA分子的DNA分子。
7.包含如權利要求5所述的DNA分子的核酸載體。
8.如權利要求5所述的DNA分子和/或如權利要求6所述的核酸載體在制備誘導腫瘤 細胞系Κ562紅系分化的藥物中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其中所述DNA分子和/或所述核酸載體使腫瘤細胞系 Κ562的⑶235表達增加、ε-珠蛋白表達增加、γ -珠蛋白表達增加、β -珠蛋白表達增力口、 GATA-2表達降低、和/或細胞增殖速度減慢。
10.如權利要求5所述的DNA分子和/或如權利要求6所述的核酸載體在制備治療人 慢性髓樣白血病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種用于誘導白血病細胞分化的小分子RNA，及其在在誘導腫瘤細胞系K562紅系分化中的應用。所述小分子RNA不僅具有siRNA的廉價、無毒副作用、持續時間長、轉染效率高等有利效果，而且與現有人白血病細胞紅系分化siRNA誘導劑相比作用強、對腫瘤細胞分化的多種指標有效。
文檔編號C12N15/63GK101892235SQ20101022841
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月9日 優先權日2010年7月9日
發明者盧雅彬, 朱寧, 熊元, 范翠青, 陳梅紅 申請人:北京諾賽基因組研究中心有限公司