專利名稱：大豆過敏蛋白質基因Gly m Bd 28 K的RNAi植物表達載體的制作方法
技術領域：
本發明涉及了一個大豆過敏蛋白質基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表達載體的構 建，屬于分子生物學和生物技術領域。
背景技術：
大豆[Glycine max(L. )Merr.]食物過敏是一個全世界密切關注的公共健康問題。 大豆蛋白在食品加工業的廣泛應用，給大豆過敏人群帶來了一定的食物安全問題。調查發 現，全世界約2 %的成年人和6 % 8 %的兒童患有食物過敏癥，大豆過敏癥多發于5歲以下 的幼兒，主要表現為胃部不適或過敏性皮炎，主要的癥狀是口周紅斑、唇腫、起疹子、皮膚發 癢、腹瀉等，嚴重時可危及生命。RNA干擾(RNA interference,簡稱RNAi)，又稱為轉錄后基因沉默，是一種快速關 閉基因的新方法。也是研究生物體基因表達、調控與功能的一項新技術，其實質是小干擾 RNA(small interfering RNA, siRNA)引起的生物細胞內同源基因的特異性沉默。其作用 機理是siRNA與對應的mRNA特異結合并引起降解，從而阻止mRNA的翻譯，特異性抑制靶基 因的表達，因此成為基因敲除的強大工具。大豆蛋白質中含有多種過敏蛋白。主要的有以下8種Gly m Bd 28K、Gly m Bd30K、Gly m Bd 60K(即β-伴球蛋白的α亞基)、胰蛋白酶抑制劑、Gly m lA、Gly m IB、 Gly m 2和Gly m 3。最安全有效防止大豆食品過敏的措施就是培育脫致敏的大豆新品種。 盡管傳統育種技術已經成功地改善了大豆的營養價值，然而，這種過程不僅耗時，而且利用 空間有限，也很難同時改變大豆多個品質性狀，畢竟，大豆可改良的遺傳資源是有限的，并 且對于大豆性狀的改良只限于已經得到的突變體材料。而RNA干擾技術，能夠擴大可操作 基因的范圍和突變的種類，且對目的基因的表達有了可控性，同時RNAi所具有的特異性、 穩定性、高效、快速以及不改變其它基因的表達等特性，為RNAi在植物功能基因組學研究 以及植物的遺傳改良等方面提供了一個強有力的手段。RNAi技術在作物品質改良上具有廣 闊的應用前景。
發明內容
技術問題本發明涉及大豆過敏蛋白質基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表達載體 的構建，屬于分子生物學領域。構建的RNAi植物表達載體可導入大豆及其它含有過敏蛋白 質的植物，消除過敏蛋白質對過敏人群的危害，可用于植物品種改良。技術方案大豆過敏蛋白質基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表達載體，其構建方法為1)ρΒΙ121的nos序列的改造設計引物Pl、P2，以pBI121質粒為模板，擴增得到含Asc I位點的nos終止子片 段，上游引物Pl :5~-AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA-3、
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下游引物 P2 5~ -GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3、PCR擴增產物連入pMD19-T simple vector中，測序驗證；設計引物P3，與下游引物P2，以含Asc I位點的nos終止子片段為模板，擴增得到 含Sac I和Asc I兩個酶切位點的nos片段，上游引物P3 5~ -CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA-3、PCR 擴增產物連入 pMD19-T simple vector 中，測序驗證，得 PMD-nos ；質粒pMD-nos和質粒pBI121分別EcoR I/Sac I雙酶切，回收pMD_nos中的小段 和pBI121的大片段后連接，得到中間載體pBI121-n0S ；2)pBI121的GUS序列的改造設計引物P4、P5，以pBI121質粒為模板，擴增得到含Pac I位點的⑶S片段，上游引物P4 5~ -CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA-3、下游引物P5 -CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC-3、PCR 擴增后，連入 pMD19-T simple vector 中，測序驗證；設計引物P6，與上游引物P4，以含Pac I位點的⑶S片段為模板，擴增得到上游含 XbaI和Pac I兩個酶切位點的⑶S片段，上游引物P6 -CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT-3、PCR 擴增產物連入 pMD19-T simple vector 中，測序驗證，得 pMD-GUS ；質粒pMD-GUS和質粒pBI121_nos分別Sac I/Xbal雙酶切，回收pMD-GUS中的小 片段和pBI121-n0S中的大片段后連接，得到載體pBI121-n0S-GUS ；3)質粒 pBI121-nos-GUS 和質粒 pCAMBIA3301 分別 EcoR I/Hind III 雙酶切，回收 pBI121-nos-GUS的小片段和pCAMBIA3301的大片段連接，得到載體pGSB ；4)將CHAS內含子序列連入載體pGSB選用‘南農32’作為材料，取幼嫩葉片，按照TaKaRa公司提供的基因組DNA提取試 劑盒說明書要求，提取大豆葉片基因組DNA ；設計引物Fl、F2，以基因組DNA為模板，獲得含酶切位點的CHAS片段，上游引物Fl -CCTTAATTAAGTGTAAGAATTTCTTATGTTACA-3、
下游引物 F2 5~ -CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA-3、PCR 擴增產物連入 pMD19-T simple vector 中，測序驗證，得 pMD-CHAS ；質粒pMD-CHAS和質粒pGSB分別Sac I/Pac I雙酶切，回收pMD-CHAS的小片段和 PGSB的大片段，連接得到載體pGSBI ；5) Gly m Bd 28K干擾片段的獲得選用‘南農32’作為材料，取幼嫩莢果，按照TakaRa公司的Total RNA提取試劑盒 說明書提取豆粒總RNA，取2 μ g總RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA產物。根據NCBI上 公布的GenBank :AB046874. 1大豆過敏蛋白基因Gly m Bd 28K的序列信息設計特異引物， 進行常規聚合酶鏈式PCR反應，分別擴增Gly m Bd 28K干擾片段的正義序列SEQ IDN0. 13 和反義序列SEQ ID N0. 14，擴增Gly m Bd 28K干擾片段的正義序列引物上游引物Rl 5~ -CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、下游引物R2 -TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT-3、
擴增Gly m Bd 28K干擾片段的反義序列引物上游引物R3 -GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG-3~
下游引物 R4 5~ -CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、PCR擴增產物分別連入PMD 19-T simple vector中，測序驗證，得pMD_28S和 PMD-28A ；6) Gly m Bd 28K RNAi植物載體的構建pMD-28A與pGSBI分別Pac I/Xba I雙酶切，回收pMD_28A的小片段與pGSBI的大 片段連接，得到含反義片段的載體PGSBI-28A ；pMD-28S與pGSBI_28A進行Sac I/Asc I雙酶切，回收pMD_28S的小片段與 PGSBI-28SA的大片段連接，得同時含Gly m Bd 28K正義和反義片段的RNAi植物表達載體 PYZ, Xba I/Asc I雙酶切驗證，構建成功。有益效果1.本發明構建的Gly m Bd 28K RNAi載體為大豆中首次報道，可導入大豆及其它 過敏作物中，消除過敏蛋白質對過敏人群的危害，可進行植物品種改良。2. RNAi比反義RNA技術更有效，能在低于反義核酸幾個數量級的濃度下，使目標 基因表達降到極低水平甚至完全“剔除”，從而產生缺失突變體表型，因此更容易產生功能喪失。3.國內外研究表明利用RNAi技術，能快速有效地關閉相應基因，使得生物體產生 相應的功能缺表型，從而可確定對應基因的功能，且具有特異性、高效性和廣泛性的優勢。
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圖1干擾載體的雙酶切鑒定1 :pYZ 質粒；2 :pYZ/Xba I/Asc I ；3 :DNA Marker(10kb/8kb/6kb/5kb/4kb/3kb/2kb/lkb/0. 5kb)圖2Gly m Bd 28K發卡結構示意3Gly m Bd 27K的RNAi植物表達載體質粒圖譜
五具體實施例方式LpBI 121載體的改造1)ρΒΙ121的nos序列的改造①設計引物PI、P2，以pBI121質粒為模板，擴增得到含Asc I位點的nos終止子 片段，上游引物Pl -AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA-3、下游引物P2 -GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC-3、擴增體系模板pBI121 質粒 1. 0μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, PU Ρ2 弓I · # 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · I71) ， PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 2 μ L, ddH20 37.8 μ L ；擴增程序94°C預變性4min，94°C變性 308，51.91退火308，721延伸308，721延 伸IOmin, 30個循環；
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PCR產物連入克隆載體pMD19-T simple vector中，測序驗證；②設計引物P3，與下游引物P2，以含Asc I位點的nos終止子片段為模板，擴增得 到含Sac I和Asc I兩個酶切位點的nos片段，上游引物P3 -CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA-3、擴增體系模板質粒1. 0 μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, Ρ3、Ρ2 引物各 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)，dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Ι71)，Prime STAR HS DNA Polymerase 0. 2μ L, Ckffl2O 37. 8μ L ；擴增程序94°C預變性4min，94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延伸30s，72°C延伸 10min，30個循環；PCR 擴增產物連入 pMD19_T simple vector 中，測序驗證，得 pMD-nos ；③質粒pMD-nos和質粒pBI121分別EcoR I/SacI雙酶切，雙酶切反應 2. 0 μ LNEBuffer 1,0. 2μ L BSA，質粒彡 1 μ g，EcoR I 和 Sac I 各 0. 5 μ L，補水至 20 μ L， 37。C 反應 2h ；回收pMD-nos中的小段和pBI121的大片段，連接得到中間載體pBI121_n0S ；2)pBI121的GUS序列的改造①設計引物P4、P5，以pBI121質粒為模板，擴增得到含Pac I位點的⑶S片段，上游引物P4 -CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA-3、下游引物P5 CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC-3、擴增體系模板pBI121 質粒 1. 0μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, Ρ4, Ρ5 弓I · # 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Ι71) ， PrimeSTAR HS DNAPolymerase 0. 2 μ L, ddH20 37.8 μ L ；擴增程序94°C預變性4min，94°C變性 30s, 57. 2°C退火 30s，72°C延伸 Imin 45s， 72°C延伸10min，35個循環；PCR擴增產物連入pMD19_T simple vector中，測序驗證；②設計引物P6，與上游引物P4，以含Pac I位點的⑶S片段為模板，擴增得到上游 含XbaI和Pac I兩個酶切位點的⑶S片段，上游引物P6 -CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT-3、擴增體系模板1. 0 μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0 μ L, Ρ6、Ρ5 引物各 1· 0 μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Ι71)， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 2μ L, Ckffl2O 37. 8μ L ；擴增程序94°C預變性 4min，94°C 變性 30s，56. 8 °C 退火 30s，72°C 延伸 30s，72 °C 延 伸10min，30個循環；PCR 擴增產物連入 pMD 19-T simple vector 中，測序驗證，得 PMD-GUS ；③質粒pMD-GUS和質粒pBI121_nos分別Sac I/Xba I雙酶切，雙酶切反應 2. 0 μ LNEBuffer 4,0. 2μ L BSA，質粒彡 1 μ g，XbaI 禾口 Sac I 各 0. 5 μ L，補水至 20 μ L， 37 °C反應2h ；回收pMD-GUS中的小片段和pBI 121-nos中的大片段后連接，得到載體 pBI121-nos-⑶S3)質粒pBI121-nos-GUS和質粒pCAMBIA3301 (北京鼎國昌盛生物技術有限責任 公司)分別EcoR I/Hind III雙酶切，雙酶切反應2. 0 μ L Buffer Ε,0. 2μ L BSA，質粒
7≤ 1 μ g，EcoR I 和 HindIII 各 0. 5μ L，補水至 20μ L，37°C，反應 2h ；回收 pBI121-nos_GUS 的小片段和PCAMBIA3301的大片段連接，得到載體pGSB ；2. CHAS (GenBank :ΑΥ310901· 1)內含子序列替換載體pGSB中的GUS序列1)選用‘南農32，作為材料，取幼嫩葉片，按照TaKaRa公司提供的基因組DNA提取 試劑盒說明書要求，提取大豆葉片基因組DNA。根據NCBI上公布的(GenBank :AY310901. 1) 的序列信息為模板，設計引物F1、F2，以基因組DNA為模板，獲得含酶切位點的CHAS片段，上游引物Fl -CCTTAATTAAGTGTAAGAATTTCTTATGTTACA-3、下游引物F2 -CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA-3、擴增體系模板DNA 1. 0μ L( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5· O μ L，Fl、F2 引物各 1· O μ L(20 μ mol · Ι71)， dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · I71)， PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0. 2μ L, Ckffl2O 37. 8μ L ；擴增程序94°C預變性4min，94°C變性 30s，50°C退火 30s，72°C延伸 Imin 30s， 72°C延伸10min，30個循環；PCR 擴增產物連入 pMD19-T simple vector 中，測序驗證，得 pMD-CHAS ；2)質粒pMD-CHAS和質粒pGSB分別Sac I/Pac I雙酶切，雙酶切反應2·OyL NEBuffer 1,0. 2μ 1 BSA，質粒≤ 1 μ g，Sac I 和 Pac I 各 0. 5 μ L，補水至 20 μ L ；37°C,反應 2h ；回收pMD-CHAS的小片段和pGSB的大片段，連接得到載體pGSBI ；3. Gly m Bd 28K RNAi植物載體的構建DGly m Bd 28K干擾片段的獲得選用‘南農32’(審定品種，審定編號國審豆2008025，市場購買)作為材料，取幼 嫩莢果，按照TakaRa公司的Total RNA提取試劑盒說明書提取豆粒總RNA，取2 μ g總RNA 合成cDNA，用RNase消化cDNA產物。根據NCBI上公布的大豆過敏蛋白基因Glym Bd 28K 的序列信息(GenBank :AB046874. 1)設計特異引物，進行常規聚合酶鏈式(PCR)反應，分別 擴增Gly m Bd 28K干擾片段的正義序列SEQ ID N0. 13和反義序列SEQ ID N0. 14，擴增Gly m Bd 28K干擾片段的正義序列引物上游引物Rl 5~ -CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、下游引物R2 -TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT-3、擴增Gly m Bd 28K干擾片段的反義序列引物上游引物R3 5~ -GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG-3~下游引物R4 -CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT-3、Gly m Bd 28K 正義序列的擴增體系模板 cDNA ( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0μ L，R1、R2 引物各 1. 0μ L(20ymol ‘ L-1), dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Γ1)，PrimeSTAR HSDNA Polymerase 0. 2 μ L, ddH20 37. 8 μ L ；擴增程序采用二溫法94 V預變性4min，94 V變性30s，70 V退火45s，72 V延伸 IOmin, 30個循環；Gly m Bd 28K 反義序列的擴增體系模板 cDNA ( < 1 μ g)，IOx RCR Buffer 5. 0μ L，R3、R4 引物各 1. 0μ L(20ymol ‘ L-1), dNTPmix 4. 0μ L(2. 5mmol · Γ1)，PrimeSTAR HSDNA Polymerase 0. 2 μ L, ddH20 37. 8 μ L ；
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擴增程序采用二溫法94°C預變性4min，94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 45s，72°C延伸 IOmin, 30 個循環；P°C R擴增產物分別連入PMD19-T simple vector中，測序驗證，得PMD-28S和 PMD-28A ；2) Gly m Bd 28K干擾載體的構建①載體pGSBI-28A的獲得pMD-28A 與 pGSBI 分別 Pac I/Xbal 雙酶切，雙酶切反應2. 0 μ L NEBuffer 4， 0. 2μ LBSA，質粒彡 1 μ g，Xba I 和 Pac I 各 0. 5 μ L，補水至 20 μ L，37 °C 反應 2h。回收 PMD-28A的小片段與pGSBI的大片段，連接得到含反義片段的載體pGSBI_28A ；②Gly m Bd 28K干擾載體pYZ的獲得pMD-28S 與 pGSBI_28A 分別 Sac I/Asc I 雙酶切，雙酶切反應2. 0 μ L NEBufier 4，0.2yL BSA，質粒彡 lyg，Sac I 和 Asc I 各 0· 5 μ L，補水至 20 μ L，37°C反應 2h。回收 PMD-28S的小片段與pGSBI-28A的大片段，連接得到同時含Gly m Bd 28K正義和反義片段 的干擾載體pYZ。雙酶切(Xba I/Asc I)驗證，構建成功。綜上所述，本發明構建的Gly m Bd 28K RNAi載體pYZ為大豆中首次報道，導入大 豆及其它過敏作物中，消除過敏蛋白質對過敏人群的危害，可進行植物品質改良。國內外研 究表明利用RNAi技術，能快速有效地關閉相應基因。
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權利要求
大豆過敏蛋白質基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表達載體，其構建方法為1)pBI121的nos序列的改造設計引物P1、P2，以pBI121質粒為模板，擴增得到含Asc I位點的nos終止子片段，上游引物P15` AGGCGCGCCGATCGTTCAAACATTTGGCA 3`下游引物P25` GGAATTCGATCTAGTAACATAGATGACACC 3`PCR擴增產物連入pMD19 T simple vector中，測序驗證；設計引物P3，與下游引物P2，以含Asc I位點的nos終止子片段為模板，擴增得到含Sac I和Asc I兩個酶切位點的nos片段，上游引物P35` CGAGCTCGGCGCGCCGATCGTTCA 3`PCR擴增產物連入pMD19 T simple vector中，測序驗證，得PMD nos；質粒pMD nos和質粒pBI121分別EcoR I/Sac I雙酶切，回收pMD nos中的小段和pBI121的大片段后連接，得到中間載體pBI121 nos；2)pBI121的GUS序列的改造設計引物P4、P5，以pBI121質粒為模板，擴增得到含Pac I位點的GUS片段，上游引物P45` CCTTAATTAAATGTTACGTCCTGTAGAA 3`下游引物P55` CGAGCTCTCATTGTTTGCCTCCCTGC 3`PCR擴增后，連入pMD19 T simple vector中，測序驗證；設計引物P6，與上游引物P4，以含Pac I位點的GUS片段為模板，擴增得到上游含Xba I和Pac I兩個酶切位點的GUS片段，上游引物P65` CTCTAGATTAATTAAATGTTACGTCCTGT 3`PCR擴增產物連入pMD 19 T simple vector中，測序驗證，得pMD GUS；質粒pMD GUS和質粒pBI121 nos分別Sac I/XbaI雙酶切，回收pMD GUS中的小片段和pBI121 nos中的大片段后連接，得到載體pBI121 nos GUS；3)質粒pBI121 nos GUS和質粒pCAMBIA3301分別EcoR I/Hind III雙酶切，回收pBI121 nos GUS的小片段和pCAMBIA3301的大片段連接，得到載體pGSB；4)將CHAS內含子序列連入載體pGSB選用‘南農32’作為材料，取幼嫩葉片，按照TaKaRa公司提供的基因組DNA提取試劑盒說明書要求，提取大豆葉片基因組DNA；設計引物F1、F2，以基因組DNA為模板，獲得含酶切位點的CHAS片段，上游引物F15` CCTTAATTAA GTGTAAGAATTTCTTATGTTACA 3`下游引物F25` CGAGCTCACCTGCAAATTGACCAA 3`PCR擴增產物連入pMD19 T simple vector中，測序驗證，得pMD CHAS；質粒pMD CHAS和質粒pGSB分別Sac I/Pac I雙酶切，回收pMD CHAS的小片段和pGSB的大片段，連接得到載體pGSBI；5)Gly m Bd 28K干擾片段的獲得選用‘南農32’作為材料，取幼嫩莢果，按照TakaRa公司的Total RNA提取試劑盒說明書提取豆粒總RNA，取2μg總RNA合成cDNA，用RNase消化cDNA產物。根據NCBI上公布的GenBankAB046874.1大豆過敏蛋白基因Gly m Bd 28K的序列信息設計特異引物，進行常規聚合酶鏈式PCR反應，分別擴增Gly m Bd 28K干擾片段的正義序列SEQ IDNO.13和反義序列SEQ ID NO.14，擴增Gly m Bd 28K干擾片段的正義序列引物上游引物R15` CGAGCTCAACCAAAGTCCTTGTTTGTT 3`下游引物R25` TTGGCGCGCCCATCATTTTCTTCAGCTGT 3`擴增Gly m Bd 28K干擾片段的反義序列引物上游引物R35` GCTCTAGACATCATTTTCTTCAGCTGTTG 3`下游引物R45` CCTTAATTAAAACCAAAGTCCTTGTTTGTT 3`PCR擴增產物分別連入PMD19 T simple vector中，測序驗證，得pMD 28S和pMD 28A；6)Gly m Bd 28K RNAi植物載體的構建pMD 28A與pGSBI分別Pac I/XbaI雙酶切，回收pMD 28A的小片段與pGSBI的大片段連接，得到含反義片段的載體pGSBI 28A；pMD 28S與pGSBI 28A進行Sac I/Asc I雙酶切，回收pMD 28S的小片段與pGSBI 28SA的大片段連接，得同時含Gly m Bd 28K正義和反義片段的RNAi植物表達載體pYZ，Xba I/Asc I雙酶切驗證，構建成功。
2.權利要求1所述過敏蛋白質基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表達載體pYZ的應用。
全文摘要
本發明涉及大豆過敏蛋白質基因Gly m Bd 28K的RNAi植物表達載體的構建，屬于分子生物學領域。分別改造植物載體pBI121和pCAMBIA3301，并連接得到新載體pGSB。PCR擴增CHAS內含子片段，并用其替換載體pGSB中GUS序列，分別設計引物擴增Gly mBd 28K正義和反義干擾片段，并將其分別引入載體pGSBI，得到Gly m Bd 28K的RNAi植物表達載體pYZ。Gly m Bd 28K是大豆主要過敏蛋白質之一，該RNAi植物表達載體轉化大豆將會對過敏蛋白質基因進行基因沉默，為確保過敏人群食用大豆安全奠定堅實基礎。對提高我國大豆分子育種的技術水平具有重要理論和實踐意義。
文檔編號C12N15/113GK101906432SQ20101022477
公開日2010年12月8日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者劉思辰, 朱月林, 楊立飛, 蓋鈞鎰 申請人:南京農業大學