專利名稱：快速靈敏檢測根癌土壤桿菌的pcr引物的制作方法
技術領域：
本發明為一對用于快速靈敏檢測根癌土壤桿菌的PCR引物序列，屬于生物技術領 域，用于土壤，植物組織中根癌土壤桿菌的快速靈敏檢測。
背景技術：
由根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起的根癌病是多種果樹，林木 上的一類重要根部病害。該病原菌寄主范圍廣，可侵染93科331屬800多種植物，除危害 桃，葡萄，蘋果，梨等重要果樹外，還能侵害李，杏，櫻桃，花紅，木瓜，板栗，胡桃等果樹；此外 還能危害多種常見的林木，花卉，甚至瓜類，在生產上造成非常大的損失。根癌病菌的致病機制是病原菌通過傷口侵入寄主后，將其誘癌質粒 (Ti-Plasmid，該質粒上攜帶誘癌基因)上的一段能夠促使植物生長素和細胞分裂素產生 的T-DNA整合到植物細胞的染色體DNA上，隨著植物本身的生長代謝，來刺激植物細胞異常 分裂和增生，形成癌瘤，而病原菌的菌體并不進入植物細胞。這一特點說明根癌病菌具有非 常特殊的致病機制，一旦有根癌癥狀出現，說明細菌的T-DNA已經整合到植物細胞的染色 體上，再用殺細菌劑殺滅細菌已經無法抑制植物細胞的增生，也無法使根癌癥狀消失，同樣 也不能阻止癌瘤的發展和增大。從病菌侵入到顯現癌瘤所需的時間，一般要經幾周到一年 以上。因此，對于根癌土壤桿菌的診斷就需要在癥狀顯現之前來進行，這樣就要求有靈 敏的快速的方法。以PCR為代表的分子生物學手段已經成為病原菌檢測的重要武器。綜上 所述，設計并優化合適的PCR檢測引物屬于當務之急，具有重要的意義。
發明內容
技術問題本發明針對在根癌土壤桿菌檢測中的問題，設計了一對靈敏而快速的特異性PCR 擴增引物，引物根據根癌土壤桿菌Ti質粒上的tmr位點進行設計，名稱為tmr236F和 tmr236R,具體核苷酸序列見說明書。技術方案一對用于快速靈敏檢測根癌土壤桿菌的PCR引物，包括tmr236F =SEQ ID NO. 1和 tmr236R :SEQ ID NO. 2。有益效果經BLAST N比對，本發明引物序列除了根癌土壤桿菌Ti質粒以外與任何已知的核 苷酸序列均不100%匹配。同時利用該PCR反應體系擴增了包括根癌土壤桿菌在內的12個 常見菌株基因組DNA，只有根癌土壤桿菌擴增出了 236bp目標片段，剩下的11同屬不同種或 者不同屬的菌株均無任何擴增產物(附圖1)。 通過控制模板DNA中的模板拷貝數量，制備了 一系列DNA模板，其中包含的模板拷 貝數從IO9到10°，用來定量檢測該引物的靈敏性。從擴增結果來看，該引物可以在只有1個拷貝數的模板DNA中擴增出236bp目標片段(附圖2)。
四
圖1特異性PCR擴增根癌土壤桿菌以及其他常見細菌ii :M :DNA maker ； 1 :H16 (Agrobacterium tumefaciens, ICMP11272) ；2 Pb6 (Agrobacteriumrhizogenes, ICMPl1274) ；3 :Vb8 (Agrobacterium vitis, ICMPl1278)； 4 :GMI1000 (Ralstonia solanacearum, NC_003295) ；5 :1JN2 (Bacillus subtilis, GU549436) ；6 :2BGN8(Serratia marcescens, HM161860) ；7 :3YW8(Myroidesodoratimimus, GU549435) ；8 :2JW6(Stenotrophomonas maltophilia, GU549434) ；9 :3YN16(Enterobacter sp, GU549440) ；10 :Z17(Pantoea agglomerans, HM161866) ；11 :3JW1(Pseudomonas sp, GU991854) ； 12 :N2 (Burkholderia sp, HM161871).圖2PCR擴增靈敏性檢測注=M=DNA maker ；1-10 分別含 IO9-IO0 拷貝數的 DNA 模板
五具體實施例方式1，引物設計根據根癌土壤桿菌Ti質粒上的tmr位點進行設計引物，包括tmr236F =SEQ ID NO. 1 和 tmr236R :SEQ ID NO. 2。擴增目標片段 236bp。2，DNA 提取用于檢驗該引物特異性的12個常見細菌(包括根癌土壤桿菌)基因組DNA采用 上海賽百盛公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒進行提取，具體方法根據試劑盒內說明 書進行。3，PCR 擴增PCR擴增體系如下(25 μ 1)
試劑初始濃度終濃度體積(μ )10XPCR Buffer10XIX2.5MgCl225mM3. 75mM3. 75dNTPs2. 5mM0. 2mM2tmr236F10 μ M0. 2μΜ0. 5Tmr236R10μΜ0. 2μΜ0. 5Taq polymerase5υ/μ 10. lU/μ 10.5DNA template1MiliQ14. 25
PCR反應體系如下 4，PCR特異性測試經BLAST N比對，該引物序列除了根癌土壤桿菌Ti質粒以外與任何已知的核苷酸 序列均不100%匹配。同時利用該PCR反應體系擴增了包括根癌土壤桿菌在內的12個常見 菌株基因組DNA，只有根癌土壤桿菌擴增出了 236bp目標片段，剩下的11同屬不同種或者不 同屬的菌株均無任何擴增產物(附圖1)。5，PCR靈敏性測試通過控制模板DNA中的模板拷貝數量，制備了一系列DNA模板，其中包含的模板拷 貝數從IO9到10°，用來定量檢測該引物的靈敏性。從擴增結果來看，該引物可以在只有1個 拷貝數的模板DNA中擴增出236bp目標片段(附圖2)。
權利要求
一對用于快速靈敏檢測根癌土壤桿菌的PCR引物，包括tmr236FSEQ ID NO.1和tmr236RSEQ ID NO.2。
全文摘要
本發明為快速靈敏檢測根癌土壤桿菌的PCR引物，屬于生物技術領域。該引物對根據根癌土壤桿菌Ti質粒tmr位點進行設計，前后引物各23個堿基，擴增目標片段236bp。通過核苷酸序列比對以及常見細菌擴增，只有根癌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)可以擴增出相應片段。通過靈敏性評估證明，該引物可以從只含有1個拷貝的模板DNA中擴增出相應片段。綜上所述，該引物可以用于快速，靈敏的檢測土壤中以及植物組織中的根癌土壤桿菌，從而大大提高檢測的靈敏度的效率。
文檔編號C12N15/11GK101880718SQ20101022475
公開日2010年11月10日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者劉紅霞, 季鐳, 楊威, 郭堅華 申請人:南京農業大學