專利名稱：脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法
技術領域：
本發明涉及脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，屬于生物催化領域。 更具體地說，本發明提供一種以天然動物油脂-豬油和L-抗壞血酸為原料，非水體系中脂 肪酶催化豬油進行醇解和轉酯化反應合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法。
背景技術：
L-抗壞血酸脂肪酸酯(L-Ascorbyl Fatty Acid Esters, AFAE)是指利用化學或 酶催化不同酰基供體和L-抗壞血酸通過酰基化反應得到的具有抗氧化性和表面活性的酯 類，包括L-抗壞血酸月桂酸酯(L-ascorbyl laurate)、L_抗壞血酸豆蔻酸酯(L-ascorbyl myristate)、L-抗壞血酸棕櫚酸酯(L-ascorbyl palmitate)以及L-抗壞血酸硬脂酸酯 (L-ascorbyl stearate)等。其中L-抗壞血酸棕櫚酸酯應用最廣泛，是世界衛生組織、食品 添加劑聯合委員會認可的營養型抗氧化劑，并被美國藥典收載。L-抗壞血酸脂肪酸酯是一 種新型的多功能食品添加劑。由于其既含有親水性的L-抗壞血酸，又含有親油性的脂肪酸 鏈，使得它們兼具脂溶性抗氧化劑和食品乳化劑的特性，在食品工業中具有廣泛的用途。L-抗壞血酸脂肪酸酯的合成主要有化學合成法和酶催化合成法兩類。其中化學合 成法因成本低、收率高等優點在工業生產上廣泛應用。但化學合成方法副反應多，得到的產 品有害物質含量高，很難達到綠色食品添加劑的要求，而且該工藝還存在能耗高、對設備要 求高、環境污染較為嚴重等問題。與化學合成法相比，L-抗壞血酸脂肪酸酯的酶法合成具 有反應選擇性高、反應條件溫和、副反應少、轉化率高和產品下游分離操作相對簡單、對設 備要求不高等優點，完全符合綠色化工的發展趨勢。盡管目前酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸 酯的工業化生產因酶的應用環境以及成本高的問題還沒有實現，但它代表了未來產業的發 展方向。在酶催化法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯的研究中，脂肪酶和溶劑的選擇、最佳反應 條件的確定以及經濟性底物的采用成為酶催化合成法發展的關鍵。以廉價的畜牧業加工副 產品_豬油和L-抗壞血酸為原料，利用生物催化手段制備的L-抗壞血酸脂肪酸酯是一種 混合性酯。該混合性酯既含有不飽和脂肪酸，又有飽和脂肪酸，在抗氧化的同時還具有可以 提供給人體多種脂肪酸和L-抗壞血酸的生理學效價的特性，屬于一種高效、營養、多功能 食品添加劑，符合目前綠色食品添加劑安全、營養、多功能的發展趨勢。
發明內容
技術問題本發明目的是針對酶法合成L-抗壞血酸脂肪酸酯成本高的問題，提供一種脂肪 酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，探索了一種L-抗壞血酸脂肪酸酯酶法合成的 新途徑。技術方案1.復合脂肪酸甲酯的制備
稱取豬油，按精制豬油與甲醇摩爾比為1 4 5加入甲醇，按豬油體積分數40% 加入叔戊醇，混合均勻后，按豬油質量分數2 5%加入固定化脂肪酶Novozym 435，置于 50°C恒溫搖床中以200r/min的轉速醇解反應10h，反應結束后，過濾除去固定化脂肪酶，反 應液經減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層為純度 98%油狀的復合脂肪酸甲酯；2.非水體系中脂肪酶催化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯(1)按L-抗壞血酸與復合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 2 11稱取L-抗壞血酸和 復合脂肪酸甲酯，加入20ml反應介質中，在反應溫度50 55°C下預熱使反應物溶解并混 合均勻，然后按復合脂肪酸甲酯質量分數10 20%加入Novozym 435，反應混合物在50 55°C搖床中以180r/min的轉速轉酯化反應4 33h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的反應液；(2)按L-抗壞血酸與復合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 2 11稱取L-抗壞血酸 和復合脂肪酸甲酯，在規格為20*250mm的不銹鋼柱里裝入L-抗壞血酸，20*100mm的不銹 鋼柱里按復合脂肪酸甲酯質量分數10 20%裝入Novozym 435，放入50 55°C恒溫水浴 鍋中。在稱取復合脂肪酸甲酯的物料瓶中，加入300ml反應介質，并通過磁力攪拌器不斷攪 拌。然后依次將蠕動泵、L-抗壞血酸柱和酶柱用耐有機溶劑的硅膠管連接起來。啟動恒流 泵，流速為0. 5 2. OmL/min，循環反應20 24h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的反應液；以上所述的反應介質為異辛烷丙酮體積比7 3、異辛烷叔戊醇體積比 7 3、異辛烷叔丁醇體積比7 3、正己烷丙酮體積比7 3、正己烷叔戊醇體積比 7 3、正己烷叔丁醇體積比7 3、丙酮、叔丁醇或叔戊醇。3.產物的分離純化(1)有機溶劑萃取法。先通過過濾的方法除去固定化脂肪酶，將濾液真空蒸發除 去有機溶劑后，取在25 50°C下溶解于正己烷中，于4°C高速離心20min得到沉淀，沉淀用 乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中靜置分 層，取上層液低壓真空干燥得到白色結晶。(2)硅膠柱分離法。硅膠浸泡于含5%異丙醇的正己烷中，濕法上柱，用含5%異 丙醇的正己烷洗脫2 3個柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后用 含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，將收集液低壓真空干燥得到白色結晶。4.產品的IR分析分離純化得到的產品為白色粉末，對其進行紅外光譜測定得到光譜圖(圖2)。在 紅外光譜中，2919CHT1和2850CHT1為飽和C-H的伸縮振動吸收峰；1733CHT1為羧酸酯的羰基 伸縮振動吸收峰；1660. IcnT1附近的吸收峰為維生素C中C = C雙鍵的吸收峰，說明所得產 物為L-抗壞血酸脂肪酸酯。同時，指紋區的吸收峰(1460，1300，930以及710CHT1)為進-步 說明所得產物L-抗壞血酸脂肪酸酯提供了佐證。有益效果本發明的主要優點如下1.本發明首次提供了一種將豬油轉化為抗壞血酸脂肪酸酯的方法，探索了一種從 廉價的、天然原料出發，以生物催化方式進行L-抗壞血酸脂肪酸酯合成的新途徑。2.本發明采用脂肪酶在非水體系中催化豬油進行醇解和轉酯化反應合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，具有副反應少，回收率高的特點。3.本發明與傳統的化學合成法相比，本發明的方法使用廉價的反應底物、反應條 件溫和、反應時間短、能耗低、副反應少、轉化率較高和產品下游分離操作簡單，從而大大降 低了生產成本。同時本發明得到的產品具有色澤淺，品質高的特點。
四
圖IL-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜。圖2產品的紅外光譜圖。
五具體實施例方式1.復合脂肪酸甲酯的制備取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入9 11.5ml甲醇(精制豬 油與甲醇摩爾比為1 4 5)，加入25ml叔戊醇(相對豬油體積分數40%)的具塞三角 瓶，混合均勻后，加入1 2. 5g固定化脂肪酶Novozym 435 (相對豬油質量分數2 5% )， 置于50°C恒溫搖床中以200r/min的轉速醇解反應10h。反應結束后，過濾除去固定化脂肪 酶，反應液經減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層 可得到純度達98%油狀的復合脂肪酸甲酯。2.非水體系中脂肪酶催化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯(1)取IOOml的具塞三角瓶，在瓶中稱取0. 176gL_抗壞血酸，稱取0. 577 3. 176g 復合脂肪酸甲酯(L-抗壞血酸與復合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 2 11)，加入裝有20ml 反應介質的具塞三角瓶中，在反應溫度50 55°C下預熱使反應物溶解并混合均勻，然后加 入0. 06 0. 63g固定化脂肪酶(相對復合脂肪酸甲酯質量分數10 20% )。反應混合物 在50 55°C搖床中以180r/min的轉速轉酯化反應4 33h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的 反應液。采用響應曲面法對反應條件(底物比率、酶量、反應溫度和反應時間)進行了優 化。在反應介質中，L-抗壞血酸與復合脂肪酸甲酯摩爾比為1 10. 16，酶用量為15. 70%， 反應溫度54. 50°C，反應時間32. 16h的反應條件下，L-抗壞血酸轉化率為74%，優化后抗 壞血酸的轉化率提高了近20個百分點。(2)填充床反應器中連續化合成L-抗壞血酸脂肪酸酯。在規格為20*250mm的不 銹鋼柱里裝入L-抗壞血酸(10 20g)，20*100mm的不銹鋼柱里裝入3 8g固定化脂肪酶 Novozym 435 (相對復合脂肪酸甲酯質量分數10 20% )，放入50 55°C ！恒溫水浴鍋中。 在稱取19. 3 38. 6g復合脂肪酸甲酯(L-抗壞血酸與復合脂肪酸甲酯的摩爾比為1 8) 的物料瓶中，加入300ml反應介質，并通過磁力攪拌器不斷攪拌。然后依次將蠕動泵、L-抗 壞血酸柱和酶柱用耐有機溶劑的硅膠管連接起來。啟動恒流泵，流速為0. 5 2. OmL/min, 循環反應20 24h，得到L-抗壞血酸脂肪酸酯的反應液；以上所述的反應介質為異辛烷丙酮體積比7 3、異辛烷叔戊醇體積比 7 3、異辛烷叔丁醇體積比7 3、正己烷丙酮體積比7 3、正己烷叔戊醇體積比 7 3、正己烷叔丁醇體積比7 3、丙酮、叔丁醇或叔戊醇。3. L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC分析
反應結束后，取20 μ 1反應液進行HPLC分析。C18色譜柱(5 μ m，4. 6mmX 250mm， Agi lent，USA)，柱體溫度保持在30°C，以乙腈-甲醇(1%。三氟乙酸)_水(1%。三氟乙酸)作 為洗脫液，流動相流速保持在1. Oml/min,檢測器波長245nm，整個洗脫過程約45min。采用 外標法進行產物的定量。標準L-抗壞血酸脂肪酸酯的HPLC圖譜(見圖1)。4.產物的分離純化反應粗產品中的主要成分是殘留的復合脂肪酸酯甲酯、未反應的L-抗壞血酸和 產物L-抗壞血酸脂肪酸酯。純化的目的就是將殘留的復合脂肪酸酯甲酯和未反應的少量 L-抗壞血酸除去。考慮這些反應底物和產物的極性差異，采取了有機溶劑萃取和硅膠柱分 離兩種方法。(1)有機溶劑萃取。先通過過濾的方法除去固定化脂肪酶，將濾液真空蒸發除去 有機溶劑后，取在25 50°C下溶解于60 120ml正己烷中，于4°C高速離心20min得到沉 淀，沉淀用20 40ml乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置 于分液漏斗中靜置分層，取上層液低壓真空干燥得到白色結晶。(2)硅膠柱分離。硅膠浸泡于含5%異丙醇的正己烷中，濕法上柱，用含5%異丙 醇的正己烷洗脫2 3個柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后用含 10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，將收集液低壓真空干燥得到白色結
曰
曰曰°5.產品的IR分析分離純化得到的產品為白色粉末，對其進行紅外光譜測定得到光譜圖(圖2)。在 紅外光譜中，2919. 4cm"1和2850. 9cm"1為飽和C-H的伸縮振動吸收峰；1733. 5cm"1為羧酸酯 的羰基伸縮振動吸收峰；1660. IcnT1附近的吸收峰為維生素C中C = C雙鍵的吸收峰，說明 所得產物為L-抗壞血酸脂肪酸酯。實施例1取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入11. 5ml甲醇和25ml叔戊 醇，再加入1. 5g諾維信公司的Novozym 435，置于50°C恒溫水浴搖床以200r/min下反應 IOh0反應結束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應液經減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液 漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層可得到純度為98%油狀的復合脂肪酸甲酯，回收率為 90%。取IOOml的具塞三角瓶，在瓶中稱取0. 176gL_抗壞血酸，稱取2. 89g復合脂肪酸 甲酯。加入20ml異辛烷叔戊醇(V/V，7 3)，密封。將三角瓶放入溫度55°C、180r/min 搖床中預熱30min，使反應物溶解并混合均勻，加入0. 3g諾維信公司的Novozym 435，反應 24h，取20 μ 1反應液進行HPLC分析，L-抗壞血酸轉化率達53%。反應完畢，反應液經過 濾除去固定化酶顆粒，25°C 60ml正己烷洗滌，于4°C高速離心20min得到沉淀，沉淀用20ml 乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中靜置分 層，取上層液低壓真空干燥，得到0. 20g純度84%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產品回收率為 85%。實施例2操作步驟同實施例1，不同之處在于反應完畢，反應液經過硅膠柱層析分離，用 含5%異丙醇的正己烷洗脫2 3個柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后再用含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，減壓真空干燥，得到 0. 19g純度95%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產品回收率為80%。實施例3取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入11. 5ml甲醇和25ml叔戊 醇，再加入1. 5g諾維信公司的Novozym 435，置于50°C恒溫水浴搖床以200r/min下反應 IOh0反應結束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應液經減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液 漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層可得到純度為98%油狀的復合脂肪酸甲酯，回收率為 90%。取IOOml的具塞三角瓶，在瓶中稱取0. 176g L-抗壞血酸，稱取2. 93g復合脂肪酸 甲酯，加入20ml異辛烷叔戊醇(V/V，7 3)，密封。將三角瓶放入溫度55°C、180r/min搖 床中預熱30min，使反應物溶解并混合均勻，加入0. 44g諾維信公司的NOVOZym435，反應溫 度54. 500C，反應32. 16h，取20 μ 1反應液進行HPLC分析，L-抗壞血酸轉化率為74%。反 應完畢，反應液經過濾除去固定化酶顆粒，50°C 60ml正己烷洗滌，于4°C高速離心20min得 到沉淀，沉淀用20ml乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置 于分液漏斗中靜置分層，取上層液低壓真空干燥，得到0. 26g純度84%的L-抗壞血酸脂肪 酸酯，產品回收率為85%。實施例4操作步驟同實施例3，不同之處在于反應完畢，反應液經過硅膠柱層析分離，用 含5%異丙醇的正己烷洗脫2 3個柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去 雜，然后再用含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，減壓真空干燥，得到 0. 25g純度為95. 4%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，回收率為81 %。實施例5取干凈的250ml具塞三角瓶，在瓶中稱取50g豬油，加入11. 5ml甲醇和25ml叔戊 醇，再加入1. 5g諾維信公司的Novozym 435，置于50°C恒溫水浴搖床以200r/min下反應 IOh0反應結束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應液經減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液 漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層可得到純度為98%油狀的復合脂肪酸甲酯，回收率為 90%。在規格為20*250mm的不銹鋼柱里裝入IOg L-抗壞血酸，20*100mm的不銹鋼柱里 裝入5g諾維信公司的Novozym 435固定化脂肪酶，放入55°C恒溫水浴鍋中。在500ml物料 瓶中稱取19. 3g復合脂肪酸甲酯，加入300ml異辛烷叔戊醇(V/V，7 3)，通過磁力攪拌 器不斷攪拌。然后依次將蠕動泵、L-抗壞血酸柱和酶柱用耐有機溶劑的硅膠管連接起來。 啟動恒流泵，流速1. OmL/min,循環反應24h，取20 μ 1反應液進行HPLC分析，L-抗壞血酸 轉化率達到51. 3%，反應液中的L-抗壞血酸脂肪酸酯濃度為7. 34g/L。反應完畢，反應液 經過過濾除去固定化酶顆粒，500C 120ml正己烷洗滌，于4°C高速離心20min得到沉淀，沉淀 用40ml乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中 靜置分層，取上層液低壓真空干燥，得到1. 43g純度95. 5 %的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產品回 收率為65%。實施例6操作步驟同實施例5，不同之處在于反應完畢，反應液經過硅膠柱層析分離，用
7含5%異丙醇的正己烷洗脫2 3個柱體積平衡后上樣，用含5%異丙醇的正己烷洗脫去 雜，然后再用含10%異丙醇和20%異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，減壓真空干燥，得到 1. 76g純度95%的L-抗壞血酸脂肪酸酯，產品回收率為80%。
權利要求
脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，其特征為1)復合脂肪酸甲酯的制備稱取豬油，按精制豬油與甲醇摩爾比為1∶4～5加入甲醇，按豬油體積分數40％加入叔戊醇，混合均勻后，按豬油質量分數2～5％加入固定化脂肪酶Novozym 435，置于50℃恒溫搖床中以200r/min的轉速醇解反應10h，反應結束后，過濾除去固定化脂肪酶，反應液經減壓蒸餾出甲醇和叔戊醇，并移入分液漏斗，靜置后分離出下層的甘油，上層為純度98％油狀的復合脂肪酸甲酯；2)非水體系中脂肪酶催化合成L 抗壞血酸脂肪酸酯按L 抗壞血酸與復合脂肪酸甲酯的摩爾比為1∶2～11稱取L 抗壞血酸和步驟1)得到的復合脂肪酸甲酯，加入20ml反應介質中，在反應溫度50～55℃下預熱使反應物溶解并混合均勻，然后按復合脂肪酸甲酯質量分數10～20％加入Novozym 435固定化脂肪酶，反應混合物在50～55℃搖床中以180r/min的轉速轉酯化反應4～33h，得到L 抗壞血酸脂肪酸酯的反應液；或者按L 抗壞血酸與復合脂肪酸甲酯的摩爾比為1∶2～11稱取L 抗壞血酸和復合脂肪酸甲酯，在規格為20*250mm的不銹鋼柱里裝入L 抗壞血酸，20*100mm的不銹鋼柱里按復合脂肪酸甲酯質量分數10～20％裝入Novozym 435固定化脂肪酶，放入50～55℃恒溫水浴鍋中，在稱取復合脂肪酸甲酯的物料瓶中，加入300ml反應介質，并通過磁力攪拌器不斷攪拌，然后依次將蠕動泵、L 抗壞血酸柱和酶柱用耐有機溶劑的硅膠管連接起來，啟動恒流泵，流速為0.5～2.0mL/min，循環反應20～24h，得到L 抗壞血酸脂肪酸酯的反應液；3)產物的分離純化有機溶劑萃取法，先通過過濾的方法除去固定化脂肪酶，將濾液真空蒸發除去有機溶劑后，取在25～50℃下溶解于正己烷中，4℃下靜止，于4℃高速離心20min得到沉淀，沉淀用乙酸乙酯溶解后，再加入乙酸乙酯體積4倍的去離子水，充分混勻，置于分液漏斗中靜置分層，取上層液低壓真空干燥得到白色結晶；或者硅膠柱分離法，硅膠浸泡于含體積比5％異丙醇的正己烷中，濕法上柱，用含5％異丙醇的正己烷洗脫2～3個柱體積平衡后上樣，用含體積比5％異丙醇的正己烷洗脫去雜，然后用含10％異丙醇和20％異丙醇的正己烷分段洗脫并收集，將收集液低壓真空干燥得到白色結晶。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟2)所述反應介質為異辛烷丙酮體 積比7 3、異辛烷叔戊醇體積比7 3、異辛烷叔丁醇體積比7 3、正己烷丙酮體 積比7 3、正己烷叔戊醇體積比7 3、正己烷叔丁醇體積比7 3、丙酮、叔丁醇或叔戊醇。
全文摘要
本發明涉及脂肪酶催化豬油合成抗壞血酸脂肪酸酯的方法，屬于生物催化領域。以天然動物油脂-豬油和L-抗壞血酸為原料，非水體系中脂肪酶催化豬油和甲醇進行醇解反應制備復合脂肪酸甲酯，然后再催化復合脂肪酸甲酯與L-抗壞血酸進行轉酯化反應制備抗壞血酸脂肪酸酯。該方法在反應介質中，以固定化酶作為催化劑，酶用量為12～20％，底物比率1∶2～11，反應溫度50～55℃，反應時間20～32h，然后將反應液經過濾、洗滌、萃取或硅膠柱分離、低壓真空干燥等步驟制備L-抗壞血酸脂肪酸酯。本發明的方法利用廉價的豬油作為反應底物，能在較短的反應時間內獲得高的轉化率，從而降低了生產成本，有利于工業化生產。
文檔編號C12P17/04GK101892275SQ20101022474
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月13日 優先權日2010年7月13日
發明者劉建偉, 別小妹, 呂鳳霞, 張宇, 趙海珍, 陸兆新 申請人:南京農業大學