專利名稱：一種提高產1，3-丙二醇融合菌篩選效率的方法
技術領域：
本發明涉及一種應用基因組重排技術制備產1，3-丙二醇基因工程融合菌的篩選方法，特別是提高篩選效率的方法，屬于工業生物技術領域。
背景技術：
1，3_丙二醇(PDO)是一種重要的化工和醫藥中間體原料，可作為有機溶劑應用于油墨、印染、乳化劑、抗凍劑等。PDO最主要的用途，是合成新型聚酯高分子材料聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)的單體。PTT是目前國際上公認的六大石化新產品之一。與聚對苯二甲酸乙二酯(PET)、聚對苯二甲酸丁二酯(PBT)和尼龍等比較，PTT具有良好的印染特性、富有彈性、抗紫外線、靜電性能好、可生物降解并再生利用等多種優良特性，因此PTT在紡織服裝業、地毯裝飾業、工程塑料等眾多領域有著十分廣闊的應用前景。據估計，目前僅我國每年就需求PDO上百萬噸，而且在未來十年我國對PDO的需求量還將繼續增大。PTT生產的關鍵在于單體原料PDO的來源，其生產成本直接影響著PTT的工業化生產和應用規模。1，3_丙二醇的生產方法主要有化學合成法和微生物發酵法。化學合成法目前僅有國外DuPont和Siell公司以及國內的少數幾家單位在進行小規模工業化生產。技術路線分別是德國Degussa公司的丙烯醛合成法專利技術和Siell公司開發的環氧乙烷合成法， 并用于聚合生產PTT。為了壟斷市場，這兩家跨國公司不對外銷售用于PTT生產的PD0，而只向客戶銷售PTT切片及其下游產品。同時，化學合成法存在設備投資大、工藝要求嚴格、 操作條件苛刻、有毒副產物多、產品提取難度大、三廢處理成本高以及生產原料依賴于不可再生的石油資源等問題，導致PTT材料及其原料產品PDO的價格一直居高不下，制約其進一步的發展。而微生物發酵法生產PD0，以可再生資源——碳水化合物為原料，具有操作簡便、反應條件相對溫和、副產物少、污染少且容易處理以及成本低廉等優點，引起了國內外相關企業和研究單位的高度重視，將具有廣泛的應用前景和開發潛力。微生物發酵法的生產方法包括一是利用從自然界獲得的菌株以甘油為底物直接發酵生產1，3_丙二醇；二是構建基因工程菌以葡萄糖或甘油為底物發酵生產1，3_丙二醇； 基因工程菌構建策略主要有5種(1)強化原始菌株中還原途徑限速酶的表達及阻止副產物的代謝途徑；(2)將1，3-丙二醇生產菌的關鍵酶基因dhaB、dhaT基因克隆到甘油生產菌中，以希望能獲得將葡萄糖轉化為1，3_丙二醇的基因工程菌；(3)將甘油生產菌的DAR1、GPP2基因克隆到1，3_丙二醇生產菌中，以希望能獲得將葡萄糖轉化為1，3-丙二醇的基因工程菌；(4)將產1，3_丙二醇的dha調控子基因克隆到大腸桿菌中，獲得能轉化甘油為1， 3-丙二醇的基因工程菌；(5)將1，3_丙二醇生產菌的關鍵酶基因dhaB、dhaT基因和甘油生產菌的DARl、 GPP2基因克隆到大腸桿菌中，從而獲得能將葡萄糖轉化為1，3_丙二醇的基因工程菌。目前，國外DuPont公司已經在大腸桿菌中成功構建了以葡萄糖為底物發酵1. 3-丙二醇的途徑，產量高達135g/L。國內眾多研究機構也紛紛針對產1，3-丙二醇途徑中的關鍵酶進行了深入的研究，在模式大腸桿菌成功表達關鍵酶基因，但產量水平較低，而針對原始生產菌株肺炎克雷伯氏菌的基因工程手段改造鮮見報道，隨著國際范圍內生物柴油工業的廣泛興起，將產生大量的剩余副產品甘油，為利用發酵法制備1，3_丙二醇提供了豐富的原料。基因組重排技術作為新型的育種技術，基于原生質體融合技術之上，使不同基因組發生重排的過程。其主要機制在于利用原生質體融合達到全基因組片段交換、重組，經過多輪遞歸融合后促使正向突變表型聚集，相較誘變育種、原生質體融合人技術等，基因組重排技術具有更高的效率。基因組重排技術基于多親本之間的遞歸融合，具有更大基因突變來源；遞歸融合還能使正向突變的表型聚集，多輪融合極大的提高了基因交換的概率。其次，基因組重排技術可以無需了解相關微生物的代謝途徑、關鍵酶的表達基因、轉錄調控等知識背景，尤其適合微生物代謝途徑的遺傳改造。此外，基因組重排技術操作簡單，容易推廣，不需要昂貴的實驗儀器，而且見效快。因此，基因組重排育種很適合工業菌株的改造工程，不僅體現成本經濟效應，還具備高效性。基因組重排技術充分結合了細胞工程和代謝工程的優勢，不僅可以進行菌種表型快速高效優化，還可為不同種類的微生物復雜的代謝和調控網絡提供了信息來源。目前，基因組重排技術主要應用于提高微生物代謝產物產率，增強菌株對環境的耐受性以及底物的利用率。在 2009 年，Jin 等(Jin ZH, Xu B, Lin SZ, Jin Q, Cen P. Enhanced production of spinosad in Saccharopolyspora spinosa by genome shuffling. Appl BiochemBiotechnol 2009. doi :10. 1007/sl2010-008-8500_0)研究了 Saccharopolyspora spinosa的基因組重排育種工作，經過四輪重排后，篩選到了兩株高產多殺菌素的融合菌，生產能力比原始出發菌株提高了 201%和436%。Burkhard Otte等(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Dec.2009， p.7610-7616Vol.75, No.240099-2240/09/ doi :10. 1128/AEM. 01774-09)首次結合傳統誘變育種和基因組重排技術，以Clostridium diolis為親本菌株，篩選到了高耐甘油和1，3-丙二醇的工程菌，其中一株融合菌的1，3-丙二醇濃度達到了 85g/L。采用基因組重排過程獲得優良目的菌株的工作量較大，主要過程包括原生質體的獲取、原生質體的滅活誘變、原生質體的融合、融合子的篩選等步驟。基因組重排一般需要多輪操作，每步驟的條件稍有變化對最終結果都可能產生明顯的影響，基因組重排過程需要大量人力、物力和時間。科學高效的融合子篩選方法是基因組重排育種技術過程成功的關鍵，而目前一般的篩選方法普遍采用提高單因子通量來篩選。該方法有一定理論基礎和實踐基礎，但是對于微生物整個發酵體系而言，缺乏科學性。微生物發酵體系對微生物后期有害脅迫和毒害作用是多因子作用的結果，并不是單一因子作用的結果。本發明利用初始菌株補料發酵終點的發酵液并經過濾除菌后作為選擇培養基，包含了各種對菌體不利因素，而且模擬了實際發酵體系，篩選到的菌株理論上具備更強的生產強度。本發明為工業菌株改良篩選提供了新的思路。
發明內容
本發明提供提高產1，3_丙二醇融合菌篩選效率的方法，本發明方法可以提高目標菌株的使用性能，同時提高目標菌株的篩選效率。本發明提高產1，3_丙二醇融合菌篩選效率的方法包括如下過程(1)選擇親本菌株，或菌種經適宜培養得到親本菌株；(2)親本菌株進行酶解脫壁得到原生質體；(3)原生質體進行滅活處理得到滅活原生質體；(4)滅活的原生質體進行原生質體融合；(5)用含有目的發酵產物的培養基篩選融合子，選擇性能優良的目的融合菌；(6)步驟(5)獲得的優良融合菌株作為親本進入下一輪基因組重排過程，至獲得綜合性能優良的菌株。其中步驟(5)中每輪獲得目的融合菌補料發酵終點的發酵液經過濾除菌后作為選擇培養基，用于篩選下一輪目的融合菌。本發明方法中，親本菌株一般為兩株，可以是肺炎克雷伯氏桿菌同種之間融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與產酸克雷伯氏桿菌間跨屬融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與大腸桿菌之間跨屬融合等具體方式。親本菌株可以源來市售商品，也可以是實驗室保藏菌種經培養獲得，菌種培養的方法可以采用本領域常規方法。本發明方法中，親本菌株酶解脫壁可以采用Tris-Cl (Tris鹽酸緩沖液)溶解的溶菌酶溶液進行酶解脫壁處理。親本菌株在酶解脫壁處理之前可以進行適宜的預處理過程，預處理如紫外誘變、NTG (亞硝基胍)誘變、DES (硫酸二乙酯)誘變、Tris-Cl緩沖液預處理等一種或幾種。本發明方法中，原生質體進行滅活處理可以采用常規的方法，如紫外滅活、熱滅活等方法，不同的親本原生質體可以采用不同的滅活方法處理，具體滅活方法是本領域技術人員熟知的內容。本發明方法中，采用菌株同種之間融合時，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質體滅活等步驟優選分別進行；采用不同菌株跨屬融合時，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質體滅活等步驟可以分別進行，也可以在同一體系中同時進行。本發明方法中，酶解脫壁得到原生質體或滅活原生質體可以進行膜過濾處理，膜過濾處理優選采用0. 22 0. 85 μ m濾膜過濾除去對原生質體融合有影響的菌體，優選對酶解脫壁得到原生質體進行膜過濾處理。本發明方法中，滅活原生質體進行原生質體融合的操作可以采用本領域常規方法，如滅活原生質與聚乙二醇溶液(如聚乙二醇6000溶液)混合，在適宜溫度(如30 400C )下進行融合一定時間(如3 30分鐘)。本發明方法中，融合子的篩選過程與常規基因組重組方法相同，如采用補料發酵方式在培養基中和適宜的條件下對融合子進行篩選，主要特點在于以每輪篩選的補料發酵終點時的發酵液經過濾除菌后作為下一輪融合子篩的培養基。培養基中跟據需要添加適宜的營養物質。本發明方法中，各步驟的其它條件和操作方式可以采用本領域常規的方法。本發明方法中，在融合子篩選過程中，通過采用適宜的培養基，用于篩選目的融合菌，即利用初始菌株補料發酵終點時的發酵液，經過濾除菌后直接用于篩選目的融合菌，獲得的融合菌具備對發酵體系更高的耐受性。實驗證明，使用本發明中補料發酵終點時的發酵液并經過濾除菌，明顯提高了融合菌的生產強度，提高了產物的最終濃度及轉化率，提高經濟經濟效益。同時由于補料發酵終點時發酵液的對融合子的有效篩選作用，可以進一步提高獲得使用性能目標菌株的篩選效率，實驗表明，采用該方法進行菌株篩選比采用普通培養基篩選時可以提高效率20 %以上。本發明方法中，原生質體在融合前進行膜過濾操作，可以選擇適宜的原生質體進行融合篩選，有效去除對融合操作有影響的菌體，減少篩選過程中的干擾，顯著提高了目的融合菌的篩選效率，實驗表明，采用這種方法可以提高篩選效率20%以上。
具體實施例方式下面通過實施例進一步說明本發明的方案和效果。實施例1基因組重排育種，以肺炎克雷伯氏桿菌為初始親本菌株菌種肺炎克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae)由撫順石油化工研究院篩選，保藏于中國微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號為0798。再生培養基(固體):A、蔗糖171.5g/L，胰蛋白胨10g/L，葡萄糖10g/L，酵母膏 5g/L，MgCl24. 273g/L，NaC15g/L，瓊脂 15g/L。LB培養基(固體)胰蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaC15g/L，瓊脂15g/L。溶菌酶用10mM/L的Tris-Cl (pH8. 0)溶解溶菌酶，配置成20mg/mL的貯存液，分
裝使用。SMM 緩沖液0. 5mol/L 蔗糖，0. 02mol/L MgCl, 0. 02mol/L 順丁烯二酸。Tris-Cl 緩沖液還含有 0. 01mol/L 的 EDTA，0. 5mol/L 蔗糖。補料發酵培養基酵母膏5g/l，K2HPO4 · 3H20 10g/l，KH2P042g/l，NH4ClO. 8-lg/l， NaCl 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. lg/1，FeCl3 · 6H20 30mg/l，CoCl2 · 6H205mg/l，VitaminB125mg/ 1，甘油30g/l ；實料發酵過程甘油控制在15 20g/L。補料發酵培養條件37°C，300rpm,空氣 0. 25 0. 5vvm。基因組重排過程(1)菌體預處理從_80°C甘油管保藏下的雙親本菌株在固體培養板上活化4代，液體LB活化 14h。預先紫外誘變三輪，接種到LB固體斜面。轉到LB液體培養基活化10h，按2%接種量接種到含甘氨酸濃度為0.8%的25mL LB培養基的搖幷S培養，培養條件為37°C，130rpm， 4h。用Tris-Cl緩沖液預處理。在恒溫震蕩儀37°C下，IOOrpm,時間為30min。用SMM緩沖液洗滌一次離心去上清，離心條件為4000g，4°C，IOmin0(2)酶解脫壁用SMM配制的溶菌酶母液(pH8. 0，溶菌酶濃度為20mg/mL)加入離心洗滌后的菌體，使最終濃度為0. 5mg ang，充分混勻，置恒溫振蕩儀中37°C，lOOrpm，Ih后離心去上清， 離心條件為3000g，4°C，lOmin。用SMM緩沖液洗滌兩次，離心條件同上。(3)原生質體滅活用紫外和熱分別滅活兩份酶解脫壁的原生質體，紫外滅活條件距離紫外燈20cm， 照射時間為30min，熱滅活條件為60°C，時間池，然后收集菌液。(4)原生質體融合
由上步收集到的菌液按等體積混勻離心，加入濃度為40%的PEG6000 (SMM配制)， 37°C溫箱中40rpm，融合時間為6_8min。(5)融合子篩選融合后的原生質體在再生培養基上進行培養生長，以克雷伯氏桿菌補料發酵終點時的發酵液并經過濾除菌后作為選擇培養基，將再生培養基上長出的融合菌株接種到搖弁瓦中，初步篩選耐受發酵體系優良的融合子。HPLC(高效液相色譜)測定搖瓶發酵液1， 3_丙二醇的產物濃度并進一步通過發酵罐培養確定。每輪獲得的優良菌株作為親本進入下輪融合。而每輪獲得目的融合菌補料發酵終點的發酵液并經過濾除菌后作為選擇培養基， 篩選下輪目的融合菌。經過3 6輪的基因組重排篩選，可以獲得性能優良的菌株。實施例2以肺炎克雷伯氏桿菌和大腸桿菌作為親本菌株，基因組重排技術育種選擇肺炎克雷伯氏桿菌和大腸桿菌為親本菌株，預先用LB液體培養基活化14h， 對雙親菌株(肺炎克雷伯氏桿菌和大腸桿菌)分別進行紫外誘變和NTG誘變。其余步驟方法同例1，經過3 6輪的基因組重排篩選，可以獲得性能優良的菌株。實施例3以肺炎克雷伯氏桿菌和產酸克雷伯氏桿菌作為親本菌株，基因組重排技術育種選擇肺炎克雷伯氏桿菌和產酸克雷伯氏桿菌為親本菌株，預先用LB液體培養基活化14h，對雙親菌株(肺炎克雷伯氏桿菌和產酸克雷伯氏桿菌)分別進行紫外誘變和NTG 誘變。其余步驟方法同例1，經過3 6輪的基因組重排篩選，可以獲得性能優良的菌株。實施例4與比較例實施例4采用初始菌株補料發酵終點時的發酵液并經過濾除菌后，作為選擇培養基，比較例采用前述補料發酵培養基(補料發酵培養基組成為酵母膏5g/l，K2HPO4 · 3H20 10g/l，KH2P042g/l，NH4Cl 0. 8-lg/l，NaCl 0. 5g/l，MgSO4 · 7H20 0. lg/1，FeCl3 · 6H20 30mg/ 1，CoCl2 ·6Η20 5mg/l，VitaminB125mg/l，甘油 30g/l)，培養條件37°C，300rpm，空氣 0. 25 0.5vvm。當發酵液中1，3-丙二醇濃度不再提高，甘油停止消耗時視為發酵終點。表1實施例4實驗結果
權利要求
1.一種提高產1，3-丙二醇融合菌篩選效率的方法，包括如下過程(1)選擇親本菌株，或菌種經適宜培養得到親本菌株；(2)親本菌株進行酶解脫壁得到原生質體；(3)原生質體進行滅活處理得到滅活原生質體；(4)滅活的原生質體進行原生質體融合；(5)用含有目的發酵產物的培養基篩選融合子，選擇性能優良的目的融合菌；(6)步驟( 獲得的優良融合菌株作為親本進入下一輪基因組重排過程，至獲得綜合性能優良的菌株；其特征在于步驟(5)中每輪獲得目的融合菌補料發酵終點的發酵液進行過濾除菌后作為選擇培養基，用于篩選下一輪目的融合菌。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于親本菌株為兩株，為肺炎克雷伯氏桿菌同種之間融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與產酸克雷伯氏桿菌間跨屬融合，或者是肺炎克雷伯氏桿菌與大腸桿菌之間跨屬融合。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于親本菌株酶解脫壁采用Tris-Cl(Tris鹽酸緩沖液)溶解的溶菌酶溶液進行酶解脫壁處理。
4.按照權利要求1或3所述的方法，其特征在于親本菌株在酶解脫壁處理之前進行預處理過程，預處理過程包括紫外誘變、亞硝基胍誘變、硫酸二乙酯誘變、Tris-Cl緩沖液預處理中的一種或幾種。
5.按照權利要求1所述的方法，其特征在于原生質體進行滅活處理采用紫外滅活或熱滅活方法。
6.按照權利要求5所述的方法，其特征在于采用菌株同種之間融合時，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質體滅活步驟分別進行；采用不同菌株跨屬融合時，不同親本菌株的酶解脫壁和原生質體滅活步驟分別進行，或者在同一體系中同時進行。
7.按照權利要求1所述的方法，其特征在于酶解脫壁得到原生質體或滅活原生質體進行膜過濾處理。
8.按照權利要求7所述的方法，其特征在于膜過濾處理采用0.22 0. 85 μ m濾膜過濾除去對原生質體融合有影響的菌體。
9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于滅活原生質體在聚乙二醇溶液中進行融合O
10.按照權利要求1所述的方法，其特征在于融合子的篩選過程采用補料發酵方式在培養基中對融合子進行篩選，以每輪篩選的補料發酵終點時的發酵液經過濾除菌后作為下一輪融合子篩的培養基。
全文摘要
本發明公開了一種提高產1，3-丙二醇融合菌篩選效率的方法，主要過程包括選擇親本菌株；親本菌株進行酶解脫壁得到原生質體；原生質體進行滅活處理；滅活的原生質體進行原生質體融合；篩選融合子，選擇性能優良的目的融合菌；優良融合菌株作為親本進入下一輪基因組重排過程，至獲得綜合性能優良的菌株；其中每輪獲得目的融合菌補料發酵終點的發酵液進行過濾除菌后作為選擇培養基，用于篩選下一輪目的融合菌。與現有基因工程融合菌篩選方法相比，本發明方法具有操作方便，不需昂貴的實驗儀器，篩選效率高，適合于工業菌株育種等優點。
文檔編號C12N15/03GK102311946SQ201010220778
公開日2012年1月11日 申請日期2010年7月7日 優先權日2010年7月7日
發明者師文靜, 李曉姝, 王崇輝, 王領民, 金平 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院