專利名稱：高血壓易感基因AGTR1單核苷酸多態性位點rs388915的檢測方法及檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學和醫學領域。更具體地，涉及人血管緊張素II-I型受體基 因(AGTRl)的(single nucleotide polymorphism, SNP)位點 rs388915 及其與原發性高血 壓相關性的檢測。本發明還涉及檢測這個SNP位點的方法和試劑盒。
背景技術：
原發性高血壓(essential hypertension, EH)是一種多因素、多基因疾病，由環 境與遺傳因素共同致病的常見而多發的心血管病癥，對人類健康造成了極大的影響。隨著 分子醫學的發展，目前已經發現的高血壓相關基因已經有150余種，但是EH的發病機制仍 然不完全清楚，高血壓的早期診斷和預防問題仍然未能完全解決。EH是遺傳因子和環境共 同作用的結果，血壓的變化30%-60%歸因子遺傳。由于環境因素是可以控制和確認的，而 對高血壓遺傳學因素卻是固定不變的。因此，對可變因素的控制，如對高血壓危險因素的 預防，可以在一定程度上延緩和防止高血壓的發病，但是對固定不變的遺傳因素的認識不 足卻在一定程度上嚴重影響著對高血壓發病、診斷和治療。因此對高血壓遺傳學的研究十 分必要(王佐廣，溫紹君，吳兆蘇.高血壓、易感基因與單核苷酸多態性[J].高血壓雜志， 2001,9 259-264)。近二十余年來，有關高血壓治療的研究更多地集中在對血壓的控制和對靶器官的 保護，并已取得突飛猛進的發展。但是，這些手段并不能從根本上控制血壓，目前對人類內 源性抗高血壓基因的研究還很少，因此，研究內源性抗高血壓機制是今后高血壓防治研究 的主要方向之一，具有重要的研究價值和應用前景，如果通過調節內源性抗高血壓機制治 療高血壓病，將會促進我國生物醫療技術的發展，并為我國每年節省巨大的醫療費用。人血管緊張素II-I型受體是腎素-血管緊張素-醛固酮系統 (Renin-angiotensin-aldosterone system, RASS)的重要組成部分，參與調節血管收縮、水 鈉平衡，參與血壓控制與調節的各個方面。人體內血管緊張素II和血管緊張素II的1型受 體結合后，可以激活一系列的信號傳導通路，最終導致血管收縮、炎癥和細胞增殖等生理反 應。因此，編碼血管緊張素II-I型受體的人血管緊張素II-I型受體基因(AGTRl)的單核苷 酸多態性改變，可能與人類EH密切相關。AGTRl位于3q21_25，基因全長約60kb，主要分布 在質膜，發揮受體活性，參與G蛋白信號轉導，與三磷酸肌醇偶聯提高胞漿鈣離子濃度等產 生一系列生物學效應。它在人的許多器官中均有表達，如心臟、骨骼肌、腦、肺、肝和腎上腺 等，在心血管系統中是最為重要的受體之一。(張靜，趙巍，楊澤.血管緊張素II-I型受體基 因與血管相關代謝性疾病關系的研究進展[J].中國心血管雜志，2007，12:311-313.)。目 ItrSW^if^SM/Jn (Shaoyong Sua, Jianhong Chen, Jiangong Zhao, et al. Angiotensin II type I receptor gene andmyocardial infarction tagging SNPs and hapIotype based association study. TheBeijing atherosclerosis study. Pharmacogenetics，2004，14 673-681.)，由rs388915位點參與、聯合多個AGTRl位點組成的單倍體型可能與人類心肌梗死發病有關，但尚無rs388915位點與EH相關的報道。由于EH是多種心、腦血管疾病的重 要病因和危險因素(葉任高，陸再英主編，《內科學》2006年第6版，人民衛生出版社.第三 篇第六章)，而通過單一位點rs388915與人類EH發病關系的研究，可能解釋其參與的單倍 體型與包括心肌梗死在內的其他心血管疾病發病的真正病因。綜上所述，為了最終實現治療高血壓，本領域迫切需要尋求原發性高血壓易感基 因，并開發檢測原發性高血壓易感基因的方法、試劑盒，以及相關的治療藥物。
發明內容
本發明的目的是提供一種檢測(包括早期診斷)高血壓易感基因的方法及檢測試劑盒。本發明提供了一種高血壓易感性基因的檢測方法，即檢測AGTRl基因rs388915位 點的基因型，rs388915帶有G基因型(尤其是GG基因型)的個體高血壓的發病風險顯著 高于普通人群。所述的rs388915，位于Mfn2的內含子2中(片段重疊群contig :NT_005612. 16位 置54942902A/G)其中，脫氧核糖核酸(DNA)序列編號rs388915位置基于SEQ IDNO 1/6 ； 引物1基于SEQ ID NO 2/6 ；引物2基于SEQ ID NO 3/6 ；探針1基于SEQID NO 4/6 ；探針 2 基于 SEQ ID NO 5/6 ；擴增產物基于 SEQ ID NO :6/6。具體而言，該方法包括步驟(a)抽提樣品的基因組DNA，擴增獲得AGTRl基因內含 子2 ； (b)檢測步驟(a)產物中單核苷酸多態性位點rs388915的基因型。所述的擴增AGTRl基因內含子2的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。所述的檢測rs388915的基因型的探針序列如SEQ ID NO 4和SEQ ID NO 5所示。上述方法中涉及的測序、擴增、抽提基因組DNA等技術均可采用本領域的常規操 作方法。本發明提供了一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，它含有與位點rs388915結合 的探針。在本發明的一個實施例中，與位點rs388915結合的探針的序列如SEQ ID NO :4和 SEQ ID NO 5 所示。上述試劑盒還可以包括特異性擴增AGTRl基因內含子2中包含rs388915位點的 區域的引物。在本發明的一個實施例中，與特異性擴增AGTRl基因內含子2中包含rs388915位 點的區域的引物的序列如SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3所示。本發明經過多年研究，首次證明了 AGTRl基因單核苷酸多態性位點rs388915(位 于AGTRl內含子2中，片段重疊群contig :NT_005612. 16位置54942902A/G)與高血壓密切 相關，而且發現了它的新功能AGTR1基因單核苷酸多態性位點rs388915位于AGTR1，內含 子2中(片段重疊群contig :NT_005612. 16位置54942902A/G)基因型的改變將導致高血 壓的發病風險升高，其中關聯研究結果顯示，在AGTRl基因rs388915A — G在病例和對照組 中的分布存在顯著性差異(P < 0. 05)，該SNP多態性可改變轉錄因子結合位點。在此基礎 上完成了本發明。本發明提供了一種對個體的高血壓易感性進行診斷的方法，它包括步驟檢測該個體的AGTRl基因rs388915位點的基因型，以此判斷該個體患高血壓的發病風險是否高于 普通人群。在一優選例中，所述的差異是選自rs388915的單核苷酸多態性。rs388915位于 Mfn2,內含子2中(片段重疊群contig :NT_005612. 16位置54942902A/G)。其中，脫氧核 糖核酸(DNA)序列編號rs388915位置基于SEQ ID NO :1/6。本發明提供了一種檢測樣品是否存在AGTRl基因的單核苷酸多態性的方法，包括 步驟(a)用AGTRl基因內含子2特異性引物擴增樣品的基因組DNA，得到擴增產物；和(b)檢測擴增產物中單核苷酸多態性位點rs388915的基因型。AGTRl 基因 rs388915 位點的詳細序列可參見網址 http //www, ncbi. nlm. nih. gov/中登錄號為rs388915的核苷酸序列，也可參見SEQ ID NO 1。本發明對AGTRl基因中的內含子2中(片段重疊群contig :NT_005612. 16位置 54942902A/G)區域進行了測序。AGTRl基因rs388915位點的多態性可應用于高血壓的個性化治療。在使用本發明 AGTRl基因rs388915位點的多態性時，還可同時使用其他治療高血壓的藥劑。本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效的AGTRl蛋白以及藥學上可接 受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、 及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例 如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊 之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊在無 菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天0.1微克/千克體重-約10毫 克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。使用藥物組合物時，是將安全有效量的AGTRl或其拮抗劑、激動劑施用于普哺乳 動物，其中該安全有效劑量通常至少約0. 1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約 10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0. 1微克/千克體重-約100毫克/千克體重。當 然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內。檢測AGTRl基因的rs388915的基因型也可用于輔助診斷高血壓。檢測可以針對 基因組DNA，也可針對AGTRl基因的擴增片段。AGTRl基因的rs388915的基因型分析可用 已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變，等等。本發明提供了一種檢測原發性高血壓易感性基因的方法，它包括檢測人血管緊張 素II-I型受體基因(AGTRl)的rs388915位點的基因型，rs388915帶有G基因型的個體， 高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴 增rs388915位點的引物，還可以包括擴增AGTRl基因第2號內含子區域的引物。利用本發 明檢測rs388915位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治 療提供了一個簡捷的新途徑。
圖1是一份樣本基因組DNA質量的檢測結果示意。圖2是測序結果截圖。顯示了 rs388915的一種SNP基因型的測序結果。rs388915位于AGTRl的內含子2中(片段重疊群contig :ΝΤ_005612· 16位置54942902A/G)。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆；實驗室手冊(New York Co Id Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1熒光PCR檢測一、實驗材料7900HT熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，聚合酶鏈反應液(TaqMan EXPressMaster Mix)由美國應用生物系統公司(ABI)定制合成。二、引物及探針設計與合成以AGTRl基因內含子2的部分序列為模板，使用Primer ExpressTM 2. O軟件分析 TaqMan引物和探針位點，并由美國應用生物系統公司(ABI)定制合成。檢測用引物AGTRl 基因 rs388915 上游引物序列5' -TTTCTTCCACTTCTAGCACCA-3 ‘ (SEQ ID NO 2)AGTRl 基因 Ts3889I5 下游引物序列5' -ATGGATCTGGAGGTGCTATGAG-3‘ (SEQ ID NO 3)熒光探針AGTRl 基因 rs388915 熒光探針 1 :5' -VIC-AATTTGCTCGCAGGGAAA-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID N04)AGTRl 基因 rs388915 熒光探針 2:5' -FAM-AATTTGCTCACAGGGAAA-TAMRA-3 ‘ (SEQ ID N05)三、樣本檢測實驗共檢測910例高血壓病例和496例正常對照人群，每例收集血樣標本約2ml， 用酚/氯仿抽屜基因組DNA，抽提結果用微量紫外/可見光分光光度計(INFINIGEN公司) 檢測。按如下體系進行熒光PCR擴增，最后用SDS 2. 3掃描并聚類分析 四、檢測結果；基因組DNA抽提的檢測結果所有樣本的基因組DNA符合檢測要求(260/280 > 1. 8，濃度> lOng/ul，如圖1所 示樣本1175號的檢測結果)。AGTRl基因rs388915位點基因型的檢測結果
挑選上述高血壓實施例2用測序法檢測原發性高血壓易感基因AGTRl的rs388915位點， 病例-對照組樣本各10例進行測序判斷rs388915的基因型。一、實驗方法PCR測序引物仍采用上述熒光PCR用引物，擴增的產物經純化后直接測序。測序的 儀器是ABI公司的3130x1遺傳分析儀，用sequence analysis 5. 2分析軟件進行分析，結 果用chromas也可以查看。二、實驗結果測序結果截圖如圖2所示。最終，20例的測序結果與7900熒光PCR的基因型分析結果完全一致。三、AGTRl基因rs388915基因型和高血壓易感的關聯分析AGTRl基因rs388915在高血壓病人和對照中分布的比較采用RxCx2檢驗.用SPSS
軟件進行統計分析，檢測結果及SPSS軟件分析結果如下表所示 在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用傲參考，就如同每一篇文獻被單獨引 用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講述內容之后，本領域技術人員可以 對本發明做各種改動或修改，這些形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
一種高血壓易感性基因的檢測方法，其特征在于，檢測AGTR1基因rs388915位點的基因型，rs388915帶有G基因型的個體高血壓的發病風險顯著高于普通人群。
2.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，rs388915位點位于AGTRl基因內含子 2內。
3.如權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)抽提樣品的基因組DNA，擴增獲得AGTRl基因內含子2中包含rs388915位點的區域；(b)檢測步驟(a)產物中單核苷酸多態性位點rs388915的基因型。
4.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，擴增AGTRl基因內含子2中包含 rs388915位點的區域的引物序列如SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3所示。
5.如權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，檢測rs388915的基因型的探針序列如 SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
6.一種檢測高血壓易感基因的試劑盒，其特征在于，它含有與位點rs388915結合的探針。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，與位點rs388915結合的探針的序列如SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 所示。
8.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，它還包括特異性擴增AGTRl基因內含子2 中包含rs388915位點的區域的引物。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，特異性擴增AGTRl基因內含子2中包含 rs388915位點的區域的引物的序列如SEQ ID NO 2禾口 SEQ ID N0:3所示。全文摘要
本發明屬于分子生物學和醫學領域，涉及一種檢測高血壓易感性基因的方法及其檢測試劑盒。本發明提供了一種檢測原發性高血壓易感性基因的方法，它包括檢測人血管緊張素II-1型受體基因(AGTR1)rs388915位點的蒸因型，rs388915帶有G基因型的個體，高血壓的易感性顯著高于普通人群。本發明還公開了相應的檢測試劑盒，該試劑盒含有擴增rs388915位點的引物，還可以包括擴增AGTR1基因第2號內含子內包含rs388915位點的區域的引物。利用本發明檢測rs388915位點的基因型，方法簡單易行，快速高效，成本低廉，為高血壓的診斷和治療提供了一個簡捷的新途徑。
文檔編號C12Q1/68GK101886129SQ20101021754
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者嚴山, 劉潔琳, 劉闊, 劉雅, 吳海, 孫海霞, 李志忠, 李瑤, 樓煜清, 溫紹君, 王佐廣, 謝毅, 郭艷紅, 顧偉 申請人:首都醫科大學附屬北京安貞醫院;復旦大學