專利名稱：用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的引物組及檢測體系的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用環介導恒溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)檢測腸道病毒的引物組、檢測體系、檢測方法及用途。
背景技術：
人腸道病毒隸屬于微小核糖核酸病毒科，主要包括脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒A 組和B組、埃可病毒及一些新腸道病毒。腸道病毒在全世界分布比較廣泛，其主要傳染源為 病人或無癥狀帶毒者，可引起脊髓灰質炎、手足口病等一系列疾病。我國近幾年由腸道病毒 引起的無菌性腦炎、手足口病、急性出血性結膜炎和新生兒急性心肌炎等疫情時有發生。建 立一套快速、簡便、可靠的腸道病毒檢測方法，對提高腸道病毒疫情的應急能力，保障人類 生存健康，有著重要的意義。腸道病毒的傳統檢測方法為細胞培養法，存在費時費力、對培養技術要求高、結果 不穩定、根據細胞病變無法判斷是哪種病毒等不足之處。PCR方法具有快速、敏感性強、特異 性高等諸多優點，但PCR方法存在對檢測設備要求高，結果判斷不直觀等問題，限制其在基 層單位的應用。2000年，Notomi T等發明的LAMP技術針對靶基因(DNA或cDNA)的6個區 域，設計4條特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在恒溫(65°C 左右)水浴中反應1小時，核酸序列可擴增到109拷貝，反應結果可直接靠擴增副產物焦磷 酸鎂的沉淀濁度進行判斷。該方法縮短了擴增時間，提高了擴增效率，并且具有更高的靈 敏度、特異性，降低了儀器設備及檢測條件的要求，被公認為具有較強實用性的分子檢測技 術。目前，LAMP技術已經成功應用于多種病毒的檢測，如SARS冠狀病毒、登革熱病毒、埃博 拉病毒、丙型肝炎病毒等。
發明內容
本發明的目的是提供了一種用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的引物組；本發明的第二個目的是提供一種用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系。本發明的第三個目的是提供一種用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的方法。本發明的第四個目的是提供一種用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體 系的用途。本發明的技術方案概述如下用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的引物組，它由序列表中SEQ ID NO. 1所示 核苷酸序列、SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列、SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列和SEQ ID NO. 4 所示核苷酸序列組成。用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系，該體系由下述原料組成10 X 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 ii L ；25mmol/L 的 Mg2+ 1 u L-3 u L ；
5mol/L 的 Betaine 2 u L-6 u L ；lOmmol/L 的 dNTP 3. 5 u L-5 u L ；10 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 ii L ；10 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列0. 5 ii L ；100 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列0. 4 ii L ；100 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列0. 4 ii L ；8U/ii L 的 Bst 酶 1 ii L ；加超純水至總體積為20 u L。用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的方法，它包括下述步驟(1)提取待檢測樣品中的病毒RNA并逆轉錄為cDNA ； (2)取5 y L所述cDNA加入到 20uL的用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系中，10000轉/分鐘，離心30秒； (3)加入20 iiL礦物油，于61°C恒溫中進行環介導恒溫擴增技術擴增1-1.5小時；(4)取出 反應管，加入SYBR Green I型核酸染料，若反應液變成綠色，則說明待測樣品中存在腸道 病毒，若為桔黃色，則說明待測樣品中不存在腸道病毒，所述用環介導恒溫擴增技術檢測腸 道病毒的檢測體系由下述原料組成10 X 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 ii L ；25mmol/L 的 Mg2+ 1 u L-3 u L ；5mol/L 的 Betaine 2 u L-6 u L ；lOmmol/L 的 dNTP 3. 5 u L-5 u L ；10 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 ii L ；10 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列0. 5 ii L ；100 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列0. 4 ii L ；100 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列0. 4 ii L ；8U/ii L 的 Bst 酶 1 ii L ；加超純水至總體積為20 u L。用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系的用途。本發明具有下列優點1)高特異性4條引物對靶序列6個特異區域的識別保證了 LAMP擴增的高度特異 性，見圖1。2)高靈敏度LAMP所需擴增模板可達101拷貝/反應，見圖2。3)鑒定簡便擴增結果通過肉眼觀測，向反應液中加入SYBR Green I熒光染料 時，若反應液呈綠色，則為陽性；若反應液呈桔黃色，則為陰性反應，見圖3。4)操作簡單將待測樣品和檢測試劑混合后，只需放入ere恒溫加熱儀器中進行 LAMP反應即可。5)快速、高效整個擴增反應只需1小時-1. 5小時即可完成。本發明的檢測體系可以在等溫條件下，快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到 腸道病毒，不需要復雜儀器，為腸道病毒檢測提供了新的技術平臺，易于大范圍推廣應用， 具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益。
圖1 腸道病毒LAMP檢測體系的特異性。圖2 :LAMP(A)、PCR(B)檢測腸道病毒的靈敏度比較。圖3 本發明檢測體系SYBR Green I型熒光檢測法檢測結果圖。
具體實施例方式實施例1 特異性基因組序列查找和LAMP引物設計從GenBank中檢索獲得腸道病毒基因組序列，通過BLAST軟件進行同源性分析，找 到腸道病毒的特異性的保守靶序列。LAMP引物設計設計的具體LAMP引物組(用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的引物)包括的 引物為 經過在GenBank數據庫中比對分析，與該組腸道病毒通用引物具有高度相似性的 序列來源于各種腸道病毒，包括柯薩奇病毒、埃可病毒、腸道病毒71型等新腸道病毒，未發 現相似性較高的其它微生物序列(表1)。表1 部分與腸道病毒通用引物具有高度相似性的序列 實施例2 檢測體系的建立通過設置不同終濃度的Mg2+(2mmol/L，3mmol/L，4mmol/L，5mmol/L，6mmol/ L，7mmol/L)、dNTP(l.2mmol/L、l. 4mmol/L、l. 6mmol/L、l. 8mmol/L、2. Ommol/L)、 Betaine(0mol/L、0. 2mol/L、0. 4mol/L、0. 6mol/L、0. 8mol/L、lmol/L、1. 2mol/L)和溫度 (60°C、61°C、62°C、63°C、64°C、65°C )，優化得到最佳反應參數，從而建立腸道病毒LAMP檢 測體系。優化的檢測體系(20 PL)之一種如下10 X 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 u L ；25mmol/L 的 Mg2+ 2 u L ；5mol/L 的 Betaine 4 y L ；1 Ommol/L 的 dNTP 4. 5 u L ；10 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 ii L ；10 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列0. 5 ii L ；100 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列0. 4 ii L ；100 u mol/L的序列表中SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列0. 4 ii L ；8U/ ii L 的 Bst 酶 1 ii L ；加超純水至總體積為20 u L。檢測反應條件61 °C恒溫1小時。注Mg2+終濃度=(母液濃度 25mmol/LX2ii L+ThermoPol 緩沖液中含 20mmol/ LX2. 5u L)/25u L實施例3 用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系，該體系由下述原料 組成10 X 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 u L ；
25mmol/L 的 Mg2+ 1 μ L ；5mol/L 的 Betaine 3. 5 μ L ；10mmol/L 的 dNTP 5 μ L ；10 μ mol/L的序列表SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 μ L ；10 μ mol/L的序列表SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列0. 5 μ L ；100 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 4 μ L ；100 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 4 μ L ；8U/ μ L 的 Bst 酶 1 μ L ；加超純水至總體積為20 μ L0實施例4:用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系，該體系由下述原料 組成10 X 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 3 μ L ；5mol/L 的 Betaine 2 μ L ；IOmmol/L 的 dNTP 4 μ L ；10 μ mol/L的序列表SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 μ L ；10 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 5 μ L ；100 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 4 μ L ；100 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 4 μ L ；8U/ μ L 的 Bst 酶 1 μ L ；加超純水至總體積為20 μ L0實施例5 用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系，該體系由下述原料 組成10Χ 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+ 2 μ L ；5mol/L 的 Betaine 6 μ L ；IOmmol/L 的 dNTP 3. 5 μ L ；10 μ mol/L的序列表SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 μ L ；10 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 5 μ L ；100 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 4 μ L ；100 μ mol/L的序列表SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 4 μ L ；8U/ μ L 的 Bst 酶 1 μ L ；加超純水至總體積為20 μ L0實施例2-5中，體系為20yL，還可以同等倍數擴大或縮小該體系，各組分加入量 也隨擴大倍數或縮小倍數同比例擴大或縮小。實施例6 檢測體系的特異性分析以腸道病毒71型、腸道病毒柯薩奇A16、柯薩奇B3、柯薩奇B5、埃可30、脊髓灰質 炎病毒及甲型肝炎病毒7種病毒核酸為模板檢測體系的特異性。(1)反應體系(20 μ L)配制 (2) LAMP 擴增首先配置出20μ L用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系，取5μ L制備 好的待檢測樣品中的病毒RNA(已預先逆轉錄為cDNA)加到上述已配制好的用環介導恒溫 擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系中，使最終反應體積為25 μ L，10000轉/分鐘，離心30 秒，混勻反應液后，加入20 μ L礦物油，放于ere恒溫中，進行環介導恒溫擴增技術擴增1小 時。結果見圖1。圖1中的各個泳道分別是M DNA Marker;1-8 分別為腸道病毒71型、腸道病毒柯薩奇A16、柯薩奇B3、柯薩奇B5、埃可30、 脊髓灰質炎病毒、甲型肝炎病毒和陰性對照。上述結果表明，腸道病毒LAMP檢測法能夠擴增包括腸道病毒71型、腸道病毒柯薩 奇A16、柯薩奇B3、柯薩奇B5、埃可30在內的多種腸道病毒，具有良好的檢測特異性。實施例7 檢測體系的靈敏度分析以106_10°拷貝/μ L的含有腸道病毒71型5’ UTR區序列的標準質粒為模板，分 別進行LAMP和PCR，比較兩種檢測方法的靈敏度。結果見圖2。圖2(A)是LAMP檢測結果，圖2(B)是PCR檢測結果，兩圖中的各個泳道分別是M DNA Marker;1-7 分別以106_10°拷貝/μ L的標準質粒為模板；8:陰性對照。以上結果表明，用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系檢測腸道病毒的 效果很好，其靈敏度與普通PCR法一致。實施例8:用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系的SYBR Green I型 熒光檢測用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系和檢測過程同實施例7，反應結 束后向反應管中加入9μ L SYBR Green I型核酸染料，反應液變成綠色，則說明反應成陽 性。若為桔黃色，則反應為陰性，結果見圖3。圖3 (A):肉眼觀察。圖3(B)紫外燈下觀察。其中各個泳道分別是M DNA Marker;
1-7 分別以106_10°拷貝/μ L的標準質粒為模板；8:陰性對照。實施例9 取自實際環境水體樣品的用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測 體系檢測采集天津地區某處地表水水樣1L，濃縮10000倍，抽提濃縮水樣的總RNA，隨機引 物逆轉錄為cDNA作為模板備用。檢測體系如下。IOX 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 μ L ；25mmol/L 的 Mg2+2 μ L ；
5mol/L 的 Betaine 4 μ L ；10mmol/L 的 dNTP 4. 5 μ L ；ΙΟμπιοΙ/L 的引物 F3 0. 5yL;ΙΟμπιοΙ/L 的引物 B3 0. 5yL;100口11101/1的引物FIP0.4uL100口11101/1的引物BTP0.4uL8U/y L 的 Bst 酶 1 μ L ；加超純水至總體積為20 μ L.將上述cDNA稀釋10倍后取5 μ L加入到20 μ L的LAMP檢測體系中，10000轉/分 鐘，離心30秒，加入20 μ L礦物油，于61°C恒溫中進行LAMP擴增1. 5小時，取出反應管，加 入10 μ L SYBR Green I型核酸染料，反應液變成綠色，說明所測水樣中存在腸道病毒。用實施例3-5的用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系對與實施例9同 樣的實際環境水體樣品進行檢測，檢測步驟也同實施例9，各檢測體系的結果也使反應液變 成綠色，說明實施例3-5的用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系可用于檢測腸 道病毒。
權利要求
用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的引物組，其特征是它由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ IDNO.4所示核苷酸序列組成。
2.用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系，其特征是該體系由下述原料組成IOX 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 μ L ； 25mmol/L 的 Mg2+ 1 μ L-3 μ L ； 5mol/L 的 Betaine 2 μ L-6 μ L ； 10mmol/L 的 dNTP 3·5 μ L-5 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 μ L ； 10 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 2所示核苷酸序列0. 5 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 4 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 4 μ L ； 8U/ μ L 的 Bst 酶 1 μ L ； 加超純水至總體積為20 μ L0
3.用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的方法，其特征是它包括下述步驟(1)提取待檢測樣品中的病毒RNA并逆轉錄為cDNA; (2)取5 μ L所述cDNA加入到 20 μ L的用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系中，10000轉/分鐘，離心30秒； (3)加入20 μ L礦物油，于61°C恒溫中進行環介導恒溫擴增技術擴增1-1. 5小時；(4)取出 反應管，加入SYBR Green I型核酸染料，若反應液變成綠色，則說明待測樣品中存在腸道 病毒，若為桔黃色，則說明待測樣品中不存在腸道病毒，所述用環介導恒溫擴增技術檢測腸 道病毒的檢測體系由下述原料組成 10X 的 ThermoPol 緩沖液 2. 5 μ L ； 25mmol/L 的 Mg2+ 1 μ L-3 μ L ； 5mol/L 的 Betaine 2 μ L-6 μ L ； 10mmol/L 的 dNTP 3·5 μ L_5 μ L ；10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列0. 5 μ L ； 10 μ mol/L的序列表中SEQ ID NO. 2所示核苷酸序列0. 5 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 3所示核苷酸序列0. 4 μ L ； 100 μ mol/L的序列表中SEQ ID N0. 4所示核苷酸序列0. 4 μ L ； 8U/ μ L 的 Bst 酶 1 μ L ； 加超純水至總體積為20 μ L0
4.用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的檢測體系的用途。
全文摘要
本發明公開了用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的引物組及檢測體系，用環介導恒溫擴增技術檢測腸道病毒的引物組是由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列組成。本發明的檢測體系可以在等溫條件下，快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到腸道病毒，不需要復雜儀器，為腸道病毒檢測提供了新的技術平臺，易于大范圍推廣應用。
文檔編號C12Q1/68GK101892324SQ20101021728
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月5日 優先權日2010年7月5日
發明者孟斌, 尹光雅, 張國輝, 李國良, 王俊虹, 王毅錚, 趙化冰, 趙國平, 趙宏, 高宏生, 黃愛華 申請人:中國人民武裝警察部隊醫學院