染色體的無痕跡修飾方法

專利名稱：染色體的無痕跡修飾方法
技術領域：
本發明涉及采用基因重組手段對染色體上一個或多個靶基因進行插入、敲除或置 換的方法，尤其是一種不會給原染色體留下任何篩選標記或者外源DNA序列的無痕跡修飾 方法，屬于染色體基因組改造技術領域。
背景技術：
染色體基因組改造技術，例如基因干擾、外源基因插入、基因突變等技術，對于生 物能源、代謝工程和農業工程領域非常重要。Red/ET重組工程(Recombineering)是近年來 建立的一種新型遺傳工程技術，它是通過噬菌體產生的重組蛋白(EX0、Beta、Gam)介導的 高效率的體內同源重組反應，對目的DNA序列進行基因插入、敲除、替換等操作，不需要選 擇合適的限制性內切位點。真核細胞和一些細菌的基因重組工程中的瓶頸之一是存在高頻率的非同源重組 和低效率的同源重組，因而需要大量篩選以便分離出所需的突變基因，這種方法在緩慢生 長的細菌如mycobacteria中不起作用，因為同源重組與非同源重組相比頻率要低得多。為了避免大容量地篩選重組基因，一般需要在轉運盒中包含篩選標記以利于確認 靶點基因區的敲入或敲除。然而，插入的篩選標記會影響基因組的進一步改造。為了防止 基因組改造后的染色體帶有殘余篩選標記(例如抗生素抗性基因)或者外源DNA序列 (例如FRT或IoxP位點)，目前常用的方法是利用Flp重組酶靶點(FRP)或Cre重組酶靶 點(IoxP)介導的位點特異性，從而達到準確剪切篩選標記的目的。然而，以上方法有各自 的特點和缺陷。其一，在篩選標記剪切后仍然存在至少一個FRT位點或IoxP位點，即所謂 的殘留痕跡；其二，即使在重組酶不存在的情況下，含有多個殘留痕跡的染色體由于痕跡點 之間的重組現象，容易導致染色體基因組的隨意重排或敲除。因此，迫切需要一種能夠改造 靶基因或基因組序而沒有留下篩選標記或外源DNA序列等殘留痕跡的方法。對此，目前常用的一種方法是在遞換盒中建立一個反篩選標記，這樣，那些喪失了 外源序列的反篩選克隆由于會產生顯性致死效應而被確認。例如，在str印tomycetes，glkA 基因可作為反篩選標記基因。含有葡萄糖類似物2-脫氧葡萄糖的培養基能導致菌株內的 傳遞盒丟失，這對glkA+菌株具有致死作用。與此相似，在Saccharomyces cerevisiae可以 使用ura 3基因進行陽性和陰性篩選。在尿嘧啶缺乏的培養基中篩選野生型，在包含5-氟 乳清酸(5-F0A)培養基中篩選營養缺陷型，因為5-F0A是尿嘧啶前體的類似物并且可以轉 化為氟尿嘧啶(酵母的一種強抑制劑)，野生型在5-氟乳清酸培養基不能生長。上述方法存在明顯的缺陷，它們牽涉到兩次交換過程，在最后的重組步驟中沒有 陽性篩選，而且局限于glkA或者pyrF無效突變菌株中起作用。另外，每一個敲除步驟需重 復的質粒轉化和敲除，耗時而且勞動強度大。因此，需要一種新的基因組整合(或敲除)方 法，要求所有的步驟具有選擇性能，尤其是在最終的重組過程中；而且，宿主基因組的唯一 改變是插入或敲除理想基因，不會留下任何篩選標記或殘留痕跡)。

發明內容
本發明的目的就是為了解決現有技術中存在的上述問題，提供一種染色體的無痕 跡修飾方法。本發明的技術解決方案是染色體的無痕跡修飾方法，首先，構建包含陽性篩選標 記、反篩選標記、內切核酸酶I-Scel、誘導性啟動子、I-SceI識別位點、與靶染色體核酸序 列同源的靶核酸置換序列的重組盒；然后，用電轉化的方法把上述DNA片段輸入包含重組 質粒的宿主；接著，通過I-SceI介導的雙鏈斷裂修復現象從所希望的重組體中敲除以下基 因序列陽性篩選標記、可誘導啟動子、I-Scel基因、反篩選標記；最后，在蔗糖培養基上篩 選最終重組體。所述重組盒轉化的是Escherichia coli。進一步地，上述的染色體的無痕跡修飾方法，對靶染色體的修飾包括一次或多次 地“插入一個或多個核苷酸到靶細胞基因組”或“從靶細胞基因組中敲除一個或多個核苷 酸”或“置換靶細胞基因組中一個或者多個核苷酸”，所述靶細胞基因組系指內源基因、內源 基因間的核酸序列或非基因核酸序列。更進一步地，上述的染色體的無痕跡修飾方法，按以下步驟修飾微生物特定染色 體區1)準備一個線性DNA片段，包含與λ-red重組有關的可以導入靶向微生物的同源 臂B和C，陽性篩選標記，反篩選標記，I-SceI基因，I-SceI識別位點，與同源重組敲除篩選 標記有關的可誘導啟動子、同源片段A ；2)導入線性DNA片段到含有權利要求1所述重組盒的微生物，通過λ -Red重組置 換位于DNA片段同源臂和與同源臂同源的染色體之間的特定位點；3)在誘導I-SceI內切核酸酶表達的條件培養基中，培養特定染色體位點置換的 微生物，導致雙鏈斷裂，位于同源片段A和與片段A同源的染色體區之間的同源重組用于 敲除篩選性標記，其中同源臂B與染色體的敲除靶點一端的50-500bp同源，同源臂C與另 一端的50-500bp同源，同源片段A是連接與同源臂B和同源臂C同源的染色體區的一端 300-500bp的區域。其中，所述篩選標記包括陽性篩選標記和陰性篩選標記，陽性篩選標記是從包含可視的 檢測標記中篩選的，允許重組體在缺乏營養源的培養基中生長，賦予重組體對某種化合物 產生抗性，陰性篩選標記是一種在底物存在下對細胞有致死作用的標記；所述篩選底物包括基本培養基，缺乏對一個或者多個靶細胞或抗生素必需的一種 或多種營養源；且，所述步驟1)和步驟2)可以重復多次，準備多個不同的線性DNA片段，以修飾微生 物的一系列特定染色體區。本發明采用無痕跡基因重組手段對染色體上一個或多個靶基因進行修飾，包括一 次或多次地“插入”、“敲除”或“置換”，修飾之后不會留下任何篩選標記(例如抗生素抗性 基因)或外源DNA序列(例如FRT或IoxP位點)，是無痕修飾宿主細胞DNA序列的有效方法。根據本發明，首先在靶細胞中轉化一個可誘導表達的重組系統，然而將含有陽性 篩選標記和反篩選標記的外源DNA引入靶細胞。在靶細胞中引發一系列過程如誘導重組系 統；篩選呈陽性重組靶細胞；誘導及表達特異內切核酸酶(例如I-Scel)和一個反篩選標記(例如sacB)。然后，通過在靶細胞中引發一個斷裂雙鏈(DSB)現象，剔除在DNA靶序列 中的陽性和反篩選標記，最后，通過接種到蔗糖培養基，篩選所期待的重組菌株。靶基因的修飾可以分三個步驟。第一步，通過PCR構建一個包含以下因素的線 性DNA序列盒陽性篩選標記(CM)、誘導性啟動子(Pi)、I-Scel基因(SceI)、反篩選標記 (SacB)、I-Scel識別位點(I)、用以修飾的基因和三個同源臂(分別用A、B和C表示)。第二 步，用電轉化的方法把上述DNA片段輸入包含重組質粒的宿主。因為重組質粒(例如pKD46) 含有編碼λ噬菌體Red重組所需基因，所以通過Red酶介導的同源重組現象由上述DNA片 段來置換靶基因，并在含氯霉素培養基上篩選出被置換的細胞。第三步，通過I-SceI介導 的雙鏈斷裂修復現象從所希望的重組體中敲除以下基因序列陽性篩選標記(CM)、可誘導 啟動子(Pi)、I-Scel基因(SceI)、反篩選標記(SacB)，最后在蔗糖培養基上篩選最終重組 體。此流程可重復進行，以便構建含多個修飾點的突變菌株。當完成了所有修飾后，宿主內 剩余的Red質粒(例如pKD46)可以在37°C下合適的培養基中從生長的突變體中清除。


圖1是本發明對染色體進行無痕跡修飾的步驟示意圖。其中，步驟(A)，通過PCR組裝包含以下因素的線性DNA序列盒陽性篩選標記(CM)、可 誘導啟動子(Pi)、I_SceI基因(Seel)、反篩選標記(SacB)、I-SceI識別位點(I)、替換基因 片段、三個同源臂(用A、B和C代表)。PCR引物使用下劃線、斜體字母(P-fl，P-rl，P-f2 和P-r2)和箭頭標記；步驟(B)，E. coli染色體上的基因組靶點被上述線性DNA序列盒所置換，并在含氯 霉素的LB培養基上篩選重組體；步驟(C)，通過I-SceI介導的雙鏈斷裂修復現象從所希望的重組體中敲除以下基 因序列陽性篩選標記(CM)、可誘導啟動子(Pi)、I_Scel基因(SceI)、反篩選標記(SacB)， 最后在蔗糖培養基上篩選最終重組體。
具體實施例方式本發明通過應用陽性篩選和反篩選標記對宿主染色體進行無縫修飾。首先，用含 有陽性抗性標記的DNA片段置換靶基因，在篩選性培養基檢測重組體，然后通過I-SceI誘 導的雙鏈斷裂和反篩選標記基因sacB篩選不含任何篩選標記或者外源DNA序列的最終重 組體。本發明根據靶細胞體內的DNA重組和選擇機理，減少了一些不必要的步驟如質粒 轉化及重復篩選。本發明使用了反篩選性標記基因，例如Bacillus subtilis的sacB基因，使大量 細菌對蔗糖產生敏感性。SacB基因編碼果聚糖蔗糖酶，催化蔗糖水解或聚合形成致死性產 物果聚糖。E. coli和眾多革蘭氏陰性菌當sacB基因表達時無法生長，因此可以通過同源重 組直接篩選丟失sacB基因的細胞。本發明使用了內含子編碼的歸巢內切核酸酶I-Scel，可以將一個斷裂雙鏈(DSB) 轉化到基因組。斷裂雙鏈是微生物重組系統的底物，可以通過同源重組修復與斷裂末端兩 翼同源的序列區。在宿主斷裂雙鏈介導的修復系統幫助下，無標記修飾可以整合到革蘭氏
5陰性菌的基因組，例如 Escherichia coli 禾口 Salmonella typhimurium。本發明提供了含有誘導性重組系統的靶細胞。第一個外源的核酸序列，包含陽性 篩選標記、反篩選標記、特異內切核酸酶(I-SceI)、可誘導啟動子、I-SceI識別位點和與靶 染色體核酸序列同源的靶核酸置換序列，導入到靶細胞，表達可誘導的重組系統，篩選陽性 重組靶細胞，表達特異內切核酸酶(例如I-SceI)和反篩選標記(例如sacB)。通過斷裂雙 鏈機制敲除陽性和反篩選標記，在含蔗糖培養基上篩選丟失sacB基因的突變體。本發明采用了可見的檢測標記，如熒光活性細胞篩選(FACS)或微流體技術可以 進行陽性和陰性篩選或掃描。檢測標記包括各種酶、輔基、熒光標記、發光標記、生物發光標 記等。熒光蛋白包括(但不局限于)黃色熒光蛋白(YFP)、綠色熒光蛋白(GFP)、青色熒光蛋 白(CFP)等。生物熒光標記包括(但不局限于)熒光酶、熒光素、水母素等。可視檢測信號 的酶系統包括但不局限于半乳糖苷酶、糖皮質激素酶、磷酸酶、過氧化物酶、膽堿酯酶等。本發明中，陽性篩選標記是可以賦予細胞抵抗某種化合物的基因，在此基因不存 在情況下，化合物對細胞有殺傷作用。例如，表達抗生素抗性基因的細胞在抗生素存在下可 以存活，而缺乏這基因的細胞將不能存活。例如氯霉素抗性基因能夠在氯霉素存在下進行 陽性篩選。抗生素抗性基因包括(但不局限于)氨芐青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、殺 稻瘟菌素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、四環素抗性基因等。 本發明中，反篩選標記是在特定底物存在下對靶細胞具有致死作用的基因。例如， sacB基因在蔗糖存在下具有致死作用。因此在含蔗糖培養基上生長的細胞并不表達SacB 基因。反篩選標記包括但不局限于glkA、pyrF、thyA、sacB、mazF、rpsL等。本發明中，特異內切核酸酶是通過內含子編碼的基因，在同源染色體的準確位置 誘導雙鏈斷裂。特異內切核酸酶包括但不局限于=I-Sce I、I-Ceu I、P I-Psp I、P I-Sce I、I-Ppo I 等。本發明中，誘導性啟動子是一個通過添加誘導物進行靶序列的有條件表達的DNA 元件。微生物中誘導性啟動子有但不局限于rha、tet、lac、ara、Gall、CUPl、CTRl/3、MET25寸。本發明中，靶細胞可以是任何真核或原核細胞。例如，靶細胞可以是細菌細胞如 E. coli、昆蟲細胞如Drosophila melanogaster細胞、植物細胞、酵母細胞、兩棲動物細胞如 Xenopus Iaevis細胞、線蟲類細胞如Caenorhabditis elegans細胞、哺乳細胞如中國倉鼠 卵巢細胞(CHO)、非洲綠猴腎細胞(COS)、人胎兒細胞(293T)或其它人細胞。培養的和移植 的細胞在本發明中都可以使用。本發明可以連續改變靶細胞中的一個或多個靶核酸序列(例如內源基因)，包括 添加一個或多個核苷酸到靶細胞，從靶細胞中敲除靶核苷酸，改變靶細胞中一個或多個內 源基因、基因間核苷酸序列、非基因人工DNA。為了證明本發明中方法的可行性，以下結合說明書附圖以Yersinia pestis菌株 KIM6+的relA基因來置換Escherichia coli K-12菌株(MG1655)中位于A和C同源區之 間的靶基因組為例，對本發明技術方案作進一步說明。其中，置換片段(relA基因)可由 PCR擴增產生，并使用正向(P-fl)和反向(P-rl)引物。如圖1所示，本發明通過重組PCR構建了篩選盒(CM-PrhaB-SCeI-SaCB-I)，其中 包含五個DNA區陽性篩選標記(CM)、誘導性啟動子(Ρ-Β)、I-SceI基因、陰性篩選標記(sacB)和 I-SceI 識別位點(I)。首先，通過常規PCR從pDESTIO質粒中擴增氯霉素抗性基因(CM)片段、從pREDl 質粒中擴增含和一個I-SceI基因的片段、從質粒pSC中擴增含sacB基因和I-SceI識 別位點(I)的片段。然后，純化這些擴增的基因片段，通過重組PCR反應將上述基因片段進行裝配，得 到所需的篩選盒(CM-PAaB-SceI-sacB-I)。位于靶點區左側的0. 5kb同源片段可通過常規 PCR從E. coli K-12菌株MG1655染色體上擴增得到。這個0. 5kb同源片段的一包含一個 20bp的側翼序列，0. 5kb片段的3，端與待置換的DNA片段的5，端重疊，0. 5kb片段的5，端 與上述的篩選盒的3’端重疊。最后，采用正向引物(P_f 2)和反相弓I物(P_r2)由重組PCR組裝成包含3個PCR 片段(同源片段、篩選盒和置換片段)的置換盒。電感受態細胞的準備。含Red質粒pKD46的E. coli MG1655宿主細胞30°C下 在添加氨芐青霉素的LB培養基中生長，通過離心收獲處于對數生長期的細胞，用10%冷 凍甘油洗滌三次。用電轉化將上述DNA置換盒轉入到電感受態E. coli MG1655宿主細胞 中，通過E. coli體內重組過程來置換染色體上的靶點區。轉導到上述基因組中的篩選盒 (CM-PrhaB-Scel-sacB-l)通過L-鼠李糖誘導的I-SceI內切核酸酶表達介導的雙鏈斷裂修 復從構建的重組E. coli菌株中剪切掉。然后使用含L-鼠李糖和5%蔗糖的新鮮LB液體培 養基篩選無標記置換的突變體。綜上所述，本發明提供了一種對染色體進行無痕跡修飾的方法。需要注意的是，該 方法適用于各種基因改造，以上描述中的相關條件均為非限制性條件。凡在本發明的啟示 下，僅作相關條件的等同替換或等效變換所形成的技術方案，均在本發明要求保護的范圍 之內。
權利要求
染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于首先，構建包含陽性篩選標記、反篩選標記、內切核酸酶I SceI、誘導性啟動子、I SceI識別位點、與靶染色體核酸序列同源的靶核酸置換序列的重組盒；然后，用電轉化的方法把上述DNA片段輸入包含重組質粒的宿主；接著，通過I SceI介導的雙鏈斷裂修復現象從所希望的重組體中敲除以下基因序列陽性篩選標記、可誘導啟動子、I Scel基因、反篩選標記；最后，在蔗糖培養基上篩選最終重組體。
2.根據權利要求1所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于所述重組盒轉化的 是 Escherichia coli0
3.根據權利要求1所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于按以下步驟修飾微 生物特定染色體區，1)準備一個線性DNA片段，包含與λ-red重組有關的可以導入靶向微生物的同源臂B 和C，陽性篩選標記，反篩選標記，I-SceI基因，I-SceI識別位點，與同源重組敲除篩選標記 有關的可誘導啟動子、同源片段A ；2)導入線性DNA片段到含有權利要求1所述重組盒的微生物，通過λ-Red重組置換位 于DNA片段同源臂和與同源臂同源的染色體之間的特定位點；3)在誘導I-SceI內切核酸酶表達的條件培養基中，培養特定染色體位點置換的微生 物，導致雙鏈斷裂，位于同源片段A和與片段A同源的染色體區之間的同源重組用于敲除篩 選性標記，其中同源臂B與染色體的敲除靶點一端的50-500bp同源，同源臂C與另一端的 50-500bp同源，同源片段A是連接與同源臂B和同源臂C同源的染色體區的一端300-500bp 的區域。
4.根據權利要求3所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于所述步驟1)和步驟 2)重復多次，準備多個不同的線性DNA片段，以修飾微生物的一系列特定染色體區。
5.根據權利要求3所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于所述篩選標記包括 陽性篩選標記和陰性篩選標記。
6.根據權利要求5所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于所述陽性篩選標記 是從包含可視的檢測標記中篩選的，允許重組體在缺乏營養源的培養基中生長，賦予重組 體對某種化合物產生抗性。
7.根據權利要求5所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于所述陰性篩選標記 是一種在底物存在下對細胞有致死作用的標記。
8.根據權利要求3所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于所述篩選底物包括 基本培養基，缺乏對一個或者多個靶細胞或抗生素必需的一種或多種營養源。
9.根據權利要求1所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于對靶染色體的修飾 包括一次或多次地“插入一個或多個核苷酸到靶細胞基因組”或“從靶細胞基因組中敲除一 個或多個核苷酸”或“置換靶細胞基因組中一個或者多個核苷酸”。
10.根據權利要求9所述的染色體的無痕跡修飾方法，其特征在于所述靶細胞基因組 系指內源基因、內源基因間的核酸序列或非基因核酸序列。
全文摘要
本發明提供一種對染色體的無痕跡修飾方法。首先，構建包含陽性篩選標記、反篩選標記、內切核酸酶I-SceI、誘導性啟動子、I-SceI識別位點、與靶染色體核酸序列同源的靶核酸置換序列的重組盒；然后，用電轉化的方法把上述DNA片段輸入包含重組質粒的宿主；接著，通過I-SceI介導的雙鏈斷裂修復現象從所希望的重組體中敲除以下基因序列陽性篩選標記、可誘導啟動子、I-Scel基因、反篩選標記，最后在蔗糖培養基上篩選最終重組體。該方法可以對染色體靶基因進行插入、敲除或置換，不會留下任何篩選標記或外源DNA序列，是無痕修飾宿主細胞DNA序列的有效方法。
文檔編號C12N15/09GK101892221SQ20101021328
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月30日 優先權日2010年6月30日
發明者王德明 申請人:蘇州神洲基因有限公司