專利名稱：用于檢測霍亂弧菌o139群的引物和試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種用于檢測霍亂弧菌0139群的引物和試劑盒。
背景技術：
霍亂弧菌(Vibrio cholerae)屬于弧菌屬，是霍亂的病原菌，霍亂是一種烈性腸道傳染病，是流傳時間長、影響范圍廣的一種食源性疾病，其典型臨床表現為腹瀉、嘔吐和由此引起的體液丟失、脫水、周身循環衰竭、電解質紊亂、低鉀綜合癥、腹部痙攣甚至死亡，被世界衛生組織確定為必須國際檢疫的傳染病之一，《中華人民共和國傳染病防治法》將其列為應實施“強制管理”的甲類傳染病。霍亂腸毒素(Cholera enterotoxin，CT)是引起霍亂疾病的主要原因，產腸毒素基因的調控基因位于霍亂毒力島(vibrio pathogenicity islancUVPI)。從霍亂爆發流行分離的菌株，大部分具有耐熱的菌體(0)抗原和不耐熱的鞭毛(H)抗原。根據0抗原不同，目前已將霍亂弧菌分出近200個0血清型。1992年以前，僅01群霍亂弧菌的兩個生物型(古典生物型和埃爾托生物型)引發了七次霍亂世界大流行。1992年10月，在印度和孟加拉國首次發生了由非01群霍亂弧菌引起的霍亂大暴發，被鑒定為由0139型引起的，其癥狀與 01型霍亂引起的霍亂病極為相似。0139菌株引起的霍亂已經成為孟加拉地區的流行病，可能也是引起第八次霍亂爆發流行的主因。0139群霍亂弧菌感染比01群嚴重，表現為嚴重脫水和高死亡率，且成人病例所占比例較高(約占70% )。1989年2月21日中國公布的《中華人民共和國傳染病防治法》，規定管理的傳染病分為甲、乙、丙三類，霍亂為兩種甲類管理的傳染病之一。中國國家質量監督檢驗檢疫總局的2002年第25和沈號令中明確規定霍亂弧菌為必檢項目。霍亂弧菌的快速而準確的檢測，有利于對其自然流行的監測和預防，并且對生物恐怖活動的防范具有一定的應用價值。目前對該菌的檢測，通常是在堿性瓊脂平板上經選擇性增菌，后通過一系列的生化方法鑒定，費時費力，一般至少要耗時4-6天。且霍亂弧菌在某些不適合生長的條件下， 可形成一種存活但不可培養狀態(viable but not culturabIe state，VBNCS)，采用傳統的免疫學方法和生物方法都不能全面的檢測和鑒定霍亂弧菌。但利用核酸檢測的方法，即使在不進行選擇性富集培養和純化的情況下，也可以進行檢測鑒定。因此，基于核酸的檢測方法比傳統的富集培養的方法更具優勢。Taqman熒光PCR方法是核酸檢測方法的一種，是在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光探針，使用實時監測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術。它還具有以下優點(1)特異性強引物和探針的“雙保險”，避免檢測的假陽性。⑵靈敏度高分析PCR產物的對數期，自動化儀器收集熒光信號，避免了許多人為因素干擾。(3)避免污染全封閉反應，無需PCR后處理，避免污染，保證了結果的可靠性。 (4)實現定量運用標準品獲得標準曲線，結合Ct值進行準確定量。(5)高效低耗可實現一管多檢。(6)操作簡便在線式實時監測擴增結果，不必接觸有害物質，操作安全。(7)快速反應時間< 1.5小時。正因為熒光PCR具有這些優勢，目前已被廣泛應用于微生物檢測、疾病監測和臨床檢驗等領域，大大提高了檢測效率，縮短了檢測周期，降低了檢測成本， 提高了經濟和社會效益。
發明內容
本發明的目的在于提供一種用于檢測霍亂弧菌0139群的引物，以快速、方便地檢測霍亂弧菌0139群，該引物由SEQ ID NO 1_2所示的核苷酸序列組成。本發明所述的引物可以用于制備用于檢測霍亂弧菌0139群的基因芯片和/或試劑盒。其中所述的基因芯片優選為微列陣芯片。本發明還提供一種用于檢測霍亂弧菌0139群的基因芯片，其包含上述的引物。其中所述的基因芯片優選為微列陣芯片。本發明還提供一種用于檢測霍亂弧菌0139群的試劑盒，其包含上述引物。本發明所述的試劑盒，還包含探針，其核苷酸序列如SEQ ID NO 3所示。本發明所述的試劑盒，還可以包含標準品、陽性對照、陰性對照、緩沖液(包括 buffer和dNTP)和DNA聚合酶。應用本發明所述的試劑盒檢測霍亂弧菌0139群的方法如下(1)提取待檢樣品中的細菌DNA作為模板；(2)在熒光PCR薄壁管中分別加入緩沖液、引物和探針的混合物，然后加入正對照、負對照或從檢測樣品中提取的模版DNA，并用ddH20補足到一定體積，混勻；(3)將PCR薄壁管中混勻的混合物在熒光定量PCR儀上擴增；(4)分析熒光定量結果并進行結果判斷。本發明配制的一種可檢測霍亂弧菌0139群的可產業化生產的試劑盒，將熒光PCR 檢測方法需要使用的組分組合在一起，使用時，提取待檢樣品基因組，同時經過較為簡單的操作程序就可以進行快速、靈敏、簡便的檢測、試劑盒中各組分的用量和濃度均為試驗所得，用該試劑盒檢測檢測霍亂弧菌0139群操作簡便，快速，成本低。為讓本發明的上述和其它目的、特征和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。
圖1為菌落PCR鑒定含wbfQ基因的陽性克隆的電泳圖；圖2為霍亂弧菌0139群標準品各稀釋度的擴增曲線；圖3為霍亂弧菌0139群標準品制訂的標準曲線；圖4為霍亂弧菌0139群的擴增曲線；圖5為未分型的霍亂弧菌和其他弧菌的擴增曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限定本發明的范圍。此外，應理解在閱讀了本發明講述的內容以后，本領域的技術人員可以對本發明做各種改動或修改，這些等價形式同樣屬于本申請所附權利要求所限定的范圍。本發明的具體原理是利用一對靶核苷酸序列的特異性引物和一個特異性熒光探針，采用耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、四種核苷酸單體(dNTP)等成分，并應用PCR技術實現靶核苷酸序列的核酸片段擴增。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團所吸收，而在 PCR擴增過程中，Taq酶的5’端外切酶活性將特異結合在靶核苷酸片段上的熒光探針酶切降解，使熒光報告基團游離于反應體系中，脫離了熒光淬滅基團的屏蔽作用，熒光報告基團的熒光信號就可以由儀器檢測到，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比，從而判定待測樣本中靶核苷酸序列的存在。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規條件，如《分子克隆操作指南》(第三版)(J.薩姆布魯克等等著)或按照試劑廠商說明書的條件。所用無機化學和有機溶劑均符合分子生物學試驗要求。引物和探針由大連寶生物公司合成，PGEM-T Easy Vector和T4 Iigase均購自Promega，Taq DNA聚合酶購自上海生工生物工程技術公司，熒光PCR儀為美國ABI的7300。實施例1引物和探針設計根據GeneBank公布的霍亂弧菌0139的0抗原基因簇序列(序列接收號Y07786)， 通過對該0抗原序列的各基因的功能分析和蛋白質輸水結構分析，選擇霍亂弧菌0139的 wbfQ基因為靶基因，設計特異引物和探針，引物長度一般為20個堿基左右，引物間和引物內無互補序列。所設計的引物和探針都經Blast檢索能檢測出所有已知的霍亂弧菌0139 群菌，不與其他霍亂弧菌血清型和其他細菌產生陽性結果。最優引物、探針序列組合如下(1)霍亂弧菌 0139 群的上游引物，其序列為 VC0139_F 5-GCAGCAAAATTTGTTAGAGA CATCT-3(SEQ ID NO 1)(2)霍舌L弧菌0139群的下游弓丨物，其序列為VC0139_R: 5-TGTCTGCGCGTGTATATTGG-3(SEQ ID NO :2)(3)霍亂弧菌 0139 群的 TaqMan 探針，其序列為 0139-P 5-ACCTAAATCCCACAATGAA CTACCTTGGCT-3(SEQ ID NO 3)下述為GeneBank公布的Y07786號霍亂弧菌0139群的wbfQ基因的核酸序列 (SEQ ID NO :4，下述序列中的開始粗體到末后粗體之間的序列為701bp)及標注的的設計引物和探針序列的設計區，其中下劃線標識的為real-time PCR上下游引物設計區，斜體為 TaqMan探針設計區。ATGCTTTGGTTACCAGGCA CTGCACGTCAGACATTAGTTTAT TCGCCGGGTGAATTTGGTACATTTTTTGTTCTATGGTTTGGTCTTTATTTTGATAGAATAAACGTTTTTATTGATGAGGCATCAACTTACGCAATCATCAATTTTGCACTATCAGTTTTTTTGATTTCAGTTTCACGTCGTAAATTTGCAATATGTTTCTTTGCGTTTTCTTTTTTTGCAAGCATGGCAAAGGTTTTTGTTATTTTATTGCCATTGTTTTTGTTTTTTAATCTATTGAATTTTAAATTCAATAGATTAATTAAGTTGTTTATTCTGTTTGTTTTTGTTTTTATAATAAGCTATCCCTTCTTAATAAATATTTTGGTTGATTTGTTTTTTAATGGTCAAATTATATTGGATTTAAGCGATTCTTTGTCTGCGCGTGTATATTGGACATGGATGATT AGCCAAG r7r^r7rrr^rr(7r(7r7^rr7>fGGrGAGATGTCTCTAACAAATTTTGCTGCTTTTGATGGCTATGTTTCTAAATTGGCTTTTTTTATGGGTGGGTTGTTTTCTTTGTTATTTGTGAGGCAGAAAATATTCGCT
TTATCTTTGCTTTTTACACTTATAGCATCTTTTCAGTATGGCTCTGTCTTTTTTATGGGGTGGCTATATTATATTTTACTAGTAAGTTTTAATAATATTACACATTTAAATAGAGGT 'GCTAAACGATGTGC GGTG TAG實施例2霍亂弧菌0139群標準品的制備和標定(I)PCR擴增目的帶用PCR方法將包含有real-time PCR引物和探針的序列擴增出來(引物序列如SEQ ID NO 1-2所示)，PCR反應程序如下94°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，50°C退火30秒， 72°C延伸1分鐘，進行30個循環；最后72°C繼續延伸5分鐘，得到PCR產物，用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物的大小及其特異性；產物長度為約701bp。PCR產物切膠回收， 并用上海生工生物工程技術公司的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒回收純化PCR產物。(2)連接將PCR純化產物與Promega公司的3 X 10_3的pGEM-T-Easy載體于4°C連接24小時，總體積為 ο μ 1，其中有1 μ 1的IOX緩沖液和0. 5U的T4 DNA連接酶，得到連接產物。(3)電轉化用Bio-Rad公司的電轉化感受態細胞的制備方法制備感受態大腸桿菌DH5 α細胞，取2-3 μ 1上述(2)的連接產物與60 μ 1感受態大腸桿菌DH5 α混合后，轉到Bio-Rad 公司的0. 2cm的電擊杯中電擊，電壓為2. 5kv,時間為5. 0毫秒-6. 0毫秒，電擊后立即在杯中加入ImL的SOC培養基使菌復蘇，然后將菌涂在含有氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體培養基上37 °C過夜培養，次日得到藍白菌落。(4)菌落PCR鑒定隨機挑取4個白色菌落即白色克隆進行菌落PCR鑒定。PCR反應體系和反應條件同本實施例(1)中的常規PCR相同。反應結束后，取3μ1 PCR擴增產物進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。檢測結果見圖1所示(泳道M :DL2000 Marker,泳道1_4分別為隨機挑取的白色菌落1-4)，結果4個克隆經PCR鑒定都有701bp的目的條帶，都為正確克隆。(5)質粒提取取上述(4)中鑒定正確的陽性克隆菌落1(命名為H1982)，將其接種于含氨芐的 LB液體培養基中過夜培養，采用《分子克隆實驗指南》(第三版)(J.薩姆布魯克等著)中 SDS堿裂解法提取質粒。該質粒命名為PLW1537。(6)測序用通用的SP6和T7引物對提取的PLW1537質粒進行測序，結果表明PLW1537所攜帶的擴增片段序列具有上述的701bp的核苷酸序列，表明PLW1537所攜帶的701bp的擴增片段與霍亂弧菌0139群的wbfQ基因待擴增的序列完全一致，構建的質粒序列完全正確。(7)PLW1537 的濃度測定取1 μ 1 PLW1537的原液用NanoDrop OD儀測定OD260值，結果測得的PLW1537原液的濃度為55. 4ng/ μ Ι, μ 1 PLW1537原液含有1. 5 X IO10個拷貝。實施例3繪制標準曲線將PLW1537 原液 10 倍梯度稀釋得到 1. 5 X 107、1. 5 X IO6、1. 5 X 105、1. 5 X 104、 1. 5Χ IO3個拷貝real-time PCR檢測，25 μ 1反應體系見下表1 表 1 Real-time PCR 反應體系
權利要求
1.一種用于檢測霍亂弧菌0139群的引物，其特征在于，由SEQ IDN0:l-2所示的核苷酸序列組成。
2.權利要求1所述的引物在制備用于檢測霍亂弧菌0139群的試劑盒和/或基因芯片中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于所述的基因芯片為微列陣芯片。
4.一種用于檢測霍亂弧菌0139群的試劑盒，其特征在于，包含權利要求1所述的引物。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，還包含探針，該探針的核苷酸序列如 SEQ ID NO 3 所示。
6.根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特征在于，還包含標準品、陽性對照、陰性對照、緩沖液和DNA聚合酶。
7.一種用于檢測霍亂弧菌0139群的基因芯片，其特征在于，包含權利要求1所述的引物。
8.根據權利要求7所述的基因芯片，其特征在于，所述的基因芯片為微列陣芯片。
全文摘要
本發明提供一種用于檢測霍亂弧菌O139群的引物和試劑盒，該引物由SEQ ID NO1-2所示的核苷酸序列組成，其試劑盒中含有上述的引物。使用本發明的引物和試劑盒，經過較為簡單的操作程序就可以進行快速、靈敏、簡便的檢測霍亂弧菌O139群，操作簡便，快速，成本低。
文檔編號C12N15/11GK102296106SQ20101021246
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者劉斌, 吳凡, 張曦, 王敏, 王磊, 陳敏 申請人:上海市疾病預防控制中心, 上海市預防醫學研究院, 天津生物芯片技術有限責任公司