專利名稱：受激發子Nep1誘導的過敏性細胞死亡的調控基因的克隆方法
技術領域：
本發明涉及篩選受激發子誘導的過敏性細胞死亡的調控基因的方法，屬于分子生物學領域。
背景技術：
由各類病原菌引起的植物病害嚴重威脅著農業生產安全。而由其產生的激發子禾口_禾呈t匿(pathogen-associated molecular patterns, PAMP) i一^HM的信號分子，模仿非親和互作中植物與病原菌的信號交流，啟動不同的級聯信號途徑，引起過敏性細胞死亡(hypersensitive cell death, HCD)，誘發植物的系統獲得抗性(systemic acquiredresistance, SAR)。最近，研究發現，植物的HSP90、MAPKKK α、NtLPRl、ΜΕΚ2、MAPKK 禾口 WRKY 等基因可調控動物的促凋亡蛋白Bax或非親和病原菌等生物脅迫誘發的HCD，同時也發現植物病原細菌和卵菌分泌的效應分子可抑制激發子和非親和病原菌誘發的HCD，但是，植物細胞感受病原菌激發子信號后如何啟動早期的細胞死亡程序和一系列基因的表達，最終誘發非寄主植物HCD的分子機制仍不清楚。因此，克隆受病原菌激發子誘發的過敏性細胞死亡的調控基因并分析其功能，有助于揭示植物非寄主抗性的分子機制。植物病原菌可產生多種激發子，按其化學性質分為蛋白、寡糖及多肽等[12]。 這些激發子均可誘導植物產生抗病性，如elicitin、harp in, INFU N印1 (necrosis andethylene-inducing peptide 1)、β -葡聚糖及其它的一些蛋白。此外，本實驗室還從稻瘟病菌中克隆到一種25kDa的^pl蛋白激發子Mg^pl (結果未發表)。植物細胞識別激發子后會引起Ca2+內流、一氧化氮(nitric oxide, NO)和活性氧(active oxyspecies species, AOS)產生；經過一系列的信號傳遞，誘發HCD和氣孔關閉。病毒誘導基因沉默技術(virus-induced gene silencing, VIGS)是一種快速、 高效分析基因功能的方法，為克隆激發子誘發的調控HCD的基因提供了捷徑。不少研究者采用該技術分析了本氏煙 Nicotiana benthamiana 的 SIPK、WIPK、EDSU NPRU Nbrboh, MAPKKKa、ARFl和WRKY等基因在植物抗病性中的作用[5’8’9’23_26]。本研究采用此技術， 利用PVX病毒表達載體構建了本氏煙的cDNA文庫，從全基因組范圍內克隆到受激發子 (fungalNepl)誘發的HCD的調控基因片段。研究結果可望對解釋植物的HCD及其對病原菌非寄主抗性的分子機制具有重要價值；為抗病育種提供新的抗病相關基因資源；同時將建立一個克隆受脅迫因子誘發的過敏性細胞死亡調控基因的技術平臺。VIGS為植物功能基因組研究提供了快速高通量的技術平臺，近來發展的流線型克隆及接種技術可以在1個月內完成從基因到表型的高通量篩選。本發明在國內外首次采用該技術從煙草全基因組內篩選受激發子^Pl誘導的HCD調控基因，共得到16個能改變激發子誘導的HCD表型的陽性克隆。
發明內容
本發明提供一種受激發子N印1誘導的過敏性細胞死亡的調控基因的篩選方法， 其特征在于包括以下步驟(1)以農桿菌為宿主，利用病毒表達載體構建單克隆的煙草cDNA文庫；(2)將上述單克隆的本氏煙cDNA文庫的培養菌液注射接種煙草的葉片；(3)然后將激發子^pl注射處理上述基因沉默的煙草；(4)篩選基因沉默后激發子誘導的過敏性細胞死亡表型發生改變的克隆。該方法還可進一步包括(5)對上述陽性克隆進行序列測定和分析。下面進一步優選的方面所述煙草是本氏煙。所述農桿菌是菌株Gv3101。所述病毒表達載體是PVX。第⑵步的接種采用牙簽刺傷法或注射接種法。進一步優選，接種是在2-3片真葉完全展開的本氏煙葉片上進行的。第(2)步的培養菌液通過下述方式培養獲得本氏煙cDNA文庫中的克隆在LB液體培養基中30°C培養2天后用IOmM的MgCl2溶液制成菌懸液，使菌體濃度達到IO5-IO7CFU/ ml ο本發明成功采用VIGS技術從煙草全基因組內篩選到受激發子N印1誘導的過敏性細胞死亡的調控基因(片段)，證明了利用此方法篩選植物抗性基因的可行性。這為下一步對篩選感興趣的基因進行研究找下了基礎，具有有益的技術效果。
圖1克隆的插入片段驗證其中，M，分子量標記(DL2000) ；+，PVX載體PCR產物；_，水對照；1 20 隨機選擇的20個克隆PCR電泳結果。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。1材料和方法1. 1 材料1. 1. 1植物材料、激發子的制備及激發子處理植物參照Li等人的方法在溫室(16h光照、25 V ；8小時黑暗、20 °C )中種植 N. benthamiana植株；參照Gan等人采用原核表達外源基因的方法準備^pl激發子，其中 N印1 來自 Magnaporthe oryzae,由 η印 1 (GenBank Accession No. XM_362983)基因編碼。激發子儲藏濃度為500nM。參照Zhang等人方法利用原核表達產物注射處理煙草葉片，注射量約為25 μ 1。1.2供試菌株及本氏煙RNA的提取
本研究所用農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株Gv3101、大腸桿菌 (Eschrichiacoli)菌株JM109可商業購買。供試煙草經3種激發子分別注射處理lh、3h、 6h和12h后，剪取處理的葉片混合后采用TRIzol試劑盒(Invitrogen，Carlsbad, CA, USA) 提取總RNA。1.3cDNA文庫的構建cDNA合成參照 BD 公司 SMART cDNA Librarty Construction Kit 試劑盒說明書進行合成后的cDNA反向插入到病毒表達載體PVX中，轉化農桿菌，挑取單克隆甘油菌保存，構建本氏煙的cDNA文庫。1.4PCR驗證陽性克隆根據PVX Vector SfΠ酶切后兩端序列設計引物，以長出的轉化子為模板進行菌落PCR擴增(上游引物LBa :5 ‘ -CAATCACAGTGTTGGCTTGC-3 ‘下游引物LBb 5' -GACCCTATGGGCTGTGTTG-3 ‘)。程序為95 °C 預變性 5min ;95 °C，30s，58 °C 退火 30s， 72°C延伸90s，35個循環；72°C延伸IOmin01. 5陽性克隆的功能篩選將構建好的本氏煙cDNA文庫中的克隆分別在LB液體培養基中30°C培養2d后用 IOmM的MgCl2溶液制成菌懸液，使菌體濃度達到105-107CFU/ml，用菌液分別注射接種2_3 片真葉完全展開的N. benthamiana葉片，或采用滅菌的牙簽挑取農桿菌直接接種本氏煙的方法操作，隨農桿菌接種病毒載體進入煙草體內使目的基因沉默，處理3周后，再將激發子 N印1注射處理上述基因沉默的煙草，篩選基因沉默后激發子誘導的HCD表型發生改變的克隆。1. 6陽性克隆的測序和序列分析選取能使激發子誘導的HCD表型發生改變的陽性克隆送金斯瑞生物科技(南京)有限公司測序。測序 cDNA 序列在 DFCI (http://compbio. dfci. harvard, edu)、 GenBank(http//www. ncbi. nlm. nih. gov/Genbank)等公共數據庫中進行比對分析，將比對的期望值(e值，expect value)小于0.001 (即le_3)的結果示為有效結果，其基因注釋可用于參加比對的目的基因的注釋。2結果與分析2. IcDNA表達文庫的構建從經3種激發子處理過的本氏煙中提取RNA，根據BD公司的SMART cDNA LibrartyConstruction Kit提供的方案合成雙鏈cDNA，將本氏煙cDNA與PVX病毒表達載體分別用SfiI酶切后反向連接轉化農桿菌Gv3101，構建cDNA表達文庫，共得到7000個克隆。為了鑒定所構建文庫的質量，隨機選取20個克隆利用LBa和LBb引物進行PCR，結果顯示20個克隆全都含有插入片段，大小在IOObp到1500bp之間不等，平均值在500bp左右， 陽性率為100% (圖1)，可用于后續基因功能篩選。2. 2過敏性細胞死亡調控基因陽性克隆的篩選將已轉化農桿菌得到的含有7000個單克隆的本氏煙cDNA，用滅菌的牙簽分別挑取直接接種本氏煙葉片，每一個克隆對應于2-3株本氏煙，接種煙草時只點破葉片上表皮， 而不破壞下表皮，讓其隨農桿菌接種病毒載體進入煙草體內使目的基因沉默。處理3周后， 將激發子N印1注射處理上述基因沉默的煙草，篩選基因沉默后激發子誘發的過敏性細胞死亡表型發生改變的克隆。如能抑制(減緩或加快)激發子誘導的HCD，即為陽性克隆。從 6000個克隆中共篩選到16個受激發子誘導的調控過敏性細胞死亡的克隆。進一步從文庫中挑取這些陽性克隆參照Wang等人的方法分別在LB液體培養基中30°C培養2d后用IOmM 的MgCl2溶液制成菌懸液，使菌體濃度達到105-107CFU/ml，用菌液分別注射接種2_3片真葉完全展開的N. benthamiana葉片，3周后，再用同種激發子注射處理已發生基因沉默的煙草植株，結果顯示，所有克隆基因沉默后均能抑制或減緩激發子誘導的HCD。2. 3序列比對及生物信息學分析對篩選到的16個陽性克隆進行序列測定和分析，共獲得16個不同克隆(片段)， 即共有16個克隆調控^pl誘導的HCD。進一步將這16個序列在DFCI、NCBI等公共數據庫中進行比對。其中，篩選到的一個序列屬于ALY與Solanum tuberosum ALY2聚為一組， 同源性最高，其序列如(GenBank Accession No. AM167906)。本發明成功采用VIGS技術從煙草全基因組內篩選到了 16個受激發子^pl誘導的過敏性細胞死亡的調控基因(片段)，證明了利用此方法篩選植物抗性基因的可行性。這為下一步對篩選感興趣的基因進行研究找下了基礎。因此，本發明的方法能夠有效的克隆到受激發子N印1誘導的過敏性細胞死亡的調控基因。
權利要求
1.一種受激發子N印1誘導的過敏性細胞死亡的調控基因的篩選方法，其特征在于包括以下步驟(1)以農桿菌為宿主，利用病毒表達載體構建單克隆的本氏煙CDNA文庫；(2)將上述單克隆的本氏煙cDNA文庫的培養菌液注射接種本氏煙的葉片；(3)然后將激發子N印1注射處理上述基因沉默的煙草；(4)篩選基因沉默后激發子誘導的過敏性細胞死亡表型發生改變的克隆。
2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于進一步包括(5)對上述陽性克隆進行序列測定和分析。
3.根據權利要求1或者2所述的篩選方法，其特征在于所述農桿菌是菌株Gv3101。
4.根據權利要求1或者2所述的篩選方法，其特征在于所述病毒表達載體是PVX。
5.根據權利要求1或者2所述的篩選方法，其特征在于第(2)步的接種采用牙簽刺傷法或注射接種法。
6.根據權利要求1或者2所述的篩選方法，其特征在于第(2)步的培養菌液通過下述方式培養獲得本氏煙cDNA文庫中的克隆在LB液體培養基中30°C培養2天后用IOmM的 MgCl2溶液制成菌懸液，使菌體濃度達到105-107CFU/ml。
7.根據權利要求1或者2所述的篩選方法，其特征在于第(2)步的接種是在2-3片真葉完全展開的本氏煙葉片上進行的。
全文摘要
采用病毒誘導基因沉默技術從以PVX病毒載體建立的本氏煙(Nicotiana benthamiana)cDNA文庫中篩選受激發子Nep1誘導的過敏性細胞死亡的調控基因的方法，其中以農桿菌Gv3101為宿主、利用PVX病毒表達載體構建單克隆的本氏煙cDNA文庫，采用牙簽刺傷法或注射接種法接種本氏煙，從上述單克隆文庫中篩選能使激發子誘發的過敏性細胞死亡表型發生改變的陽性克隆，然后對上述陽性克隆進行序列測定和分析。
文檔編號C12N15/10GK102296060SQ20101021077
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者張正光, 王源超, 鄭小波 申請人:南京農業大學