專利名稱：一種光學活性叔亮氨酸的拆分新方法
技術領域：
本發明涉及一種光學活性叔亮氨酸拆分的新方法。
背景技術：
叔亮氨酸是一種非蛋白原的手性氨基酸，叔丁基在空間上接近氨基和羧基，結構 獨特導致性質獨特，含有S-叔亮氨酸的肽鍵在生物體內會緩慢水解，這樣就增加了相關化 合物酶降解的穩定性，因而在研發治療癌癥和艾滋病的藥物中有著非常多的應用。由于叔 丁基的空間位阻大，叔亮氨酸的衍生物在不對稱合成中作為誘導不對稱的模板，在金屬不 對稱催化反應中，S-叔亮氨酸也是許多重要配體的起始原料。光學純叔亮氨酸主要有化學和生物的兩種合成方法。化學法主要為拆分和不對稱 合成，生物法主要為酶拆分和酶催化的方法(氨基酸與生物資源，2003，25 (4) :14-19)。現有的叔亮氨酸的化學拆分法中常用10-樟腦磺酸(Tetrahedron Lett.，1996， 27 :5865-5868)、α-苯乙胺(JP 05271169,1994)等作為拆分試劑得到(R)和(S)-叔亮氨 酸，但是收率一般為20%左右，e. e.值為95%左右。也可從消旋1_(2_呋喃基)_2，2_ 二 甲基丙胺出發(Tetrahedron Lett.，1997，38 :2153_2154)，先拆分成單一對映體，再各自經 過氧化得到R和S-叔亮氨酸。因此，通過生成消旋化合物，再使用手性拆分劑拆分，雖然可 以得到較高的e.e.值，但總收率較低。而化學不對稱合成和生物酶催化合成法都只能得到一種構型的光學純S-叔亮氨 酸，且化學不對稱合成法往往貴重的，甚至劇毒的化學試劑參與到其中，反應條件苛刻，操 作要求高，污染很大，難以實現產業化。生物酶水解法可選擇性地水解外消旋叔亮氨酸的酯或酰氨。在丁醇的存在下， 脂肪酶(Lipase)選擇性催化水解4_叔丁基_2_苯基吖內酯，生成的酯，先用蛋白酶 (Alcalase)水解，以防逆反應發生，再用酸水解斷鍵，得到(S)-叔亮氨酸，收率為69 %， e.e.值為 97% (Org. Lett. ,2001,3(6) :869 872)。德國 Degussa 公司利用(S)-乙內酰 脲酶(Hydantionase)對映選擇性地解開(RS) _5_叔丁基乙內酰脲的乙內酰脲環，然后加 HNO2脫氨基甲酰，得(S)-叔亮氨酸，收率為86%，ee值可達到99. 5% (Tetrahedron Lett.， 1995,7:1113-1116)。用固定化米曲霉氨基酰化酶選擇性水解S-苯乙酰基叔亮氨酸生成 S-叔亮氨酸，收率為 96%, ee 值可達到 99% (CN200610020854. 1,2006)。
發明內容
本發明的目的在于提供一種通過生物酶從叔亮氨酸的消旋體拆分制備光學純叔 亮氨酸，即S-叔亮氨酸和R-叔亮氨酸的新方法。本發明方法操作簡便，成本低，有工業化前景。本發明的方法由以下步驟組成(I)R, S-叔亮氨酸與乙酸酐反應，生成R，S-乙酰基叔亮氨酸；(2)利用固定在合成樹脂0730上的分枝桿菌(Mycobacterium sp. JX009)選擇性水解S-乙酰基叔亮氨酸，生成S-叔亮氨酸，反應溫度10-40°c，時間3-60h ；(3)過濾分離出固定化的分枝桿菌(Mycobacterium sp. JX009)，反復使用；(4)加入有機溶劑使未反應的R-乙酰基叔亮氨酸分相分離；(5)水相中S-叔亮氨酸經濃縮，結晶；(6)油相中R-乙酰基叔亮氨酸加酸水解，得R-叔亮氨酸。所述步驟(1)中的乙酰化反應可采用現有技術，參考Laumen等人的文獻(Biotechnol Biochem, 2001,65 (9) 1977-1980)，在R，S-叔亮氨酸的堿性水溶液中加入乙 酸酐反應，反應完畢后用HCl酸化結晶得到R，S-乙酰基叔亮氨酸。所述步驟⑵中的選擇性水解是采用固定在合成樹脂0730上的分枝桿菌 (Mycobacterium sp. JX009)全細胞催化催化水解。
具體實施例方式以下實施例是對本發明的進一步說明，不是對本發明的限制。實施例1將52. 61g R，S-叔亮氨酸和25g氫氧化鈉加入400mL蒸餾水中，攪拌20min。在 IOmin內攪拌下加入40g乙酸酐，Ih后再加入40g過量的乙酸酐，繼續攪拌2h。加濃HCl中 和至pH = 2，混合物在4°C下放置過夜后過濾，用水洗滌并真空干燥得R，S-乙酰基叔亮氨 酸無色晶體66. 21 g，收率95. 2%。實施例2固定化分枝桿菌(Mycobacterium sp. JX009)，固定化條件為固定液中含葡萄糖 2g/L、酵母液l%，50mg分枝桿菌用2g合成樹脂0730和50mL固定液；固定時間2h。固定 化后，酶活性2650U/L，酶保留活性保留90%。實施例3于IOOOmL燒瓶中加入實施例1的R，S-乙酰基叔亮氨酸43g (250mmol)和水600mL， 固定化固定化分枝桿菌3 10g，選擇性水解，生成S-叔亮氨酸，反應溫度30°C，反應時間 5h。過濾分離固定化酶，用乙酸乙酯3 X 150mL萃取未反應的R-乙酰基叔亮氨酸，水相經濃 縮，結晶，得S-叔亮氨酸15g，收率91. 5 %，光學純度99. l%ee0有機相用無水硫酸鈉干燥， 減壓濃縮后得R-乙酰基叔亮氨酸，光學純度98% ee。實施例4將實施例3中的98% ee的R-乙酰基叔亮氨酸21. 5g(124. 3mmol)、250mL 6mol/ LHC1，加熱回流5h，冷卻，用5mol/LNa0H中和，經濃縮，結晶，得R-叔亮氨酸14. Sg,收率 90. 9%，光學純度 99. 0% ee。
權利要求
本發明的方法由以下步驟組成(1)R，S-叔亮氨酸與乙酸酐反應，生成R，S-乙酰基叔亮氨酸；(2)利用固定在合成樹脂0730上的分枝桿菌(Mycobacterium sp.JX009)全細胞催化選擇性水解S-乙酰基叔亮氨酸，生成S-叔亮氨酸，反應溫度10-40℃，時間3-60h；(3)過濾分離出固定化的分枝桿菌(Mycobacterium sp.JX009)，反復使用；(4)加入有機溶劑使未反應的R-乙酰基叔亮氨酸分相分離；(5)水相中S-叔亮氨酸經濃縮，結晶；(6)油相中R-乙酰基叔亮氨酸加酸水解，得R-叔亮氨酸。
2.根據權利要求1的一種光學活性叔亮氨酸拆分的新方法，其特征是所述的步驟(2) 是利用固定在合成樹脂0730上的分枝桿菌(Mycobacterium sp. JX009)全細胞催化選擇性 水解S-乙酰基叔亮氨酸，生成S-叔亮氨酸。
全文摘要
本發明涉及一種光學活性叔亮氨酸的拆分新方法，其特征是將RS-叔亮氨酸與乙酸酐反應在，生成RS-乙酰基叔亮氨酸，利用固定在合成樹脂0730上的分枝桿菌JX009(Mycobacterium sp.JX009)全細胞催化選擇性水解S-乙酰基叔亮氨酸，生成S-叔亮氨酸；加入有機溶劑分相分離，水相中S-叔亮氨酸經濃縮結晶，油相中R-乙酰基叔亮氨酸中加入酸水解，得R-叔亮氨酸。本發明方法操作簡便，成本低，有工業化前景。
文檔編號C12P41/00GK101886110SQ201010210770
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月28日 優先權日2010年6月28日
發明者張 杰, 金建忠 申請人:浙江樹人大學