一種從血塊中快速提取基因組dna的方法

專利名稱：一種從血塊中快速提取基因組dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種從血塊中快速提取基因組DNA的方法。
背景技術：
人類疾病診斷及遺傳學分析研究中能否獲得高質量基因組DNA非常重要。在檢驗 科室中人基因組DNA—般是從抗凝血中提取的，而血清學檢測后遺留的大量血塊卻沒有被 利用。從抗凝血中提取DNA的主要的原因如下目前從抗凝血中提取DNA的技術非常成 熟；抗凝血不需要前期處理，并可以在1小時內完成提取。相應的，從血塊中提取DNA存在如下問題方法繁瑣、費時且效率低；需要繁瑣的 前期處理(如用鑷子或手術刀攪碎血塊，不僅操作過程危險，還使操作人員直接接觸血塊； 用研磨器研磨血塊需要認真清洗研磨物品，很容易造成交叉污染；用蛋白酶K消化血塊一 般需要16小時以上)；從血塊中提取DNA需要使用酚和氯仿等有機溶劑，不僅降低提取效 率，還危害操作人員的健康。

發明內容
本發明的目的是提供一種從血塊中快速提取基因組DNA的方法。本發明提供的從血塊中提取基因組DNA的方法，包括如下步驟(1)將血塊在2-20牛頓壓力下進行過濾，過濾孔徑為40-130目，收集濾出液；(2)將濾出液與紅細胞裂解液混勻后靜置4-6分鐘，然后9，000-13, OOOg離心 0. 5-1. 5分鐘，取沉淀；(3)將沉淀與細胞裂解液混勻后63-67°C水浴8_12分鐘，然后9，000-13, OOOg離 心0. 5-1. 5分鐘，取上清；(4)將上清與異丙醇混勻后，用DNA結合柱進行純化，得到基因組DNA。所述步驟⑴可為將血塊在8-12牛頓壓力下進行第一次過濾，過濾孔徑為 40-60目，收集濾出液；然后將濾出液在8-12牛頓壓力下進行第二次過濾，過濾孔徑為 110-130目，收集濾出液。所述步驟(1)中，第一次過濾的過濾孔徑具體可為50目，第二次 過濾的過濾孔徑具體可為120目。所述步驟(2)中，具體可靜置5分鐘，然后10，OOOg離心1分鐘；所述步驟(3)中， 具體可65°C水浴10分鐘，然后10，OOOg離心1分鐘。所述步驟(4)具體可為將步驟(3)得到的上清與異丙醇混勻后轉移到DNA結合 柱，12，OOOg離心1分鐘，棄流出液；然后在DNA結合柱中加入75% (體積百分含量)乙醇 水溶液，12，OOOg離心1分鐘，棄流出液；然后在DNA結合柱中加入75% (體積百分含量) 乙醇水溶液，12000g離心1分鐘，棄流出液；然后將DNA結合柱12，OOOg離心2分鐘，棄流 出液；然后將DNA結合柱加入DNA溶解液，室溫放置2分鐘；然后將DNA結合柱12，OOOg離 心1分鐘，收集流出液即為含有基因組DNA的溶液。
所述血塊、所述紅細胞裂解液、所述細胞裂解液、所述異丙醇的配比具體可為2mL 血塊6mL紅細胞裂解液lmL細胞裂解液250 μ L異丙醇。所述步驟(2)和步驟(3)之間還可包括如下步驟將步驟(2)得到的沉淀與紅細 胞裂解液混勻后靜置4-6分鐘，然后9，000-13, OOOg離心0. 5-1. 5分鐘，取沉淀。所述步驟 (2)和步驟(3)之間優選包括如下步驟將步驟(2)得到的沉淀與紅細胞裂解液混勻后靜 置5分鐘，然后10，OOOg離心1分鐘，取沉淀，所述紅細胞裂解液的加入量與步驟(2)中紅 細胞裂解液的加入量相同。所述紅細胞裂解液可采用如下方法配制由NH4C1、KHCO3> Na2EDTA和水組成， pH7. 4 ；NH4Cl的濃度為155mM，KHCO3的濃度為10mM，Na2EDTA的濃度為0. ImM。紅細胞裂解 液為常規配方，采用市售紅細胞裂解液也可。所述細胞裂解液可采用如下方法配制由TriS-HCl、NaCl、Na2EDTA、SDS、蛋白酶K 和水組成，pH 8. 2 ；Tris-HCl的濃度為10mM，NaCl的濃度為400mM，Na2EDTA的濃度為2mM， SDS的濃度為(質量百分含量)，蛋白酶K的濃度為0. 5mg/mL。細胞裂解液為常規配方， 采用市售細胞裂解液也可。所述DNA溶解液具體可為pH7. 510mM的Tris-HCl水溶液(DNA溶解液為常規配方， 采用市售細胞裂解液也可)。所述DNA結合柱具體可為購自Generay公司，型號為GK0501的DNA結合柱。本發明還保護一種從血塊中獲得血液的方法，包括如下步驟將血塊在8-12牛頓 壓力下進行第一次過濾，過濾孔徑為40-60目，收集濾出液；然后將濾出液在8-12牛頓壓力 下進行第二次過濾，過濾孔徑為110-130目，收集濾出液(血液)。第一次過濾的過濾孔徑 具體可為50目，第二次過濾的過濾孔徑具體可為120目。本發明的方法與傳統方法相比具有以下優點(見表1)首先，DNA提取量和純度都 有顯著提高(P <0.05)；第二、大大簡化純化步驟，節省大量時間；第三、不使用任何有毒有 機溶劑，保證工作人員的健康安全；第四、均使用廉價一次性物品，在降低成本的同時，避免 潛在的交叉污染。表1本發明的方法與傳統方法的比較 本發明提供的從血塊中提取基因組DNA的方法通過微孔擠壓過濾，在一分鐘內有 效打散血塊，并在不使用酚或氯仿等有毒有機溶劑的情況下，通過DNA純化柱在一小時內 完成基因組DNA提取，具有快速、安全且高效的優點，適于推廣應用。


圖1為實施例1中部分DNA樣本的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果；M =DNA marker ； 1-4 依次為樣本1至4。圖2為實施例1中部分DNA樣本的PCR分析結果(TLR2基因，1. 3kb) ；M DNAmarker ； 1-4依次為樣本1至4。圖3為實施例1中部分DNA樣本的SNP分析結果。
圖4為實施例1中部分DNA樣本的酶切分析結果；M1，M2 =DNA marker ；1，3，5，7依 次為樣本1至4未酶切對照；2，4，6，8依次為樣本1至4EcoRI酶切過夜。圖5為實施例3中部分DNA樣本的瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果；M =DNA marker ；5-8 依次為樣本1至4。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。下述實施例中的％，如無特殊說明，均為質量百分含量。以 下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。 15份血塊樣本均來自于血清學檢測后遺留的血塊(每2mL血塊由4mL血液凝結而 成)，用于實施例1至實施例3的均為該15份血塊樣本。實施例1、采用本發明的方法從血塊中提取基因組DNA一、從血塊中提取基因組DNA(一 )血塊的快速打散1、將2mL血塊放入墊有無菌紗布(50目孔徑；40_60目孔徑均可，可以根據血塊的 情況選擇)的一次性5mL注射器中，用8-12牛頓(2_20牛頓的力均可，可以根據血塊的情 況選擇施加力的大小)的力輕輕擠壓。2、擠出來的血液樣品移至另一個墊有無菌紗布(120目孔徑；110-130目孔徑均 可，可以根據血塊的情況選擇)的一次性5mL注射器中，用8-12牛頓(2_20牛頓的力均可， 可以根據血塊的情況選擇施加力的大小)牛頓的力輕輕擠壓。3、收集流出血液至15mL離心管中。( 二 )提取血液DNA1、收集的血液中加入6mL紅細胞裂解液，渦旋震蕩混勻(約30秒)，室溫放置5分 鐘，然后10，OOOg離心1分鐘，取沉淀，棄去紅色上清。紅細胞裂解液由NH4Cl、KHC03、Na2EDTA 和水組成，pH 7. 4 ；NH4Cl的濃度為155mM，KHCO3的濃度為10mM，Na2EDTA的濃度為0. ImM。2、沉淀中加入6mL紅細胞裂解液，渦旋震蕩混勻(約30秒)，室溫放置5分鐘，然 后10，OOOg離心1分鐘，取沉淀。3、加入ImL細胞裂解液，渦旋震蕩(充分打散白細胞)，置于65°C水浴10分鐘(期間顛倒混勻2-3次)，然后10，OOOg離心1分鐘，取上清。細胞裂解液由Tris-HCl, NaCl, Na2EDTA, SDS、蛋白酶K和水組成，pH 8. 2 ；Tris-HCl的濃度為10mM，NaCl的濃度為400mM， Na2EDTA的濃度為2mM，SDS的濃度為(質量百分含量)，蛋白酶K的濃度為0. 5mg/mL。4、將上清轉移至新的1. 5mL離心管，并加入250 μ L異丙醇，渦旋震蕩混勻(約10 秒)，然后用DNA結合柱(購自Generay公司，型號為GK0501，最大結合量30yg DNA)進行 純化。純化步驟按照DNA結合柱的說明進行，具體如下(根據預期的DNA含量，采用三個 DNA結合柱進行純化，然后將純和得到的DNA混合)將所有溶液平均轉移到3個DNA結合 柱，12，OOOg離心1分鐘，棄流出液；每個柱子加入700 μ L 75% (體積百分含量)乙醇水溶 液，12，OOOg離心1分鐘，棄流出液；每個柱子加入500 μ L 75% (體積百分含量)乙醇水 溶液，12，OOOg離心1分鐘，棄流出液；12，OOOg離心2分鐘，棄去殘留乙醇；每個柱子加入 100 μ L DNA溶解液(pH7. 510mM的Tris-HCl水溶液)，室溫放置2分鐘；12，OOOg離心1分 鐘，收集流出液即為DNA樣本(含有基因組DNA的溶液)。DNA樣品保存于-20°C。 分別提取15份血塊樣品的基因組DNA。每份血塊樣本均在一小時內完成基因組 DNA的提取，得到15份DNA樣本。二、提取效果鑒定1、提取量鑒定提取量=DNA樣品中的DNA含量(μ g) +血塊生成所用的血液的體積(4mL)。15份樣本的平均DNA提取量為20. 1 士 4. 1 μ g/mL血液，平均OD值為1. 77 士 0. 11。2、瓊脂糖凝膠電泳鑒定將步驟一提取的15份DNA樣本分別進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳，均顯示一條尖銳 的高分子量條帶，表明純度高，質量好。部分樣本的電泳圖見圖1。3、PCR 分析針對TLR2基因中一段1. 3kb區域設計正向引物和反向引物如下正向引物5，-GTAGGTTGAAGCACTGGACAATG-3，反向引物5，-GACAAGTTTCAGGCATAGAATGAAAAC-3，。分別將步驟一提取的15份DNA樣本進行PCR分析以IOOng DNA為模板，利用正 引物和反向引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。PCR擴增步驟94°C 3分鐘，(94°C 30 秒，58 0C 30 秒，72 0C 90 秒)X 35 循環，72 °C 10 分鐘。將PCR擴增產物進行1. 2%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果表明，均能有效擴增得到目 的條帶，說明本方法提取的DNA適合于PCR分析。部分樣本的電泳圖見圖2。4、SNP 分析為了進一步驗證DNA質量，將步驟3的PCR擴增產物進行測序。15個DNA樣本中， 7個樣本的PCR產物的部分序列如序列表的序列1所示，6個樣本的PCR產物的部分序列如 序列表的序列2所示，2個樣本的PCR產物的部分序列如序列表的序列3所示。結果表明， 擴增的片段確實為目的片段(TLR2基因)，說明提取的DNA適合于測序。同時，測序結果中， 可以有效檢測TLR2基因中SNP位點，說明提取的DNA適合于SNP分析。部分樣本的部分區 域測序結果見圖3。
5、酶切分析將步驟一提取的15份DNA樣本分別進行酶切分析取2 μ g DNA，其中IygfflK 制性內切酶HindIII37°C酶切過夜，另外1 μ g作為對照不加任何酶37°C放置過夜；分別將 酶切后的樣本和對照樣本進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果表明，加入HindIII的基因組消化完全，而對照組DNA沒有降解，說明本 方法提取的DNA可用于酶切及Southern blot分析。部分樣本的電泳圖見圖4。實施例2、幾種打散血塊方法的比較一、采用本發明的方法打散血塊同實施例1的步驟一。可以有效打散血塊，得到均勻的血液。血液在室溫放置20分鐘依然穩定，不凝結。二、直接使用120目孔徑紗布過濾打散血塊將血塊直接使用120目孔徑紗布過濾。很難使血塊通過紗布，需要施加非常大的壓力，而且濾出的血液中含有小型血塊 顆粒，不利于后續提取。三、離心過濾打散血塊將血塊通過離心的方法濾過無菌紗布(120目孔徑)。在8，OOOg離心3分鐘，血塊可以完全濾過紗布，但離心結束時重新凝結在離心管 管底，嚴重影響后續提取。如果降低轉速，血塊無法有效濾過紗布。對比例、采用現有方法從血塊中提取基因組DNA一、從血塊中提取基因組DNA1、將2mL血塊放入組織研磨器(經過徹底清洗并滅菌處理)中，研磨至沒有明顯 的血塊組織。轉移研磨后的樣品至15mL離心管中。2、加入6mL紅細胞裂解液，渦旋震蕩混勻(約30秒)，室溫放置5分鐘，然后 10，OOOg離心1分鐘，取沉淀，棄去紅色上清。3、加入3mL細胞裂解液，渦旋震蕩混勻，置于65°C水浴過夜處理；然后冷卻至室 溫，加入等體積酚/氯仿溶液(酚氯仿=1 1 ；體積比)，渦旋震蕩(約30秒)，室溫靜 置5分鐘；12，OOOg離心10分鐘，將上清移至新的離心管。重復3-5次上述步驟，至蛋白不 再析出。4、加入等體積氯仿，渦旋震蕩(約30秒)，室溫靜置5分鐘；12，OOOg離心10分
鐘，將上清移至新的離心管。5、加入2倍體積無水乙醇，上下顛倒混勻，室溫放置10分鐘，沉淀DNA ；12, OOOg 離心10分鐘，棄上清；用75%乙醇清洗一次，8，OOOg離心5分鐘，棄上清，室溫晾干后用 300 μ L DNA溶解液溶解沉淀(DNA樣品)。DNA樣品保存于-20°C。分別提取15份血塊樣品的基因組DNA，得到15份DNA樣本。二、提取效果鑒定1、提取量鑒定15份樣本的平均DNA提取量為7. 53 士 2. 30 μ g/mL血液，平均OD值為1. 66 士 0. 13。2、瓊脂糖凝膠電泳鑒定
將步驟一提取的15份DNA樣本分別進行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳。電泳結果表明，對比例的提取效果顯著劣于實施例1的提取效果。部分樣本的電泳圖見圖5。
權利要求
從血塊中提取基因組DNA的方法，包括如下步驟(1)將血塊在2-20牛頓壓力下進行過濾，過濾孔徑為40-130目，收集濾出液；(2)將濾出液與紅細胞裂解液混勻后靜置4-6分鐘，然后9,000-13,000g離心0.5-1.5分鐘，取沉淀；(3)將沉淀與細胞裂解液混勻后63-67℃水浴8-12分鐘，然后9,000-13,000g離心0.5-1.5分鐘，取上清；(4)將上清與異丙醇混勻后，用DNA結合柱進行純化，得到基因組DNA。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟(1)為將血塊在8-12牛頓壓力 下進行第一次過濾，過濾孔徑為40-60目，收集濾出液；然后將濾出液在8-12牛頓壓力下進 行第二次過濾，過濾孔徑為110-130目，收集濾出液。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟(1)中，第一次過濾的過濾孔徑為 50目，第二次過濾的過濾孔徑為120目。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，靜置5分鐘， 然后10，OOOg離心1分鐘；所述步驟(3)中，65°C水浴10分鐘，然后10，OOOg離心1分鐘。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步驟⑷為將步驟(3)得 到的上清與異丙醇混勻后轉移到DNA結合柱，12，OOOg離心1分鐘，棄流出液；然后在DNA 結合柱中加入75% (體積百分含量)乙醇水溶液，12，OOOg離心1分鐘，棄流出液；然后在 DNA結合柱中加入75% (體積百分含量)乙醇水溶液，12000g離心1分鐘，棄流出液；然后 將DNA結合柱12，OOOg離心2分鐘，棄流出液；然后將DNA結合柱加入DNA溶解液，室溫放置 2分鐘；然后將DNA結合柱12，OOOg離心1分鐘，收集流出液即為含有基因組DNA的溶液。
6.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述血塊、所述紅細胞裂解 液、所述細胞裂解液、所述異丙醇的配比為2mL血塊6mL紅細胞裂解液ImL細胞裂解 液250 μ L異丙醇。
7.如權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述步驟(2)和步驟(3)之 間還包括如下步驟將步驟(2)得到的沉淀與紅細胞裂解液混勻后靜置4-6分鐘，然后 9，000-13, OOOg離心0. 5-1. 5分鐘，取沉淀；所述步驟(2)和步驟(3)之間優選包括如下步 驟將步驟(2)得到的沉淀與紅細胞裂解液混勻后靜置5分鐘，然后10，OOOg離心1分鐘， 取沉淀，所述紅細胞裂解液的加入量與步驟(2)中紅細胞裂解液的加入量相同。
8.如權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于所述紅細胞裂解液由NH4C1、 KHC03、Na2EDTA 和水組成，pH 7. 4 ；NH4Cl 的濃度為 155mM，KHCO3 的濃度為 10mM，Na2EDTA 的濃 度為0. ImM ；所述細胞裂解液由撲士8-!1(1、恥(1、妝占01六、505、蛋白酶1(和水組成，？!1 8. 2 ； Tris-HCl的濃度為10mM，NaCl的濃度為400mM，Na2EDTA的濃度為2mM，SDS的濃度為(質量百分含量)，蛋白酶K的濃度為0. 5mg/mL ；所述DNA溶解液為pH7. 510mM的Tris-HCl 水溶液。
9.一種從血塊中獲得血液的方法，包括如下步驟將血塊在8-12牛頓壓力下進行第一 次過濾，過濾孔徑為40-60目，收集濾出液；然后將濾出液在8-12牛頓壓力下進行第二次過 濾，過濾孔徑為110-130目，收集濾出液。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述第一次過濾的過濾孔徑為50目，所述 第二次過濾的過濾孔徑為120目。
全文摘要
本發明公開了一種從血塊中快速提取基因組DNA的方法。本發明的方法包括如下步驟(1)將血塊在2-20牛頓壓力下進行過濾，過濾孔徑為40-130目，收集濾出液；(2)將濾出液與紅細胞裂解液混勻后靜置4-6分鐘，9,000-13,000g離心0.5-1.5分鐘，取沉淀；(3)將沉淀與細胞裂解液混勻后63-67℃水浴8-12分鐘，9,000-13,000g離心0.5-1.5分鐘，取上清；(4)將上清與異丙醇混勻，用DNA結合柱進行純化，得到基因組DNA。本發明的方法具有以下優點DNA提取量和純度都顯著提高；純化步驟大大簡化，節省大量時間；不使用任何有毒溶劑，保證工作人員的健康安全；使用廉價一次性物品，在降低成本的同時，避免潛在的交叉污染。本發明適于推廣應用。
文檔編號C12N5/07GK101886071SQ20101021071
公開日2010年11月17日 申請日期2010年6月18日 優先權日2010年6月18日
發明者張旭霞, 李傳友, 李松, 車南穎 申請人:北京市結核病胸部腫瘤研究所