專利名稱：半乳糖的測定方法與半乳糖診斷/測定試劑盒的制作方法
半乳糖的測定方法與半乳糖診斷/測定試劑盒
技術領域：
本發明涉及醫學/食品檢驗測定技術領域，更具體地，本發明涉及半乳糖診斷/測定方法及其試劑盒。
背景技術：
牛奶在營養界素有“液體黃金”的美稱，我國早在1992年由七部位聯合提出“一杯牛奶強壯一個民族”的口號。奶類除不含纖維素外，幾乎含有人體所需要的各種營養素。牛奶中的乳糖進入人體后，經小腸乳糖酶作用分解成葡萄糖和半乳糖。半乳糖是嬰兒大腦發育的必需物質，與嬰兒大腦的迅速成長有密切關系。牛奶雖好但并不是所有的人都能享受，有些人由于乳糖酶的缺乏，人體不能很好的消化吸收牛奶中的營養素，還會造成鈣、磷、鉀、鐵等元素的吸收障礙，影響嬰幼兒的體格和智力發育，在老年人中，乳糖酶缺乏是造成骨質疏松的重要原因。中國成年人飲用牛乳后乳糖吸收不良的發病率高達86. 7%，不耐受指數為0. 9。為了避免不適當飲奶對健康造成的損害，因此最好在飲奶前檢查自己是否耐受乳糖，在飲用牛奶后，測試尿液中半乳糖的濃度，這是目前國外最常用的一種方法，更為簡便、 經濟、可靠。
發明內容[要解決的技術問題]本發明的目的是提供一種半乳糖的測定方法。本發明的另一個目的是提供一種半乳糖診斷/測定試劑盒。[技術方案]本發明是通過下述技術方案實現的。本發明的方法是一種采用酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)與酶 (偶)聯法(Couple Reaction)的聯用技術，利用測定還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處的吸光度變化測定半乳糖的方法。本發明半乳糖測定方法的的技術原理是根據下述半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、蘋果酸脫氫酶的系列催化反應完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸2腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酸+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氫化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)蘋果酸+輔酶本發明的方法利用半乳糖激酶(galactokinase ;EC 2.7.1.6)酶(偶)聯氨甲酉先石舞酸合成 BS (arbamoyl-phosphate synthase (glutamine-hydrolysing) ；EC6. 3. 5. 5)、 蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase ；EC 1. 1. 1. 38 ；EC 1. 1. 1. 39 ；EC 1. 1. 1. 40 ； ECl. 1. 1.83)酶促反應終點法。半乳糖激酶酶解半乳糖反應產生腺苷二磷酸，再通過(偶)聯合氨甲酰磷酸合成酶、蘋果酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰) 氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的程度，這樣可以通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算半乳糖的濃度大小。本發明是通過下述技術方案實現的。本發明涉及一種半乳糖的測定方法。該半乳糖測定方法的步驟如下A、樣品準備A. 1標準樣品的制備將一定量的半乳糖溶于水或緩沖液中，再將半乳糖濃度調整到100微摩爾/升，得到的溶液作為標準樣品；A. 2待測樣品預處理待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中；A. 3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升；B、試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、 蘋果酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、谷氨酸、氨甲酰磷酸與丙酮酸，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500mmol/L、0. 001-7mol/ L、0. 1-0. 35mmol/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1000-80000U/L、1-lOOmmol/L、、 l-100mmol/LU 一 1OOmmo1/L l-100mmol/L 與 l-lOOmmol/L ；C、待測樣品與在步驟B)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；D、在與步驟C)同樣的條件下測定步驟A)標準樣品的吸光度隨時間的變化；E、在與步驟C)同樣的條件下測定在步驟A)空白樣品的吸光度隨時間的變化；F、數據處理由步驟C-E)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到
半乳糖的含量
權利要求
1.一種利用酶比色法及酶聯法技術的半乳糖濃度測定方法，其測定的技術原理是根據下述半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、蘋果酸脫氫酶的系列催化反應完成半乳糖+腺苷三磷酸半乳糖激酶腺苷二磷酸+半乳糖1-磷酸 2腺苷二磷酸+磷酸根+谷氨酸+氨甲酰磷酸氨甲酰磷酸合成酶 2腺苷三磷酸+谷氨酰胺+ 二氧化碳+水二氧化碳+丙酮酸+還原型輔酶蘋果酸脫氫酶(脫羧化)蘋果酸+輔酶
2.一種半乳糖的測定方法，其特征在于該方法的步驟如下 2. 1樣品準備2. 1. 1標準樣品的制備將一定量的半乳糖溶于水或緩沖液中，再將其濃度調整到100微摩爾/升； 2. 1.2待測樣品預處理待測液體樣品直接測試，無須預處理；將一定量的待測固體樣品像制備標準樣品一樣溶于水或緩沖液中； 2. 1.3空白樣品所述的水或緩沖液作為空白樣品，其半乳糖濃度為0微摩爾/升； 2. 2試劑溶液的制備分別移取或稱取緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、蘋果酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、谷氨酸、氨甲酰磷酸與丙酮酸，然后將它們混合均勻，用水溶解得到所述的試劑溶液，它們的濃度分別是20-500_Ol/L、0. 001-7mol/L、0. 1-0. 35mmol/ L、1000-80000U/L、1000—80000U/L、1000—80000U/L、l—lOOmmol/L、l—lOOmmol/L、l—lOOmmol/L、 l-100mmol/L 與 l-100mmol/L ；2. 3待測樣品與在步驟2. 2)得到的試劑溶液按照體積比1/10至1/500進行混合，在溫度15-45°C下反應5-60分鐘，在主波長340nm與副波長405nm(如果受儀器限制，可以不設副波長)下進行測定，測定其吸光度隨時間的變化；2. 4在與步驟2. 3)同樣的條件下測定步驟2. 1. 1)標準樣品的吸光度隨時間的變化； 2. 5在與步驟2. 3)同樣的條件下測定在步驟2. 1. 3)使用的水或緩沖液作為空白溶液的吸光度隨時間的變化；2.6數據處理由步驟2. 3-2. 5)所述測定的主波長340nm的吸光度隨時間的變化，根據下式計算得到半乳糖的含量
3.根據權利要求1、2所述的測定方法，其特征在于使用全自動生化分析儀測定時，待測樣品、所述標準樣品與所述空白樣品由該分析儀在設定條件下自動取樣，然后在下述條件下進行測定測定方法為終點法，溫度37°C，反應時間10分鐘，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測半乳糖樣品與試劑的體積比例為1/10-1/500，反應方向為負反應，延遲時間1/0分鐘，檢測時間4/5分鐘。
4.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于，所述的穩定劑是一種或多種選自硫酸銨、氯化鈉、乙二醇、丙二醇、甘油或雙乙酸鈉、疊氮鈉等防腐劑的穩定劑；所述的緩沖液是一種或多種選自三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液、磷酸鹽緩沖液、咪唑-鹽酸緩沖液、磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、硼砂-鹽酸緩沖液、甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液、巴比妥鈉-鹽酸緩沖液、硼酸-硼砂緩沖液、二乙醇胺緩沖液或“PBS”緩沖液的緩沖液；所述的還原型輔酶是一種或多種選自NADPH、NADH或thio_NADH的還原型輔酶。
5.根據權利要求1、2或3所述的測定方法，其特征在于5. 1所述的試劑溶液配制成如下單劑試劑它是由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、谷氨酸、氨甲酰磷酸、丙酮酸、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶與蘋果酸脫氫酶組成的；5. 2所述的試劑溶液配制成如下雙劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、谷氨酸、 氨甲酰磷酸與丙酮酸組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩定劑、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶與蘋果酸脫氫酶組成的；其中還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、蘋果酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、谷氨酸、氨甲酰磷酸、丙酮酸在試劑1或試劑2中的位置是不限定的。5.3所述的試劑配制成如下三劑試劑試劑1，它是由所述的緩沖液、穩定劑、還原型輔酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、谷氨酸、 氨甲酰磷酸與丙酮酸組成的；試劑2，它是由所述的緩沖液、穩定劑、氨甲酰磷酸合成酶與蘋果酸脫氫酶組成的；試劑3，它是由所述的緩沖液、穩定劑與半乳糖激酶組成的；其中還原型輔酶、半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、蘋果酸脫氫酶、腺苷三磷酸、單價磷酸鹽、谷氨酸、氨甲酰磷酸、丙酮酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置是不限定的。
6.一種半乳糖診斷/測定試劑盒，其特征在于6. 1它由下述粉狀試劑組成，在使用時用水將它們溶解得到具有下述濃度范圍的可直接使用的液體試劑緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0.1-0. 35mmol/L半乳糖激酶1000-80000U/L氨甲酰磷酸合成酶1000-80000U/L蘋果酸脫氫酶1000-80000U/L腺苷三磷酸l-100mmol/L單價磷酸鹽l-100mmol/L谷氨酸氨甲酰磷酸丙酮酸(6. 2根據權利要求6. 組成如下的試劑1 緩沖液穩定劑還原型輔酶腺苷三磷酸單價磷酸鹽谷氨酸l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/Lo1所述的半乳糖診斷/測定試劑盒，其特征在于它有20-500mmol/L 0.001-7mol/L 0.1-0. 35mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L l-100mmol/L氨甲酰磷酸l-100mmol/L丙酮酸l-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L氨甲酰磷酸合成酶1000-80000U/L蘋果酸脫氫酶1000-80000U/L。(6. 3根據權利要求6.1所述的半乳糖診斷組成如下的試劑1 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0.001-7mol/L還原型輔酶0.1-0. 35mmol/L腺苷三磷酸l-100mmol/L單價磷酸鹽l-100mmol/L谷氨酸l-100mmol/L氨甲酰磷酸l-100mmol/L丙酮酸l-100mmol/L ；組成如下的試劑2 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0. 001-7mol/L氨甲酰磷酸合成酶1000-80000U/L蘋果酸脫氫酶1000-80000U/L ；組成如下的試劑3 緩沖液20-500mmol/L穩定劑0. 001-7mol/L半乳糖激酶1000-80000U/L。全文摘要
本發明涉及利用酶比色法及酶聯法技術的半乳糖含量的測定方法、試劑的組成及成分，其測定的技術原理是依據半乳糖激酶、氨甲酰磷酸合成酶、蘋果酸脫氫酶的系列催化反應完成，本發明還涉及一種半乳糖診斷/測定試劑盒。本發明的測定方法靈敏度高、誤差小，因此本發明的測定方法與試劑盒可以廣泛地應用于臨床醫學/食品檢驗。
文檔編號C12Q1/48GK102297950SQ20101021035
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月23日 優先權日2010年6月23日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司