專利名稱：小麥漸滲系抗非生物脅迫基因Tamyb31及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及抗非生物脅迫基因Tamyb31及其應用。
背景技術：
據有關部門預計，2010年世界人口將達到70億，2039年將超過100億。與此相 反，世界上可供耕種土地則以每年38610方哩的速度減少。鹽漬化是土地退化的一個重要 原因。據統計，中國約有10%的耕地存在不同程度的鹽漬化，其中大部分是由自然條件引發 的，如長時間風化的巖石中Na+、Mg2+等鹽離子的積累，降雨帶來的鹽分等。干旱也是土地退 化的重要因素。干旱、半干旱區占全球陸地面積的33%，而我國則更為嚴重，已占全國陸地 面積的38%，達5. 7億畝。除了傳統育種方法外，利用基因工程和細胞工程等新技術可以快速穩定地獲得具 有優良抗鹽/旱能力的作物新品種。利用轉基因技術將新的抗鹽/旱功能基因轉入到作物 中，以此高效開發抗逆轉基因作物新品種，用于在鹽漬/干旱地區種植是一項具有廣闊應 用前景的技術。其前提是，必須較系統地了解植物抗逆機制，分離高效的與抗逆旱相關的基 因。多年來，有關植物抗逆機制方面的研究已取得了較大的進展，克隆了分生物脅迫 相關基因，為進一步闡明植物抗逆的分子機制提供了理論線索和依據。一些實驗表明，將植 物本身以及其他生物中與抗旱相關的基因轉入植物中，其異源轉錄和翻譯產物可以使轉基 因植物的抗旱能力發生改變。用于轉化的功能基因包括兩類一類基因轉化后可以直接提 高植物的抗逆能力，這可以通過被轉基因的過量表達或誘導型表達提高植物的抗逆能力； 另一類是通過抑制或誘導型抑制植株本身的組成型表達提高植物的抗逆能力。MYB蛋白是一類非常重要的轉錄因子，參與植物對多種非生物脅迫的響應過程。近 年來已有試驗表明，擬南芥中的MYB基因可以提高擬南芥的抗逆能力，但有關小麥MYB基因 在植物抗旱過程中的作用尚未見報道。
發明內容
針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種抗逆基因——小麥漸滲系抗非生 物脅迫基因Tamyb31及其應用。本發明的技術方案在于從小麥體細胞雜種漸滲系山融3號中分離得到了小麥MYB 等位變異基因——Tamyb31，并構建雙子葉植物表達載體pSTART/Tamyb31轉化模式植物擬 南芥，以鑒定基因的功能并最終將該基因用于小麥等重要農作物的轉化，提高農作物的抗 逆性。本發明提供的小麥漸滲系抗逆基因名稱為小麥體細胞雜種漸滲系山融3號MYB基 因Tamyb31，所述基因cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。本發明還提供了含上述抗逆基因Tamybl的植物表達載體pCAMBIA3301/Tamyb31。
本發明所述基因Tamyb31及含所述基因Tamybl的植物表達載體 PCAMBIA3301 (pSTART) /Tamybl在培育抗逆植物中的應用。其中所述植物優選是普通小麥或 擬南芥。將本發明所述基因導入植物細胞，使其在植物中過量表達就可以使轉基因植物獲 得抗逆能力。為了便于對轉基因植物或細胞系進行篩選，可以對含有所述基因Tamyb31的 植物表達載體pSTART/Tamyb31進行加工，如可以加入選擇標記(⑶S等)或者具有抗性的 抗生素標記物(潮霉素，卡那霉素，慶大霉素等)等。 本發明所述的基因可廣泛用于培育抗逆農作物新品種，并可為深入闡明植物抗逆 機制提供理論依據。本發明的有益效果利用現有的植物基因工程技術，本發明首次克隆得到了小麥 漸滲系山融3號抗非生物脅迫新基因Tamyb31，并通過根瘤農桿菌介導的方法將該基因轉 入擬南芥，經過比較分析證明，轉基因植株的抗逆能力明顯增強。據此可通過過表達策略開 發和培育抗逆作物新品種。
圖lTamyb31基因全長cDNA序列的擴增結果其中Maker:DNA 分子量標準，λ DNA/EcoRI+HindIII (下同)。圖2Tamyb31在多種處理下山融3號中的半定量RT-PCR分析，不同發育時期 RT-PCR 分析。圖3Tamyb31轉基因擬南芥植株qPCR及southern鑒定。其中VC:空載體對照(下同)，3-21、4-21、6_10為1^11^31過表達系(下同)。圖4Tamyb31轉基因擬南芥植株在各種脅迫下種子的萌發率。圖5Tamyb31轉基因擬南芥植株在鹽/旱脅迫下表型。圖6Tamyb31轉基因擬南芥植株在LiCl/KCl/Mannitol脅迫下表型圖7Tamyb31轉基因擬南芥植株中脅迫標記基因的qPCR結果。圖8Tamyb31轉基因小麥植株及檢測。圖 9PCAMBIA33Ol-Ubi 載體圖。
具體實施例方式實施例1、Tamyb31的克隆1.1山融3號RNA提取(1)將PEG滲透脅迫處理的組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨 成粉末；(2)待液氮揮發干，立即轉移到2ml的離心管中，每IOOmg材料約加入Iml Trizol 提取液，劇烈振蕩使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；(3) 4"C，12000rpm 離心 15 分鐘；(4)用移液器小心將上層水相轉移至一個新的1. 5ml的離心管中，加入200 μ 1氯 仿(chloroform)，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘； 醇(1 1體積)，充分混勻，-20 0C，沉淀30min或過夜；
(5) 4°C，12000rpm 離心 15 分鐘；(6)用移液器小心將上層水相轉移至一個新的1. 5ml的離心管中，加入500 μ 1的 異丙醇(1 1體積)，充分混勻，-20°C，沉淀30min或過夜；(7) 40C，12000rpm 離心 lOmin，小心棄去上清液；
(8) RNA沉淀用Iml的75%乙醇洗滌。4°C，8000rpm離心IOmin收集沉淀；(9)重復用75 %乙醇洗滌一次RNA沉淀；(10)去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10_15分鐘，RNA略顯透明，加入適 當體積(30-50 μ 1)的RNase-free水充分溶解(可放于_80°C長期保存)；(11)紫外分光光度計及1 % Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量。注a)用紫外分光光度計檢測RNA的產量，在260nm處的吸光度，IOD = 40ug/ ml。根據在260nm和280nm處的吸光值，檢測RNA的純度，純RNA的0D26(1/0D28(1比值應接近 2. O (比值最好在1. 9 2. 1之間)。b)用1 % Agrose凝膠電泳檢側RNA的質量及大小。吸取Iul RNA力卩入3 μ 1的 RNase-free水，力卩1 μ 1上樣緩沖液65°C變性5分鐘。電泳后用EB染色，另取3μ 1的 IkbDNAMarker 作為對照。1.2cDNA 3'和5'末端第一鏈的快速擴增5，和 3，RACE 第一鏈 cDNA 末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNAEnds, RACE)按 Clonetech 公司的 SMART RACE cDNA Amplification Kit 操作指南進行。1.3 Tamyb315'和3’端克隆(1)根據基因芯片的檢測結果，獲得Tamybl的部分序列并按照SMART RACE cDNAAmplification Kit操作指南設計兩對基因特異引物(序列如下)Tamyb31-NT3 5‘ GAACCTCCACTGAGAAACATTACC3‘Tamyb31-NT7 5 ‘ GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC3 ‘弓丨物序列Tamyb31-As 5' GATCAAGAACGTCTGGCACA 3，Tamyb31-S :5，GAGGCCATCGAGTAGTCAGC 3，；(2)按照 SMART RACE cDNAAmplification Kit 操作指南分別擴增 Tamyb31 的 5， 和3’末端；(3)將5’和3’端序列拼接，分別在起始密碼上游和終止密碼下游設計引物(序列 如下)，以5’或3’ RACE產物為模板擴增該基因全長。引物 1 :ATGGTGAGGGCTCCTTGCTGC
引物 2 TTAAATCTGTGACAAACTCTGCA1. 4Tamybl 全長克隆1.引物序列見1.3部分。2. PCR 反應體系(20 μ L)IOXbuffer2μ 1模板(5，RACE產物)1 μ 1dNTPs (2. OmM each)0. 5 μ 1Primerl (5 μ Μ)1 μ 1Primer2 (5 μ Μ)1 μ 1
高保真Taq 酶(STRATAGEN，Cat No 600380) 0. 5 μ 1ddH2014 μ 13. PCR 反應程序為94°C預變性 5min ；94°C變性 45sec，57. 5°C復性 45sec，72°C延 伸45sec，循環35次；72°C延伸7min。4.擴增片段的回收后與T載體連接、轉化大腸桿菌、選取陽性克隆測序。結果見圖
Io實施例2、Tamyb31的表達分析2. 1脅迫下RNA的提取山融3號種子正常萌發，Hoagland培養液培養至株高約IOcm時(約3周時間) 開始進行干旱控水、鹽脅迫(200mM NaCl)、ABA、GA、ACC, JA和SA處理。處理不同時間后， Trizol法提取幼苗根、葉RNA同上。2. 2逆轉錄獲得cDNA逆轉錄產生cDNA，按說明書操作。2.3PCR反應及電泳(1)以cDNA為模板，進行PCR反應。引物如下5'端引物GATCAAGAACGTCTGGCACA3'端引物GAGGCCATCGAGTAGTCAGC(2) PCR 體系ddH2012. 6μ 1IOXTaq buff err (Mg2+free)2μ 1MgCl2(25mM)1. 2μ 1Primerl (5 μ Μ)1 μ 1Primer2 (5 μ Μ)1 μ 1dNTP (2mM each)1 μ 1Taq polymerase (5U/ μ 1)0. 2 μ 1模板(逆轉錄cDNA)1μ 1ToTal Volume20 μ 1(3) PCR 程序95°C 3min，25 30cycles 95°C 30s,60°C 30s, 72°C 60s ；72°C 5min。根據內參Actin的擴增情況確定PCR的循環數，調整cDNA模板的加入量。(4) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果見圖2。實施例3、植物表達載體的構建(35S啟動子)植物表達載體pStart是含有35S啟動子和NPT II基因的雙元載體，在其多克隆位點上含有限制性內切酶BamHI和SmaI的識別位點。據此在目的基因起始密碼上游和終 止密碼下游設計含BamHI和SmaI識別序列的引物，用高保真Taq酶擴增目的基因，體系同 1. 4。用限制性內切酶BamHI和SmaI對載體pStart和目的基因擴增產物片斷分別進行 酶切。完全酶切的載體在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳分離后，經膠回收，然后與酶切的目的基 因擴增片段相連。
酶切體系，(1)質粒BamHI單酶切IOXBuffer1 μ 1質粒1 2 μ 1BamHI1 μ 1SmaI1 μ 1加ddH20至總體積20 μ 1 于37°C恒溫水浴鍋酶切2小時以上。酶切后以0. 5XTBE為電泳緩沖液，將酶切產 物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳。在紫外透射儀下用潔凈刀片切下pStart大片段和目的基因 條帶，回收。(2)回收的載體大片段的脫磷。(3)經酶切的載體片段和目的基因片段以摩爾比1 4的比例進行16°C連接過 夜。(4)連接產物熱激法轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，轉化菌在含Kan 50 μ g/ml的 LB固體平板上37°C培養16小時左右。(5)重組子的鑒定①載體特異引物的合成為了鑒定目的基因的插入方向，根據35S啟動子序列設計一個載體特異引物，序 列如下:GTT GGG GTT TCTACA GGA CGT②重組質粒的PCR驗證挑取在kan培養基上的抗性單菌落分別接種于5ml含Kan的LB液體培養基中 37°C振蕩培養過夜，堿變性法提取質粒，用載體特異引物和基因的下游引物進行PCR擴增， 體系同2. 3。PCR反應條件如下預變性940C 3min，35個循環為-MV 30sec，55°C 30sec, 72°C lmin，最后，72°C延伸lOmin。PCR產物用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。③質粒酶切鑒定提質粒進行BamHI和SmaI酶切，酶切體系同上。0. 8%瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否 含有預期分子量大小的片段，驗證載體的正確構建。實施例4、農桿菌感受態的制備與轉化4. 1農桿菌AGL1/EHA105感受態的制備(1)從YEP平板(含50 μ g/ml利福平)上挑取根癌農桿菌單菌落，接種于含 50 μ g/ml利福平的YEP液體培養基中，200rpm/min，28 °C培養過夜。(2)取2ml過夜培養液接種于50ml含相同抗生素的YEP液體培養基中在相同條件 下培養至OD6c 達0.5。(3)菌液冰浴 30min，4°C，5000rpm 離心 lOmin，收集菌體。(4)將菌體重懸于冰浴的IOml 0. 15mol/L的NaCl中，離心收集菌體。(5)再懸浮于Iml 20mmol/L冰預冷的CaC12溶液中，以200 μ 1/管將菌液分裝在 1. 5mlEppendorf管中，置液氮中速凍lmin，_70°C保存備用。4. 2凍融法轉化根癌農桿菌AGL1/EHA105(1)在室溫下融化兩管農桿菌感受態細胞，分別加入Iyg表達載體質粒DNA和1 μ g空載體，混勻后冰浴30min。(2)置液氮速凍Imin，迅速移至37°C溫浴3min。(3)加入無抗生素的YEP 800 μ 1，28°C震蕩培養3hr。(4) 7000rpm離心30s收集菌體，涂于含50 μ g/ml利福平、50 μ g/ml Kan的YEP平 板上，28°C倒置暗培養2-3天。4. 3菌體PCR鑒定菌體PCR方法及程序同上。 實施例5、擬南芥轉化及篩選5.1擬南芥種植取擬南芥(哥倫比亞野生型)種子，置于墊有濾紙的平皿內，用少量蒸餾水潤濕濾 紙，于4°C冰箱進行春化處理，3-5天后播種于育苗盤內，放置于人工氣候箱內(16h光照， 220C /8h黑暗，18°C )，生長6-8周后，待抽苔開花時用于轉化。5. 2擬南芥轉化(1)轉化前一天，取2ml活化的農桿菌AGL 1加到含相應抗生素的200ml YEP培養 基中，過夜培養至OD6tltl = 1.0-1.2。(2)離心收集菌體，并重懸于浸染液(5%蔗糖，0.04% Silwet L-77)中，使OD6tltl = 0. g。(3)將花序浸入浸染液30秒，其間前后擺動花序，使花序上形成一層膜。(4)用保鮮膜覆蓋花序，暗培養一天后揭去保鮮膜，繼續置人工氣候箱使其生長。(5)隔5-7天再用相同的方法浸染一次。(6)大約一個月后收獲種子。(7)空載體的轉化同上5. 3擬南芥轉化陽性株系篩選(1)收獲的TO代種子消毒后(75%乙醇5min，清潔劑洗滌10-15min，無菌水沖洗 3-5次)，鋪于含50 μ g/mL Kan的MS篩選培養基上。(2)4°C春化48h，移到培養室(16h光照/8h黑暗，22°C恒溫)生長7_10天。將抗 性綠色小苗移到土中繼續生長。(3)等植物絕大多數花苞已經結莢時，用小繩將植物單株綁起，以便單株收獲Tl 代種子。(4)重復步驟(1)_(3)，將單株收獲的Tl代種子繼續在含卡那的MS培養基上進行 篩選，挑選抗性比為3 1的單插入獨立株系移栽，并單株收獲種子得到T2，繼續重復步驟 (1)_(3)，直至T2代單株種子在卡那抗性培養基上不再分離，至此得到純合的T2代植株用 于后續的進一步研究。空載體純合體的篩選方法同上。(5)CTAB法提取野生型、空載體對照及不同轉基因株系的基因組DNA，提取相應材 料的總RNA并逆轉錄合成cDNA。(6)PCR擴增以上述不同材料的基因組DNA為模板，使用基因特異引物、空載體檢 測特異引物(35S啟動子序列)，PCR反應體系和反應條件如前。(7)qPCR及Southern驗證表明，Tamyb31在轉化植株中正常表達。結果見圖3。實施例6、轉Tamybl擬南芥脅迫抗性分析
6. 1萌發率測定將空載體對照、三個株系的轉Tamyb31擬南芥種子經消毒(方法同上)后，鋪入含 有NaCl,ABA的MS培養基中，25°C培養，觀察萌發情況，子葉完全張開為萌發，萌發率的=子 葉展開的種子數/用于萌發試驗的種子總數X 100%。結果見圖4。6. 2植株脅迫抗性分析(1)擬南芥種子消毒、萌發(方法同上)；(2)將萌發2天的幼苗轉移至含Mannitol、NaCl、KCl和LiCl的MS培養基中垂直 培養，觀察幼苗生長差異。結果見圖5、6。(3)將土培3周左右的轉基因植株及對照控水10天再澆水使其恢復生長3天，觀 察植株抗旱狀況。結果見圖5。6. 3轉Tamyb31擬南芥幼苗中抗旱相關Marker基因分析(1)擬南芥種子消毒、萌發、培養(方法同上)；(2)經旱、ABA處理后的對照及轉基因株系，提取植株總RNA，逆轉錄形成cDNA，進 行RT-PCR分析。方法同實施例2，結果見圖7。實施例7、轉Tamyb31小麥植株及檢測7. lTaMYB31-pCAMBIA3301 載體構建TaMYB31-0RF 用 TaMYB31-CDS-3301_S(Sacl)和 TaMYB31-CDS-3301_As(BamHl)擴 增后，連入pCAMBIA3301-ubi載體的Sacl和BamHl位點。轉化子通過測序鑒定。pCAMBIA3301_ubi 載體圖如圖 9。7. 2小麥轉化 將構建好的載體轉入農桿菌EHA105同實施例4。采用本實驗室建立的生長點轉化 小麥的專利方法轉化了小麥栽培品種濟麥21和濟南17。轉化幼苗在農桿侵染后壯苗恢復 生長1周，移栽至紙杯中，利用PCR鑒定陽性植株，結果見圖8。
權利要求
一種小麥漸滲系抗非生物脅迫基因Tamyb31，其特征在于所述基因cDNA的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一種含有權利要求1所述基因Tamyb31的植物表達載體pSTART/Tamyb31。
3.權利要求1所述基因Tamyb31在培育抗非生物脅迫植物中的應用。
4.權利要求2所述植物表達載體pSTART/Tamyb31在培育抗非生物脅迫植物中的應用。
5.如權利要求3或4所述的應用，其特征在于所述植物是普通小麥或擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種小麥漸滲系抗非生物脅迫(鹽、旱等)新基因Tamyb31及含有所述基因Tamyb31的植物表達載體pStart/Tamyb31；本發明還公開了所述基因Tamyb31及含有所述基因Tamyb31的植物表達載體在培育抗非生物脅迫(鹽、旱等)中的應用。實驗證明，本發明所述過表達轉基因植株的抗非生物脅迫(鹽、旱等)能力明顯提高。
文檔編號C12N15/29GK101864430SQ20101020779
公開日2010年10月20日 申請日期2010年6月24日 優先權日2010年6月24日
發明者呂建, 夏光敏 申請人:山東大學