專利名稱：一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法
一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法
技術領域：
本發明 涉及一種微生物發酵方法，尤其涉及一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方 法。
背景技術：
隨著抗生素在臨床上的廣泛應用，細菌耐藥性問題日趨嚴重，耐甲氧西林金黃色 葡萄球菌(MRSA)、耐萬古霉素腸球菌(VRE)、耐青霉素肺炎鏈球菌(raSP)、耐大環內酯革蘭 氏陽性菌和其他革蘭氏陽性致病菌感染一樣，正呈驚人的上升趨勢。以萬古霉素為代表的 糖肽類抗生素對幾乎所有的革蘭氏陽性(G+)細菌有抗菌作用，應用于嚴重的G+細菌及耐藥 菌的感染，萬古霉素是對付這類難治性疾病的最后防線。但是隨著20世紀80年代VRE的 出現，糖肽耐藥性腸球菌不斷增多。甚至出現了糖肽耐藥基因從腸球菌向其他細菌轉移的 現象，由于缺乏有效治療糖肽耐藥菌感染的藥物，糖肽耐藥性細菌的感染已成為威脅人類 生存和健康的一大難題。研制和開發對付這些耐藥菌的抗生素迫在眉睫，目前已有多種抗 生素已經開發或正在開發中，其中一種是美國Cubist制藥公司開發的環脂肽類藥物“達托 毒素”。達托霉素是從玫瑰孢鏈霉菌發酵液中提取得到的一個環脂肽類物質，它由連接到 一個環狀13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸酰基側鏈構成。達托霉素具有新穎的化學 結構，其作用模式獨特可擾亂細胞膜對氨基酸的轉運，從而阻礙細菌細胞壁肽聚糖的生物 合成，改變細胞質膜的性質；另外，它還能通過破壞細菌的細胞膜，使其內容物外泄而達到 殺滅細菌的目的。達托霉素(daptomycin)最早由禮來公司于二十世紀80年代發現，1997年Cubist 制藥公司受讓獲得全球范圍的開發權，2003年9月在美國首次上市用于治療由一些革蘭氏 陽性敏感菌株引起的并發性皮膚及皮膚結構感染，如膿腫、手術切口感染和皮膚潰瘍。2006 年美國食品藥品管理局(FDA)經優先審批程序批準了達托霉素的一項補充新藥申請，即1 日1次靜脈內給藥治療金黃色葡萄球菌血液感染，包括由對甲氧西林敏感和耐藥金黃色葡 萄球菌引起的右側心內膜炎。臨床研究證實達托霉素與苯唑西林、萘夫西林鈉法療效相當，即對臨床可評價患 者，達托霉素治療的臨床成功率為83. 4%，而對照藥物的相應值是84. 2%。且在臨床研究 中極少致使病原菌產生耐藥性。達托霉素可以通過玫瑰孢鏈霉菌NRRLl 1379 (ATCC31568)、NRRL15998及其它突變 菌株、基因重組菌生產。我所已于1999年篩選到達托霉素產生菌FW99608，并對FW99608的 發酵工藝條件進行了詳細的研究。已嘗試對該菌種進行紫外輻射、NTG誘變、離子束輻射等 選育工作。通過菌種誘變選育及發酵條件優化取得了較好的效果，其中突變株mutl208遺 傳性狀穩定、產量最高。美國專利US4331594和US4800157最先提到利用深層發酵法生產 達托霉素。美國專利US4885243提到通過將癸酸溶解于油酸甲酯然后添加到發酵液中生產 達托霉素的方法。由于癸酸對細胞具有毒性，而且其在常溫下是呈固體狀。所以必須通過溶劑溶解后再由補料的方式流加。一般采用油酸甲酯、乙醇等溶解癸酸，但是溶解在油酸甲 酯或乙醇中的癸酸仍然對細胞具有較大毒性，并且溫度低時容易結晶析出，影響流加效果。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，在拓 寬了發酵達托霉素路徑的同時，保證了流加的效果。本發明是通過以下幾種技術方案解決上述技術問題的技術方案之一一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，包括發酵培養，在發酵培養12 36h后，于 每升發酵液中以1. 0 3. 0ml//h的流速往發酵罐中補料流加5. 0%的癸酸鉀溶液，直至發 酵結束。技術方案之二一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，包括發酵培養，在發酵培養12 36h后，于 每升發酵液中以0. 5 1. 5ml//h的流速往發酵罐中補料流加10. 0 %的癸酸鈉溶液，直至發 酵結束。技術方案之三一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，包括發酵培養，在發酵培養12 36h后，于 每升發酵液中以1. 0 2. 0ml//h的流速往發酵罐中補料流加8. 0%的癸酸銨溶液，直至發 酵結束。本發明一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法的有益效果在于在拓寬了發酵達托 霉素路徑的同時，因幾種前體物不僅對細胞的毒性較小，且其在常溫下能夠以液體的形式 存在，不會因溫度低而易產生結晶，從而保證了流加的效果。
具體實施方式本發明通過玫瑰孢鏈霉菌的突變株mutl208發酵生產達托霉素，一般先將玫瑰孢 鏈霉菌mutl208制成15%得甘油菌懸液，并于-20°C下長期保藏以待生產所需。實施例1流加癸酸鉀作為前體物發酵達托霉素(1)搖瓶培養表1搖瓶培養基配方 于250ml三角瓶中盛裝按表1配方配制的培養基30ml，裝好后用蒸汽滅菌，冷卻至 30°C時往每瓶中接種0. 5ml孢子懸液，搖床轉速為220rpm，培養溫度30°C，培養時間24h。
(2)種子罐培養在IOL的種子罐中，按表2配方配制7L培養基，培養基滅菌后，待溫度降至30°C時 接入已搖好的搖瓶孢子懸液，接種量2%左右，培養溫度30 士 1°C，罐壓0. 03-0. 05MPa，空氣 流量1 :lVVm，攪拌轉速300 400rpm，并保證發酵過程高峰期溶氧不低于20%，培養時間 28 36h，發酵過程PH值通過流加氨水來控制，PH值控制在6. 5-7. 0之間。表2種子罐培養基配方 (3)發酵罐培養在100L發酵罐中，按表3配方配制70L培養基，培養基滅菌后，待溫度降至30°C， 且種子液菌容達到30%左右(即種子約生長36h)時，把種子罐中已培養好的種子移入 100L發酵罐中，移種量10 %左右，培養溫度30士 1 °C，罐壓0. 03-0. 05MPa,空氣流量1 Ivvm,攪拌轉速200 400rpm，在發酵過程可用濃氨水調節pH值，使其不低于6. 5，且保證 發酵高峰期溶氧不低于20%，在培養28h左右，開始在每升發酵液中以1. 0 3. 0ml//h的 流速往發酵罐中補料流加5. 0%的癸酸鉀溶液，直至發酵結束。一般在140h左右，總糖達到 0. 5以下，菌絲自溶，發酵液的pH值開始快速上升，此時發酵液中達托霉素效價達到1200U/ ml ο表3發酵罐培養基配方 為了簡化說明并便于比較本發明各實施例的相異處，在以下另外幾個實施例的說 明中，僅針對相異處進行說明，而不再對相同處作重復贅述。實施例2流加癸酸鈉作為前體物發酵達托霉素較之實施例1，本實施例的不同之處在于在發酵罐培養過程中，在培養28h左右， 開始在每升發酵液中以0. 5 1. 5ml//h的流速往發酵罐中補料流加10. 0 %的癸酸鈉溶液， 直至發酵結束，且一般在120h左右，總糖達到0. 5以下，菌絲自溶，發酵液的pH值開始快速 上升，此時發酵液中達托霉素效價達到1000U/ml。實施例3流加癸酸銨作為前體物發酵達托霉素較之實施例1，本實施例的不同之處在于在發酵罐培養過程中，在培養28h左右， 開始在每升發酵液中以1. 0 2. 0ml//h的流速往發酵罐中補料流加8. 0%的癸酸銨溶液， 直至發酵結束，且一般在160h左右，總糖達到0. 5以下，菌絲自溶，發酵液的pH值開始快速 上升，此時發酵液中達托霉素效價達到1700U/ml左右。另外，本發明不僅適用于小罐發酵達托霉素，而且還適用于大罐發酵達托霉素。綜上，本發明以5.0%的癸酸鉀溶液或10.0%的癸酸鈉溶液或8.0%的癸酸銨溶 液作為發酵達托霉素的前體物，拓寬了發酵達托霉素的路徑，且本發明中的幾種前體物不 僅對細胞的毒性較小，而且因其在常溫下能夠以液體的形式存在，不會因溫度低而易產生 結晶，從而保證了流加的效果。
權利要求
一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，包括發酵培養，其特征在于在發酵培養12～36h后，于每升發酵液中以1.0～3.0ml//h的流速往發酵罐中補料流加5.0％的癸酸鉀溶液，直至發酵結束。
2.一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，包括發酵培養，其特征在于在發酵培養 12 36h后，于每升發酵液中以0. 5 1. 5ml//h的流速往發酵罐中補料流加10. 0%的癸 酸鈉溶液，直至發酵結束。
3.一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，包括發酵培養，其特征在于在發酵培養 12 36h后，于每升發酵液中以1. 0 2. 0ml//h的流速往發酵罐中補料流加8. 0%的癸酸 銨溶液，直至發酵結束。
全文摘要
本發明涉及一種流加癸酸鹽發酵達托霉素的方法，在發酵罐培養過程中，通過流加5.0％的癸酸鉀溶液或10.0％的癸酸鈉溶液或8.0％的癸酸銨溶液補料生產達托霉素，即以這幾種癸酸鹽作為發酵達托霉素的前體物。本發明的優點在于本發明在拓寬了發酵達托霉素路徑的同時，因幾種前體物不僅對細胞的毒性較小，且其在常溫下能夠以液體的形式存在，不會因溫度低而易產生結晶，從而保證了流加的效果。
文檔編號C12P21/04GK101880703SQ20101020761
公開日2010年11月10日 申請日期2010年6月23日 優先權日2010年6月23日
發明者劉穎, 周劍, 張引, 林如, 江紅, 程元榮, 鄭衛, 高悟巖, 黃建峰 申請人:福建省微生物研究所