專利名稱：Ⅱ類豬白細胞表面抗原抑制豬的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種Ii類豬白細胞表面抗原抑制豬。
背景技術：
異種器官移植是將豬的組織器官移植到靈長類動物(猴或人體)，但由于豬的細胞表面存在很多異種抗原，我們必須利用基因敲除或轉基因去除豬的方法去除這些抗原并加入人的某些關鍵基因，豬的II型白細胞表面抗原(SLA-II)不僅是一個主要的異種抗原， 它也能直接激活靈長類受體的CD4細胞，從而引起一系列免疫反應。因此，去除SLA II型抗原能夠明顯降低供體豬的免疫原性。CIITA(MHC class II Transactivator，組織相容性II類抗原反式激活因子) 對MHC II類分子的表達起著嚴格且專一的調控作用。人CIITA含有1130個氨基酸 (GenbankNM_000246)。近年發現去除其氨基末端的部分氨基酸后，CIITA成為顯性負向突變體(Dominant-negative CIITA,DN-CIITA)[MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY,Aug. 1997， P4249-4258]，對正常的CIITA有著顯著的抑制作用，從而抑制下游的白細胞表面抗原II類分子的表達。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種II類豬白細胞表面抗原抑制豬，以顯著降低作為異種移植供體豬的免疫原性。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下II類豬白細胞表面抗原抑制豬，該豬的II類豬白細胞表面抗原SLA被抑制。上述II類豬白細胞表面抗原抑制豬的構建方法，該方法包括如下步驟(1)構建DN-CIITA表達載體構建DN-CIITA表達載體的方法為提取人淋巴細胞或豬淋巴細胞的RNA，經反轉錄合成cDNA，DN-CIITA的cDNA缺失前335個氨基酸編碼順序，DN-CIITA cDNA然后插入帶有Tie-2增強子、CMV增強子和beta-肌動蛋白啟動子的表達載體，并在其5'端加上10個氨基酸的核轉移訊號MPKKKRKVHP，構建DN-CIITA表達載體。缺失前335個氨基酸編碼順序的DN-CIITA cDNA按如下RT-PCR反應獲得正向引物5'-CCT GAG CCG GTG GAG CAG TTC-3‘，反向引物5‘ -ATACAG CCT GGAGAAGAG CTG-3 ‘，反應體系5uL10XLA PCR buffer II，8uL Takara dNTP，10pmol/uL 正向引物禾口反向弓丨物各 2uL,0. 5uL Takara LA taq polymerase, IuL template DNA,31. 5uL PCR gradeH20 ；反應條件94°C，2min；30 個循環，94°C 10sec,60°C 30sec，68°C Imin (之后每個循環比上一個循環延長40sec，直至20min) ；68°C延伸7min ；4°C保存。(2)將DN-CIITA表達載體轉入豬原代胚胎成纖維細胞
將DN-CIITA表達載體轉入豬原代胚胎成纖維細胞的方法為利用電穿孔的方法將線性化的DN-CIITA表達載體轉入豬原代胚胎成纖維細胞，用G418進行選擇，兩周后將具有G418抗性的單個細胞克隆進行擴增得到DN-CIITA豬原代胚胎成纖維細胞。(3)采用體細胞核轉移的技術，將DN-CIITA豬原代胚胎成纖維細胞轉變為克隆豬轉變為克隆豬的方法為體外成熟40 42小時的豬卵子在顯微操作下去核，單個 DN-CIITA豬原代胚胎成纖維細胞經顯微注射進入去核的卵細胞，然后通過電擊融合，再次電擊來激活核轉移的卵細胞，100 150個激活的核轉移的卵細胞通過外科手術放入激素誘導發情的受體母豬的輸卵管，懷孕豬產下轉基因豬。上述II類豬白細胞表面抗原抑制豬在減少器官異種移植排斥反應中的應用。上述II類豬白細胞表面抗原抑制豬在減少器官異種移植急性血管性排斥反應中的應用。有益效果本發明的II類豬白細胞表面抗原抑制豬的SLA-II類抗原的表達顯著降低，特別在其內皮細胞表面，SLA-II類抗原的表達幾乎為零，這將大大降低豬器官異種抗原的遞呈，也能降低豬器官本身的免疫原性，對抑制異種器官的急性排斥反應有著重要的作用。
圖1為流式細胞儀分析DN-CIITA ST細胞中SLA-DR的表達。其中，(a)為ST細胞，(b)為 DN-CIITA ST 細胞。圖2為流式細胞儀分析DN-CIITA內皮細胞，其中，(a)為無IFN_r激活的野生型內皮細胞(SLA-DR抗體)；(b)為IFN-r激活的野生型內皮細胞(SLA-DR抗體)；(c)為無 IFN-r激活的DN-CIITA轉基因豬血管內皮細胞(SLA-DR抗體)；(d) IFNt激活的DN-CIITA 轉基因豬血管內皮細胞(SLA-DR抗體)。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例1 人CIITA的顯性失活突變體(DN-CIITA)表達載體的構建。提取人淋巴細胞的RNA，經反轉錄合成cDNA。人CIITA顯性失活突變體(DN-CIITA) 的cDNA缺失了前335個氨基酸編碼順序。DN-CIITA cDNA由下列引物進行RT-PCR擴增 正向引物5' -CCT GAG CCG GTG GAG CAG TTC-3‘，反向引物5' -ATA CAG CCT GGA GAA GAG CTG-3‘，擴增出 2489bp 的 DN-CIITA cDNA(順序見 SEQ ID No:l)。DN-CIITA cDNA 然后插入帶有Tie-2增強子、CMV增強子和beta-肌動蛋白啟動子的表達載體，并在其5' 端加上 10 個氨基酸的核轉移訊號(MPKKKRKVHP，ATG GGC CCC AAG AAG AAG CGG AAG GTC CAT)，構建成pST205。pST205同時含有SV40_neo基因用于選擇轉基因的細胞。實施例2 =DN-CIITA cDNA活性的鑒定。豬ST細胞在加10%胎牛血清的DMEM中培養。利用電穿孔的方法將線性化的 PST205轉入ST細胞，用800微克/毫升的G418進行選擇。兩周后將具有G418抗性的單個細胞克隆進行擴增得到ST/DN-CIITA細胞。用PCR的方法鑒定DN-CIITA轉基因細胞。單獨接種的ST/DN-CIITA和ST細胞用600單位/毫升的豬伽馬干擾素(IFN- y ) IFN- γ處理 72小時后，用抗豬SLA-DR的抗體進行標記，并用流式細胞儀進行分析。IFN-Y未處理的 ST/DN-CIITA和ST細胞作為對照。結果顯示，IFN-γ處理的ST細胞，其SLA-DR的表達明顯的增高。而IFN- γ處理的ST/DN-CIITA細胞，其SLA-DR的表達幾乎沒有增加(圖1)，提示在ST/DN-CIITA細胞中，SLA-DR的表達被DN-CIITA顯著地抑制了。實施例3 =DN-CIITA轉基因豬原代胚胎成纖維細胞的制備。豬豬原代胚胎成纖維細胞在加20 %胎牛血清和8納克/毫升堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的DMEM中培養。利用電穿孔的方法將線性化的pST205轉入豬原代胚胎成纖維細胞細胞，用200微克/毫升的G418進行選擇。兩周后將具有G418抗性的單個細胞克隆進行擴增得到DN-CIITA豬原代胚胎成纖維細胞。用PCR的方法鑒定DN-CIITA轉基因細胞。實施例4 轉有DN-CIITA的克隆豬的制備。利用體細胞核轉移的技術來克隆豬。體外成熟40-42小時的豬卵子在顯微操作下去核，單個DN-CIITA轉基因的原代胚胎豬成纖維細胞經顯微注射進入去核的卵細胞，然后兩者通過電擊融合。再次電擊來激活核轉移的卵細胞，100-150個激活的核轉移的卵細胞通過外科手術放入激素誘導發情的受體母豬的輸卵管，利用超聲波檢測受體豬的受孕情況。懷孕豬在約114天后產下轉基因豬。在三周時，剪小豬尾巴，提取其DNA，用PCR方法鑒定DN-CIITA基因。實施例5 =DN-CIITA轉基因豬的功能測定。取轉基因豬的原代血管內皮細胞進行培養，在600單位/ml的IFN-γ誘導7 后，用抗SLA-DR抗體標記，進行流式細胞分析。結果顯示，IFN-Y處理的原代血管內皮細胞，其SLA-DR的表達明顯的增高。而IFN-γ處理的DN-CIITA轉基因原代血管內皮細胞， 其SLA-DR的表達幾乎沒有增加(圖2)。從而證明在DN-CIITA轉基因豬的血管內皮細胞， SLA的表達被完全抑制了。
權利要求
1.II類豬白細胞表面抗原抑制豬，其特征在于該豬的II類豬白細胞表面抗原SLA被抑制。
2.權利要求1所述的II類豬白細胞表面抗原抑制豬的構建方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)構建DN-CIITA表達載體；(2)將DN-CIITA表達載體轉入豬原代胚胎成纖維細胞；(3)采用體細胞核轉移的技術，將DN-CIITA豬原代胚胎成纖維細胞轉變為克隆豬。
3.根據權利要求2所述的II類豬白細胞表面抗原抑制豬的構建方法，其特征在于步驟 (1)中，構建DN-CIITA表達載體的方法為提取人淋巴細胞或豬淋巴細胞的RNA，經反轉錄合成cDNA，DN-CIITA的cDNA缺失前335個氨基酸編碼順序，DN-CIITAcDNA然后插入帶有 Tie-2增強子、CMV增強子和beta-肌動蛋白啟動子的表達載體，并在其5'端加上10個氨基酸的核轉移訊號MPKKKRKVHP，構建DN-CIITA表達載體。
4.根據權利要求3所述的II類豬白細胞表面抗原抑制豬的構建方法，其特征在于缺失前335個氨基酸編碼順序的DN-CIITA cDNA按如下RT-PCR反應獲得正向引物5' -CCT GAG CCG GTG GAG CAG TTC-3‘，反向引物5' -ATA CAG CCT GGA GAA GAG CTG-3‘，反應體系5uL 10XLAPCR buffer II，8uL Takara dNTP，10pmol/uL 正向引物和反向弓丨物各 2uL,0. 5uL Takara LA taq polymerase, IuL template DNA,31. 5uL PCR gradeH20 ；反應條件94°C，2min ;30 個循環，94°C lOsec，60°C 30sec，68°C Imin (之后每個循環比上一個循環延長40sec，直至20min) ；68°C延伸7min ；4°C保存。
5.根據權利要求2所述的II類豬白細胞表面抗原抑制豬的構建方法，其特征在于步驟O)中，將DN-CIITA表達載體轉入豬原代胚胎成纖維細胞的方法為利用電穿孔的方法將線性化的DN-CIITA表達載體轉入豬原代胚胎成纖維細胞，用G418進行選擇，兩周后將具有G418抗性的單個細胞克隆進行擴增得到DN-CIITA豬原代胚胎成纖維細胞。
6.根據權利要求2所述的II類豬白細胞表面抗原抑制豬的構建方法，其特征在于步驟(3)中，轉變為克隆豬的方法為體外成熟40 42小時的豬卵子在顯微操作下去核，單個DN-CIITA豬原代胚胎成纖維細胞經顯微注射進入去核的卵細胞，然后通過電擊融合，再次電擊來激活核轉移的卵細胞，100 150個激活的核轉移的卵細胞通過外科手術放入激素誘導發情的受體母豬的輸卵管，懷孕豬產下轉基因豬。
7.權利要求1所述的II類豬白細胞表面抗原抑制豬在減少器官異種移植排斥反應中的應用。
8.權利要求7所述的II類豬白細胞表面抗原抑制豬在減少器官異種移植急性血管性排斥反應中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種II類豬白細胞表面抗原抑制豬，該豬的II類豬白細胞表面抗原SLA被抑制。本發明還公開了上述II類豬白細胞表面抗原抑制豬的構建方法。本發明還公開了上述II類豬白細胞表面抗原抑制豬在減少器官異種移植排斥反應中的應用。本發明的II類豬白細胞表面抗原抑制豬的SLA-II類抗原的表達顯著降低，特別在其內皮細胞表面，SLA-II類抗原的表達幾乎為零，這將大大降低豬器官異種抗原的遞呈，也能降低豬器官本身的免疫原性，對抑制異種器官的急性排斥反應有著重要的作用。
文檔編號C12N15/877GK102293181SQ20101020631
公開日2011年12月28日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年6月22日
發明者戴一凡 申請人:南京華貞生物醫藥科技有限公司