專利名稱：用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組及試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組及 檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒。
背景技術：
人類血小板表面具有復雜的血型抗原，血小板抗原根據其分布情況。可以分為兩 大類型。一類是與其他細胞或組織共有的抗原，如ABH、HLA-I類抗原等；另一類是血小板 本身特有的同種抗原(HPA)，由血小板特有的抗原決定簇組成，HPA不匹配可引起血小板同 種免疫反應，產生血小板同種抗體，一般由輸血、妊娠或骨髓移植等免疫刺激而產生，導致 同種免疫性血小板減少，誘發如輸血后血小板減少性紫癜(PTP)、血小板輸注無效(PTR)、 被動性血小板減少癥(PAIT)及新生兒同種免疫血小板減少性紫癜(NAITP)等疾病，同時在 臨床移植中還會引起移植排斥等相關疾病。因此，臨床需要準確檢測和鑒定HPA，對于研究 血小板HPA同型輸注；準確判定胎兒的HPA抗原，對新生兒進行篩查，以預防NAITP的發生； 避免因HPA不合而產生移植排斥反應；有助于避免同種免疫造成的血小板輸注無效發生， 從而為血液的安全輸注提供保障；有利于選擇匹配型血小板輸注，達到快速、有效的急救輸 血目的。目前使用的HPA血清學分型方法存在兩大弊端一是有些抗血清很難獲得；二是 從新生兒同種免疫性血小板減少、輸血后紫癜、血小板輸注無效3種病人中較難獲得大量 的血小板用于血清檢測。90年代以后，伴隨分子生物學技術的迅速發展，使得可以從基因 水平對HPA抗原系統進行研究和分型，從而克服了 HPA血清學分型的弊端。HPA的分型方 法重點轉向分子生物學領域，主要是使用聚合酶鏈式反應(PCR)方法，包括PCR-RFLP[2]、 PCR-ASO[3]、PCR-SSPm、PCR-SSCP[5]、PCR-PHFAm 等。上述各方法的 PCR 擴增反應均相同，不 同的是擴增產物的檢測方法。PCR-RFLP的產物檢測需用昂貴的限制性內切酶水解后電泳， 再進行電泳片段的分析，結果的分析判斷甚為復雜；PCR-ASO的產物檢測需用不同的DNA 標記探針雜交，再通過相應的方法(同位素或酶)，來顯示雜交信號，非常繁瑣而且耗時； PCR-SSCP和PCR-PHFA亦需用較復雜的方法進行產物的檢測和分析。而序列特異引物-聚合酶鏈式反應(PCR-SSP)檢測技術靈敏度高、特異性強、檢驗 周期短、操作簡便。但是目前尚無應用此種方法實現對人血小板同種抗原HPA(1-17)基因 的快速檢測。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術中的不足，提供一種用于檢測人血小板同種抗原基 因的引物組。本發明的第二個目的是提供一種具有靈敏、特異、經濟、簡便、快速的特點的用于 檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒。一種用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組，包括HPA_6a引物對、HPA_6b引物對、HPA-15Gova引物對、HPA-15Govb引物對和內參引物對，所述HPA_6a引物對的上、下 游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22所示的核苷酸序列，所述HPA_6b引 物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24所示的核苷酸序列， 所述HPA-15Gova引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26所 示的核苷酸序列，所述HPA-15Govb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 27、 SEQ IDN0. 28所示的核苷酸序列，所述內參引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70所示的核苷酸序列。一種用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組，還包括ΗΡΑ-la引物對、ΗΡΑ-lb引 物對、HPA-2a引物對、HPA-2b引物對、HPA_3a引物對、HPA_3b引物對、HPA_4a引物對、HPA_4b 引物對、HPA-5a引物對、HPA-5b引物對、HPA_7a引物對、HPA_7b引物對、HPA_8a引物對、 HPA-8b引物對、HPA-9a引物對、HPA_9b引物對、HPA-IOa引物對、HPA-IOb引物對、HPA-I Ia 引物對、HPA-Ilb引物對、HPA-12a引物對、HPA_12b引物對、HPA_13a引物對、HPA_13b引物 對、HPA-14a引物對、HPA-14b引物對、HPA-16a引物對、HPA-16b引物對、HPA-17a引物對、 HPA-17b引物對；所述ΗΡΑ-la引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 1、SEQ ID Ν0· 2所 示的核苷酸序列；所述ΗΡΑ-lb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 3、SEQ ID Ν0· 4所 示的核苷酸序列；所述HPA-2a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 5、SEQ ID Ν0· 6所 示的核苷酸序列；所述HPA-2b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 7、SEQ ID NO. 8所 示的核苷酸序列；所述HPA-3a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 9、SEQ ID NO. 10 所示的核苷酸序列；所述HPA-3b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12 所示的核苷酸序列；所述HPA-4a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 13,SEQ ID NO. 14 所示的核苷酸序列；所述HPA-4b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 15,SEQ ID NO. 16 所示的核苷酸序列；所述HPA-5a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 17,SEQ ID NO. 18 所示的核苷酸序列；所述HPA-5b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 19,SEQ ID NO. 20 所示的核苷酸序列；所述HPA-7a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 29,SEQ ID NO. 30 所示的核苷酸序列；所述HPA-7b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32 所示的核苷酸序列；所述HPA-8a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 33,SEQ ID NO. 34所示的核苷酸序列；所述HPA-8b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 35,SEQ ID NO. 36 所示的核苷酸序列；所述HPA-9a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 37,SEQ ID NO. 38 所示的核苷酸序列；所述HPA-9b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40 所示的核苷酸序列；所述HPA-IOa引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 41,SEQ ID NO. 42 所示的核苷酸序列；所述HPA-IOb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 43、SEQ ID NO. 44 所示的核苷酸序列；所述HPA-Ila引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 45、SEQ ID NO. 46 所示的核苷酸序列；所述HPA-Ilb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 47、SEQ ID NO. 48 所示的核苷酸序列；所述HPA-12a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 49、SEQ ID NO. 50 所示的核苷酸序列；所述HPA-12b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 51、SEQ ID NO. 52 所示的核苷酸序列；所述HPA-13a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 53、SEQ ID NO. 54 所示的核苷酸序列；所述HPA-13b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 55、SEQ ID NO. 56 所示的核苷酸序列；所述HPA-14a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 57、SEQ ID NO. 58 所示的核苷酸序列；所述HPA-14b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 59、SEQ ID NO. 60 所示的核苷酸序列；所述HPA-16a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 6USEQ ID NO. 62 所示的核苷酸序列；所述HPA-16b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 63、SEQ ID NO. 64 所示的核苷酸序列；所述HPA-17a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 65、SEQ ID NO. 66 所示的核苷酸序列；所述HPA-17b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 67、SEQ ID NO. 68
所示的核苷酸序列。一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒，包括包被有HPA_6a引物對、 HPA-6b引物對、HPA-15Gova引物對、HPA_15Govb引物對、內參引物對的引物板和濃縮 dNTP-Buffer，所述HPA-6a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 21、SEQ ID N0.22所示的核苷酸序列，所述HPA-6b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ IDNO. 23、SEQ ID NO. 24所示的核苷酸序列，所述HPA-15Gova引物對的上、下游引物分別是序 列表中SEQ ID NO. 25、SEQ ID NO. 26所示的核苷酸序列，所述HPA_15Govb引物對的上、下 游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 27、SEQ ID NO. 28所示的核苷酸序列，所述內參引物對 的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70所示的核苷酸序列。一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒，所述引物板上還包被有HPA-Ia 引物對、ΗΡΑ-lb引物對、HPA-2a引物對、HPA_2b引物對、HPA_3a引物對、HPA_3b引物對、 HPA-4a引物對、HPA-4b引物對、HPA_5a引物對、HPA_5b引物對、HPA_7a引物對、HPA_7b引物 對、HPA-8a引物對、HPA-8b引物對、HPA_9a引物對、HPA_9b引物對、HPA-1 Oa引物對、HPA-1 Ob 引物對、HPA-Ila引物對、HPA-Ilb引物對、HPA_12a引物對、HPA_12b引物對、HPA_13a引物 對、HPA-13b引物對、HPA-14a引物對、HPA-14b引物對、HPA-16a引物對、HPA-16b引物對、 HPA-17a引物對、HPA-17b引物對；所述ΗΡΑ-la引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 1、SEQ ID Ν0· 2所 示的核苷酸序列；所述ΗΡΑ-lb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 3、SEQ ID NO. 4所 示的核苷酸序列；所述HPA_2a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 5、SEQ ID NO. 6所 示的核苷酸序列；所述HPA-2b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 7、SEQ ID NO. 8所 示的核苷酸序列；所述HPA-3a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 9、SEQ ID NO. 10 所示的核苷酸序列；所述HPA-3b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12 所示的核苷酸序列；所述HPA-4a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 13,SEQ ID NO. 14 所示的核苷酸序列；所述HPA-4b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 15,SEQ ID NO. 16 所示的核苷酸序列；所述HPA-5a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 17,SEQ ID NO. 18 所示的核苷酸序列；所述HPA-5b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 19,SEQ ID NO. 20 所示的核苷酸序列；所述HPA-7a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 29,SEQ ID NO. 30 所示的核苷酸序列；所述HPA-7b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32 所示的核苷酸序列；所述HPA-8a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 33,SEQ ID NO. 34 所示的核苷酸序列；所述HPA-8b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 35,SEQ ID NO. 36 所示的核苷酸序列；
所述HPA-9a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 37,SEQ ID NO. 38 所示的核苷酸序列；所述HPA-9b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40 所示的核苷酸序列；所述HPA-IOa引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 41,SEQ ID NO. 42 所示的核苷酸序列；所述HPA-IOb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 43、SEQ ID NO. 44 所示的核苷酸序列；所述HPA-Ila引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 45、SEQ ID NO. 46 所示的核苷酸序列；所述HPA-Ilb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 47,SEQ ID NO. 48 所示的核苷酸序列；所述HPA-12a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 49、SEQ ID NO. 50 所示的核苷酸序列；所述HPA-12b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 51、SEQ ID NO. 52 所示的核苷酸序列；所述HPA-13a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 53、SEQ ID NO. 54 所示的核苷酸序列；所述HPA-13b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 55、SEQ ID NO. 56 所示的核苷酸序列；所述HPA-14a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 57、SEQ ID NO. 58 所示的核苷酸序列；所述HPA-14b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 59、SEQ ID NO. 60 所示的核苷酸序列；所述HPA-16a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 6USEQ ID NO. 62 所示的核苷酸序列；所述HPA-16b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 63、SEQ ID NO. 64 所示的核苷酸序列；所述HPA-17a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 65、SEQ ID NO. 66 所示的核苷酸序列；所述HPA-17b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 67、SEQ ID NO. 68
所示的核苷酸序列。本發明的試劑盒的應用實現了對血小板基因分型，在臨床和輸血應用中對有效避 免血小板特異性免疫的發生、選擇輸注HPA基因型相匹配的血液制品，具有重要的意義。
圖1為檢測HPA電泳結果膠圖。圖2為HPA(1_17)特異引物孔位圖。圖3為實驗結果陰陽性判讀圖。
圖4為檢測HPA6、15電泳結果膠圖。 具體實施方案下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明。實施例1依據美國國立生物技術信息中心基因庫(NCBI Gene Bank)公開的HPA等位基 因序列，設計出用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組，該引物組包括HPA-6a引物對、 HPA-6b引物對、HPA-15Gova引物對、HPA_15Govb引物對和內參引物對。實施例2依據美國國立生物技術信息中心基因庫(NCBI Gene Bank)公開的HPA等位基 因序列，設計出用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組，該引物組包括ΗΡΑ-la引物對、 ΗΡΑ-lb引物對、HPA-2a引物對、HPA_2b引物對、HPA_3a引物對、HPA_3b引物對、HPA_4a 引物對、HPA-4b引物對、HPA-5a引物對、HPA_5b引物對、HPA_6a引物對、HPA_6b引物對、 HPA-15Gova引物對、HPA-15Govb引物對、HPA_7a引物對、HPA_7b引物對、HPA_8a引物對、 HPA-8b引物對、HPA-9a引物對、HPA_9b引物對、HPA-IOa引物對、HPA-IOb引物對、HPA-I Ia 引物對、HPA-Ilb引物對、HPA-12a引物對、HPA_12b引物對、HPA_13a引物對、HPA_13b引物 對、HPA-14a引物對、HPA-14b引物對、HPA-16a引物對、HPA-16b引物對、HPA-17a引物對、 HPA-17b引物對和內參引物對。實施例3一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒，包括包被有HPA_6a引物對、 HPA-6b引物對、HPA-15Gova引物對、HPA_15Govb引物對、內參引物對的引物板和濃縮 dNTP-Buffer,用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒的制備方法是(1)依據HPA(1_17)特異引物孔位圖(見圖2)，分別將HPA_6a引物對、HPA_6b引 物對、HPA-15Gova引物對、HPA-15Govb引物對、內參引物對包被至引物板的相應位置上，干 燥處理；(2)依據配方 200mM dNTP、3. 5mM Mg2+、500mM KCL, IOOmM Tris-HCL, 1 % TritonX-100,制備出 440 μ 1 濃縮 dNTP-Buffer ；(3)將包被有引物對的引物板及濃縮dNTP-Buffer，組成一種用于檢測人血小板 同種抗原基因的試劑盒。實施例4一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒，包括引物板和濃縮dNTP-Buffer， 制備方法是(1)依據HPA(1_17)特異引物孔位圖(圖2)，分別將ΗΡΑ-la引物對、ΗΡΑ-lb引物 對、HPA-2a引物對、HPA-2b引物對、HPA_3a引物對、HPA_3b引物對、HPA_4a引物對、HPA_4b 引物對、HPA-5a引物對、HPA-5b引物對、HPA_6a引物對、HPA_6b引物對、HPA_15Gova引物對、 HPA-15Govb引物對、HPA-7a引物對、HPA_7b引物對、HPA_8a引物對、HPA_8b引物對、HPA_9a 引物對、HPA-9b引物對、HPA-IOa引物對、HPA-IOb引物對、HPA-Ila引物對、HPA-Ilb引物 對、HPA-12a引物對、HPA-12b引物對、HPA-13a引物對、HPA-13b引物對、HPA-14a引物對、HPA-14b引物對、HPA-16a引物對、HPA-16b引物對、HPA-17a引物對、HPA-17b引物對和內參 引物對，包被至引物板的相應位置上，干燥處理；(2)依據配方 200mM dNTP、3. 5mM Mg2+、500mM KCL, IOOmM Tris-HCL, 1 % TritonX-100,制備出 440 μ 1 濃縮 dNTP-Buffer ；(3)將包被有引物對的引物板、每人份檢測包括34孔特異性引物孔；濃縮 dNTP-Buffer組成一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒。實施例5使用操作流程一、2. 5%瓊脂糖凝膠的準備1.將加入2. 5g瓊脂糖加入100ml 1 X TBE溶液(Tris-硼酸鹽-EDTA溶液)，加熱 直到形成均勻的凝膠溶液；再加入5μ 1 EB(10mg/ml)，混合均勻；2.將凝膠槽置于水平位置，向凝膠槽中加入適量凝膠溶液，插入電泳梳；前后水 平移動凝膠槽，確保凝膠溶液覆蓋均勻；3.待凝膠完全凝固后，豎直拔出電泳梳；二、PCR儀循環參數見表1表1 擴增參數特征表 注如果按此循環參數擴增有假陽性的淺帶，可以做如下調整1.第 4 步循環參數調整為:96V /20sec，62. 5V /50sec，72°C /45sec2.或者降低 Taq 酶為 3. 0-3. 2 μ 1 (5units/ μ 1)三、必須滿足的測試條件1.從冷凍室取出Taq聚合酶，置于冰上備用；2.根據實驗所需數量，將包被引物的干燥冷凍保存的引物板取出，放置室溫解凍，3.根據實驗所需數量，將冷凍的DNA樣本、濃縮dNTP-Buffer取出，徹底融化，混勻 離心；四、測試過程中的注意事項1. PCR擴增前后使用的加樣器具要分開，不得混用。2. EB是強誘變劑，并有中度毒性，操作時請務必戴手套，實驗結束后，應對含EB的溶液進行凈化處理再行棄置，以避免污染環境和危害人體健康。3.所有血液制品均應按照潛在的傳染物處理。4.當觀察和拍攝膠凝體時，要戴防紫外光的保護鏡，不要直視紫外光源。5.試劑和樣本應加樣到微孔板的底部。6.為避免交叉污染，在不同樣本和試劑之間加樣要更換槍頭。7.所有試劑和樣本在檢測前應準備好，一旦開始試驗，為確保得到可靠結果不可 中斷操作。8. Taq聚合酶粘性很大，在分裝過程中必須小心操作確保準確。9.嚴格按照指定的順序操作。五、測試步驟選用實施例4制備的一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑
ιπτ.1.配制 dNTP-Buffer 工作液440 μ 1 濃縮 dNTP-Buffer+560 μ 1 無菌水=1000 μ 1 dNTP-Buffer 工作液2.配制Buffer-酶-樣本混合液每人份用量320μ1dNTP-Buffer 工作液+3. 3μ 1 Taq 酶+50μ1 DNA = 373. 3 μ 1
混合液；3.漩渦混勻Buffer-酶-樣本混合液，并瞬時離心，使液體置于管底；4.分別向每個引物孔(1-34孔)各加入10μ 1上述混合液；5.每孔再分別加入15-20 μ 1石蠟油，用密封膜封好PCR反應板(引物板)；6.將引物板放入設置好循環參數的PCR儀內，配合使用適當的PCR板適配器。PCR 循環參數見“步驟二”表1 ；7.反應板頂部置PCR密封壓力墊，以防止液體蒸發，關上PCR儀，啟動程序直至循 環結束；8.啟動PCR程序，直到循環結束；9.取出引物板，輕輕地撕掉密封膜，防止樣品濺出。或者如果不立即電泳，置于 4°C可保存48小時；10.按照弓丨物孔位圖的順序，將每個PCR反應產物(5-10 μ 1)轉移到2. 5 %瓊脂糖 凝膠孔中；11.開啟電泳儀，在140-150V下電泳15-20分鐘；12.紫外光或紫外/凝膠成像系統下觀察結果并拍攝成像，保存試驗結果；13.根據提供的ΗΡΑ(1_17)特異性引物孔位圖(圖2)解釋分型結果；六、質量控制程序內參質控帶(緩慢遷移的)作為成功擴增 質控手段，在陰性孔應該總是可見的； 陽性孔的內參質控帶可能會很弱或者不存在，這是因為特異性引物擴增過程中與內參引物 競爭Taq酶等反應原料的結果。七、實驗結果的判讀A檢測HPA電泳結果膠圖(圖1)，實驗結果陰陽性判讀圖(圖3)。B預期結果陽性孔有兩條帶，一條是434bp內參帶，另一條是特異性擴增帶
陰性孔只有一條帶，為434bp內參帶，無特異性擴增帶產物大小和孔位見HPA(1-17)特異性引物孔位圖(圖2)。根據所附的“引物孔位圖”或該試劑配套軟件進進行分型結果的判定該實驗為定性試驗，特異性擴增帶強弱將不影響結果判讀；內參大小和擴增產物 大小請參見HPA(1-17)特異性引物孔位圖(圖2)；并符合人類基因座位規則。實施例6步驟一、二、三、四和六同實施例5五、測試步驟為選用實施例3制備的一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試 劑盒1.配制 dNTP-Buffer 工作液440 u 1 濃縮 dNTP-Buffer+560 u 1 無菌水=1000 u 1 dNTP-Buffer 工作液2.配制Buffer-酶-樣本混合液每人份用量320iildNTP-Buffer 工作液+3. 3 ii 1 Taq 酶+50iU DNA = 373. 3 u 1 Buffer-酶-樣本混合液；3.漩渦混勻Buffer-酶-樣本混合液，并瞬時離心，使液體置于管底；4.分別向引物板上第11、12、13、14引物孔各加入lOiU Buffer-酶-樣本混合 液；5.每孔再分別加入15-20 yl石蠟油，用密封膜封好PCR反應板(引物板)；6.將引物板放入設置好循環參數的PCR儀內，配合使用適當的PCR板適配器。PCR 循環參數見“步驟二”表1 ；7.反應板頂部置PCR密封壓力墊，以防止液體蒸發，關上PCR儀，啟動程序直至循 環結束；8.啟動PCR程序，直到循環結束；9.取出引物板，輕輕地撕掉密封膜，防止樣品濺出。或者如果不立即電泳，置于 4°C可保存48小時；10.按照引物孔位圖的順序，將每個PCR反應產物(5-10 ill)轉移到2. 5%瓊脂糖 凝膠孔中；11.開啟電泳儀，在140-150V下電泳15-20分鐘；12.紫外光或紫外/凝膠成像系統下觀察結果并拍攝成像，保存試驗結果；13.根據提供的HPA(1-17)特異性引物孔位圖(圖2)解釋分型結果；七、實驗結果的判讀A檢測HPA6、15電泳結果膠圖(圖4)，實驗結果陰陽性判讀圖(附圖3)。B預期結果陽性孔有兩條帶，一條是434bp內參帶，另一條是特異性擴增帶陰性孔只有一條帶，為434bp內參帶，無特異性擴增帶產物大小和孔位見HPA(1-17)特異性引物孔位圖(圖2)。根據所附的“引物孔位圖”或該試劑配套軟件進進行分型結果的判定該實驗為定性試驗，特異性擴增帶強弱將不影響結果判讀；內參大小和擴增產物 大小請參見HPA(1-17)特異性引物孔位圖(圖2)；并符合人類基因座位規則。以上各實施例涉及到的引物對如下ΗΡΑ-la引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2所示的 核苷酸序列；ΗΡΑ-lb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4所示的 核苷酸序列；HPA-2a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 6所示的
核苷酸序列；HPA-2b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 7,SEQ ID NO. 8所示的
核苷酸序列；HPA-3a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 9、SEQ ID Ν0· 10所示 的核苷酸序列；HPA-3b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. IUSEQ ID NO. 12所示 的核苷酸序列；HPA-4a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 13,SEQ ID NO. 14所示 的核苷酸序列；HPA-4b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 15,SEQ ID NO. 16所示 的核苷酸序列；HPA-5a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 17,SEQ ID NO. 18所示 的核苷酸序列；HPA-5b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 19,SEQ ID NO. 20所示 的核苷酸序列；HPA-6a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22所示 的核苷酸序列；HPA-6b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 23,SEQ ID NO. 24所示 的核苷酸序列；HPA-15Gova引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 25、SEQ ID NO. 26 所示的核苷酸序列；HPA-15Govb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 27、SEQ ID NO. 28 所示的核苷酸序列；HPA-7a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 29,SEQ ID NO. 30所示 的核苷酸序列；HPA-7b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 31、SEQ ID NO. 32所示 的核苷酸序列；HPA-8a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 33、SEQ ID NO. 34所示 的核苷酸序列；HPA-8b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 35,SEQ ID NO. 36所示 的核苷酸序列；HPA-9a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 37,SEQ ID NO. 38所示 的核苷酸序列；
HPA-9b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40所示 的核苷酸序列；HPA-IOa引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42所 示的核苷酸序列；HPA-IOb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44所 示的核苷酸序列；HPA-Ila引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 45、SEQ ID NO. 46所 示的核苷酸序列；HPA-Ilb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 47、SEQ ID NO. 48所 示的核苷酸序列；HPA-12a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 49、SEQ ID NO. 50所 示的核苷酸序列；HPA-12b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 51、SEQ ID NO. 52所 示的核苷酸序列；HPA-13a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 53、SEQ ID NO. 54所 示的核苷酸序列；HPA-13b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 55、SEQ ID NO. 56所 示的核苷酸序列；HPA-14a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 57、SEQ ID NO. 58所 示的核苷酸序列；HPA-14b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 59、SEQ ID NO. 60所 示的核苷酸序列；HPA-16a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 61、SEQ ID NO. 62所 示的核苷酸序列；HPA-16b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 63、SEQ ID NO. 64所 示的核苷酸序列；HPA-17a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 65、SEQ ID NO. 66所 示的核苷酸序列；HPA-17b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 67、SEQ ID NO. 68所
示的核苷酸序列。內參引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 69、SEQ ID NO. 70所示的
核苷酸序列。
權利要求
一種用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組，其特征是包括HPA 6a引物對、HPA 6b引物對、HPA 15Gova引物對、HPA 15Govb引物對和內參引物對，所述HPA 6a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示的核苷酸序列，所述HPA 6b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示的核苷酸序列，所述HPA 15Gova引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示的核苷酸序列，所述HPA 15Govb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.27、SEQ IDNO.28所示的核苷酸序列，所述內參引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO.69、SEQ ID NO.70所示的核苷酸序列。
2.根據權利要求1所述的一種用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組，其特征是還 包括HPA-la引物對、HPA-lb引物對、HPA-2a引物對、HPA-2b引物對、HPA_3a引物對、HPA_3b 引物對、HPA-4a引物對、HPA-4b引物對、HPA_5a引物對、HPA_5b引物對、HPA_7a引物對、 HPA-7b引物對、HPA-8a引物對、HPA_8b引物對、HPA_9a引物對、HPA_9b引物對、HPA-10a 引物對、HPA-10b引物對、HPA-lla引物對、HPA-llb引物對、HPA_12a引物對、HPA_12b引物 對、HPA-13a引物對、HPA-13b引物對、HPA_14a引物對、HPA_14b引物對、HPA_16a引物對、 HPA-16b引物對、HPA-17a引物對、HPA_17b引物對；所述HPA-la引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的 核苷酸序列；所述HPA-lb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 4所示的 核苷酸序列；所述HPA-2a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列；所述HPA-2b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8所示的 核苷酸序列；所述HPA-3a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10所示 的核苷酸序列；所述HPA-3b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 11,SEQ ID NO. 12所示 的核苷酸序列；所述HPA-4a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 13、SEQ ID NO. 14所示 的核苷酸序列；所述HPA-4b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 15,SEQ ID NO. 16所示 的核苷酸序列；所述HPA-5a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 17、SEQ ID NO. 18所示 的核苷酸序列；所述HPA-5b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 19,SEQ ID NO. 20所示 的核苷酸序列；所述HPA-7a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 29、SEQ ID NO. 30所示 的核苷酸序列；所述HPA-7b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 31,SEQ ID NO. 32所示 的核苷酸序列；所述HPA-8a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 33、SEQ ID NO. 34所示 的核苷酸序列；所述HPA-8b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 35,SEQ ID NO. 36所示 的核苷酸序列；所述HPA-9a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38所示 的核苷酸序列；所述HPA-9b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 39,SEQ ID NO. 40所示 的核苷酸序列；所述HPA-10a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42所 示的核苷酸序列；所述HPA-10b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44所 示的核苷酸序列；所述HPA-lla引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46所 示的核苷酸序列；所述HPA-llb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48所 示的核苷酸序列；所述HPA-12a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50所 示的核苷酸序列；所述HPA-12b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52所 示的核苷酸序列；所述HPA-13a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54所 示的核苷酸序列；所述HPA-13b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56所 示的核苷酸序列；所述HPA-14a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 57、SEQ ID NO. 58所 示的核苷酸序列；所述HPA-14b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 59、SEQ ID NO. 60所 示的核苷酸序列；所述HPA-16a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 61、SEQ ID NO. 62所 示的核苷酸序列；所述HPA-16b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 63、SEQ ID NO. 64所 示的核苷酸序列；所述HPA-17a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 65、SEQ ID NO. 66所 示的核苷酸序列；所述HPA-17b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 67、SEQ ID NO. 68所 示的核苷酸序列。
3. 一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒，包括包被有HPA-6a引物對、HPA-6b 引物對、HPA-15Gova引物對、HPA-15Govb引物對、內參引物對的引物板和濃縮dNTP-Buffer， 所述HPA-6a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 21、SEQ ID NO. 22所示的核苷酸序列，所述HPA-6b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 23、SEQ ID NO. 24 所示的核苷酸序列，所述HPA-15Gova引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 25、 SEQ ID NO. 26所示的核苷酸序列，所述HPA-15Govb引物對的上、下游引物分別是序列表中 SEQ ID NO. 27,SEQ ID NO. 28所示的核苷酸序列，所述內參引物對的上、下游引物分別是序 列表中SEQ ID NO. 69、SEQ ID NO. 70所示的核苷酸序列。
4.根據權利3所述的一種用于檢測人血小板同種抗原基因的試劑盒，其特征是所述 引物板上還包被有ΗΡΑ-la引物對、ΗΡΑ-lb引物對、HPA_2a引物對、HPA_2b引物對、HPA_3a 引物對、HPA-3b引物對、HPA-4a引物對、HPA_4b引物對、HPA_5a引物對、HPA_5b引物對、 HPA-7a引物對、HPA-7b引物對、HPA_8a引物對、HPA_8b引物對、HPA_9a引物對、HPA_9b引 物對、HPA-IOa引物對、HPA-IOb引物對、HPA-Ila引物對、HPA-Ilb引物對、HPA-12a引物 對、HPA-12b引物對、HPA-13a引物對、HPA-13b引物對、HPA-14a引物對、HPA-14b引物對、 HPA-16a引物對、HPA-16b引物對、HPA-17a引物對、HPA-17b引物對；所述ΗΡΑ-la引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2所示的 核苷酸序列；所述ΗΡΑ-lb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4所示的 核苷酸序列；所述HPA-2a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列；所述HPA-2b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8所示的 核苷酸序列；所述HPA-3a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 9、SEQ ID NO. 10所示 的核苷酸序列；所述HPA-3b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. IUSEQ ID Ν0· 12所示 的核苷酸序列；所述HPA-4a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 13、SEQ ID NO. 14所示 的核苷酸序列；所述HPA-4b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 15、SEQ ID NO. 16所示 的核苷酸序列；所述HPA-5a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 17、SEQ ID NO. 18所示 的核苷酸序列；所述HPA-5b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 19,SEQ ID NO. 20所示 的核苷酸序列；所述HPA-7a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 29、SEQ ID NO. 30所示 的核苷酸序列；所述HPA-7b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 31、SEQ ID NO. 32所示 的核苷酸序列；所述HPA-8a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 33、SEQ ID NO. 34所示 的核苷酸序列；所述HPA-8b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 35、SEQ ID NO. 36所示的核苷酸序列；所述HPA-9a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 37、SEQ ID NO. 38所示 的核苷酸序列；所述HPA-9b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40所示 的核苷酸序列；所述HPA-IOa引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42所 示的核苷酸序列；所述HPA-IOb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44所 示的核苷酸序列；所述HPA-Ila引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46所 示的核苷酸序列；所述HPA-Ilb引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48所 示的核苷酸序列；所述HPA-12a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50所 示的核苷酸序列；所述HPA-12b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 51、SEQ ID NO. 52所 示的核苷酸序列；所述HPA-13a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 53、SEQ ID NO. 54所 示的核苷酸序列；所述HPA-13b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 55、SEQ ID NO. 56所 示的核苷酸序列；所述HPA-14a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 57、SEQ ID NO. 58所 示的核苷酸序列；所述HPA-14b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 59、SEQ ID NO. 60所 示的核苷酸序列；所述HPA-16a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 61、SEQ ID NO. 62所 示的核苷酸序列；所述HPA-16b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 63、SEQ ID NO. 64所 示的核苷酸序列；所述HPA-17a引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 65、SEQ ID NO. 66所 示的核苷酸序列；所述HPA-17b引物對的上、下游引物分別是序列表中SEQ ID N0. 67、SEQ ID NO. 68所 示的核苷酸序列。
全文摘要
本發明公開了一種用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組及試劑盒，用于檢測人血小板同種抗原基因的引物組包括HPA-6a引物對、HPA-6b引物對、HPA-15Gova引物對、HPA-15Govb引物對和內參引物對，本發明的試劑盒的應用實現了對血小板基因分型，在臨床和輸血應用中對有效避免血小板特異性免疫的發生、選擇輸注HPA基因型相匹配的血液制品，具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/68GK101892314SQ20101020555
公開日2010年11月24日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年6月22日
發明者趙衛軍 申請人:天津市秀鵬生物技術開發有限公司