專利名稱：一種雞肉質多基因聚合檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物育種學、發育生物學和細胞生物學領域。
背景技術：
目前，我國在研究雞肉質相關基因多應用PCR檢測技術的方法，具有操作簡單、特 異性高、重復性好等優點，而且可以直接確定突變的部位和性質，因此在多態性檢測中應 用很廣。而多位點序列分型(multilocussequencetypir^MLST)是一種通過直接測定多個 管家基因的核苷酸序列來發現基因變異的分型方法，是在普通PCR的基礎上加以改進，具 有節省時間、降低成本、提高效率的優點，特別是節省珍貴的實驗樣品，所以一經提出，即 得到眾多研究者的青睞，并且發展迅速，在生命科學的各個領域，多位點序列分型已經成 為一項成熟而重要的研究手段。雞肉質相關這方面的研究國內還未見有報道。針對我國優質雞育種中肉品質性狀表型選擇遺傳進展慢、育種效率低等問題，在已有研究的基礎上，以影響肌苷酸含量的候選基因(GARS-AIRS-GART)和影響肌內脂肪含量 的候選基因(A-FABP、Ex-FABP)為研究對象，從中選擇了相關基因研制出本試劑盒進行多基 因聚合檢測分析，本試劑盒的原理即是采用多位點序列分型技術，其可以加快優質雞的育 種進程，為其專門化品系和配套系的選育提供技術支撐。
發明內容
本發明的目的是研究出一個可以對多個影響雞肉質的基因進行多基因聚合的試劑盒。本發明所說的雞肉質多基因聚合檢測試劑盒，包括以下成份PCR緩沖液、dNTPs、 Taq酶、A-FABP-3基因引物、Εχ-FABP基因引物和GARS-AIRS-GART基因引物，其中
A-FABP-3 基因引物是F 5，CGGATAAGGAGGGCAGAG3， R 5’AGGTTCCCATCCACCACT3， Ex-FABP 基因引物F 5，CGTGACAGGGCATTCTT3， R 5’TGGTGTTGTGTGGGTAGTT3’
GARS-AIRS-GART 基因引物是F 5，ACAGTTGCCAGTCTGATTA3， R 5’CATCGCCAGAGTTAGAAGT3’。本發明的試劑盒通過直接測定多個管家基因的核苷酸序列來確定基因變異的分 型，是在普通PCR的基礎上加以改進，具有節省時間、降低成本、提高效率的優點，特別是節 省珍貴的實驗樣品，從肌苷酸含量的候選基因(GARS-AIRS-GART)和影響肌內脂肪含量的候 選基因(A-FABP、Ex-FABP)中選擇了相關基因，進行多基因聚合檢測研究，進行PCR擴增，以 及結果分析。
圖1 是Ex-FABP基因的基因型。
圖2 是A-FABP基因的基因型。圖3 是GARS-AIRS-GART基因的基因型。
具體實施例方式試劑盒內容及時配制 自備材料
1、蒸餾水
2、加樣器:10ul、100ul、200ul
3、震蕩儀、PCR儀及電泳槽等。 樣品要求
1、樣品采集后盡早進行DNA提取，提取可按常規酚/氯仿法進行，提取后若不能馬上進 行試驗，可將DNA樣存放于4°C或-20°C保存，但應避免反復凍融。2、DNA質量要求DNA呈透明狀，粘稠度好。提取DNA時，血樣至分離白細胞之間隔 時間在室溫下放置不超過2h，4°C放置不超過5h，以防白細胞自溶。操作步驟
1、先將引物離心，用足量的蒸餾水將引物按附錄中說明稀釋，充分上下震蕩5-10分 鐘，常溫下過夜使其充分溶解，-20°C保存備用。2、使用前，將試劑盒從_20°C環境中取出(Taq酶除外)，應在室溫下平衡15_30分 鐘至溶解后方可使用。3、建立PCR擴增體系
(1)PCR擴增體系
PCR 擴增反應體系為 10XPCR 緩沖液 2 μ L，IOmmol/LdNTPs2 μ L，20 μ mo 1/LNE-F 引物 1 μ L，20 μ mol/LNE-R/R 引物 1 μ L, Taq 酶 IU，15ng/ μ LDNA 模板 1 μ L,總體積為 25 μ L0 反 應條件94°C預變性5min，94°C變性Imin，58°C退火45s，72°C延伸Imin，共35個循環；最后 72°C 延伸 5min。(2)將15ng/ μ LDNA模板1 μ L各自點入試劑盒孔中，放入PCR儀。4、PCR產物用10%聚丙烯酰胺電泳檢測產物。5 μ LPCR產物中加入10 μ L上樣緩 沖液(98% 甲酰胺、0. 025% 溴酚藍、0. 025% 二甲苯青、10mmol/LEDTA(pH8. 0)、2% 甘油)。剩 余PCR產物4°C保存備用。5、98°C變性15min，在結束程序之前迅速將其放入冰盒，然后-20°C冰浴lOmin， 10%非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr Bi8=49:1)電泳，120V電泳10 12小時。6、銀染并判型。7、三種基因的判型原則如下
(1 )Ex-FABP基因在外顯子均沒有檢測到SNP突變，在內含子3檢測到C3654T、C3699T、 A3700G3個SNP突變，共6種基因型，將Ex_FABP_3純合型分別定義為AA、BB和CC型，雜合 型定義為AB、AC和BC型；
(2)A-FABP基因外顯子3 (A-FABP-3)檢測到A1763G的SNP突變，將其的純和型分別 定義為AA、BB型，雜合型定義為AB ；
(3)GARS-AIRS-GART基因的第4外顯子中的9839處的C-A突變(GARS3)，為非同義突變，導致了甘氨酞胺核普酸合成酶氨基酸序列的第173處發生氨基酸的變異由天冬氨酸 (AsP)突變為谷氨酸(Glu)，將其純和型分別定義為AA、CC型，雜合型定義為AC。可根據以上原則結合兩個基因PCR圖共同判型。圖1是Ex-FABP基因的基因型， 其中 AA:3, 6，8，9，11;BB:1;CC:12;AB:2, 10;AC:5，7;BC:4。圖 2 是 A-FABP 基因的基因型， 其中 AA:5;BB:1，3;CC:12;AB:2，4，6。圖 3 是圖 3 GARS-AIRS-GART 基因的基因型，其中 AA:3，4，5，6;BB:1;CC:7;AB:2;AC:8。保存條件 試劑盒保存-20°C。 附錄
1、A-FABP-3、Ex-FABP-3、GARS-AIRS-GART三個基因的引物序列分別為
2、引物稀釋說明 (l)A-FABP-3基因引物
上游每OD的引物加500ul的緩沖液配成IOOuM的貯存液； 下游每OD的引物加620ul的緩沖液配成IOOuM的貯存液。(2 ) Ex-FABP-3 基因引物
上游每OD的引物加620ul的緩沖液配成IOOuM的貯存液； 下游每OD的引物加540ul的緩沖液配成IOOuM的貯存液。(3) GARS-AIRS-GART 基因引物
上游每OD的引物加54ul的緩沖液配成IOOuM的貯存液； 下游每OD的引物加52ul的緩沖液配成IOOuM的貯存液。
權利要求
一種雞肉質多基因聚合檢測試劑盒，包括以下成份PCR緩沖液、dNTPs、 Taq 酶、A-FABP-3基因引物、Ex-FABP基因引物和GARS-AIRS-GART基因引物，其中A-FABP-3基因引物是F 5'CGGATAAGGAGGGCAGAG3’R 5'AGGTTCCCATCCACCACT3’Ex-FABP基因引物F 5'CGTGACAGGGCATTCTT 3’R 5' TGGTGTTGTGTGGGTAGTT3’GARS-AIRS-GART基因引物是F 5' ACAGTTGCCAGTCTGATTA3’R 5' CATCGCCAGAGTTAGAAGT3’。
全文摘要
本發明公開了一種雞肉質多基因聚合檢測試劑盒，該試劑盒包括PCR緩沖液、dNTPs、Taq酶、A-FABP-3基因引物、Ex-FABP基因引物和GARS-AIRS-GART基因引物。本發明試劑盒通過直接測定多個管家基因的核苷酸序列來發現基因變異的分型方法，是在普通PCR的基礎上加以改進，具有節省時間、降低成本、提高效率的優點,特別是節省珍貴的實驗樣品，從肌苷酸含量的候選基因和影響肌內脂肪含量的候選基因中選擇了相關基因，用本試劑盒進行多基因聚合檢測研究。
文檔編號C12Q1/68GK101838704SQ20101020536
公開日2010年9月22日 申請日期2010年6月22日 優先權日2010年6月22日
發明者劉艷, 常國斌, 李芹, 欒德琴, 胡國順, 陳國宏, 陳蓉 申請人:揚州大學