專利名稱：一種水質急性毒性在線監測的設備及方法
技術領域：
本發明涉及一種水質急性毒性在線監測的設備及方法，尤其涉及一種基于固定化 發光細菌生物敏感元件的水質急性毒性在線監測的設備和方法，屬于環境監測領域。
背景技術：
隨著工農業的發展和人類活動的加劇，近年來突發性環境污染事故頻發，因為缺 少在線預警措施，不僅給當地造成極大的經濟損失，還會造成人員傷亡。為了加強河水以及 飲用水源的保護、工業廢水排放等的預警和管理，國際上紛紛出臺相關規定，要求實現水質 的連續毒性控制。但是傳統的毒性試驗都因時間長、費用高，操作繁瑣，不適宜突發環境事 件的預警。因此急需一種快速、簡便、經濟的檢測方法以便給決策者提供參考。隨著環境微生物學的發展，多采用微生物作為指示生物分析水質毒性，其中發 光細菌由于具有較高的靈敏度和操作方便，適于在線分析和應用。國外從20世紀60年 代中期開始研究使用發光細菌檢測環境，80年代美國的貝克曼公司研制了 Microtox檢 驗技術的相關儀器和試劑，在我國直到90年代中期才頒布發光細菌毒性檢測方法(GT/ T15441-1995)。但它們在測量中需要配制一系列的空白和標準液，操作過程復雜、耗時、繁 瑣，只能在實驗室里檢測，而不能用于現場連續原位自動化檢測，極大地削弱了該方法的應 用。所以國內外的研究人員利用發光菌毒性檢測在水環境監測上的優勢研制了不同的發光 菌傳感器用于現場連續原位自動化檢測，比如美國SDI公司研制出Deltatox水質毒性檢測 儀、Hach公司的LumistOX300等，他們都采用將低溫保存的發光菌菌液復蘇后作為檢測液， 這就難免會遇到發光菌發光不穩而出現假陽性，所以近些年有發展了發光菌固定化技術， 比如美國的oak Ridge國家實驗室和Tennessee大學聯合研制了基于生物發光的毒性檢測 芯片，將瓊脂固定的菌膜與電路結合檢測；以色列和韓國的研究者則采用光纖探頭的結構， 把發光細菌固定于裸光纖頂端，或將發光細菌固定于連接光纖的套管中。國內一些研究中 將發光細菌吸附固定于混合纖維膜上，敏感膜與硅光二極管直接相連。但是要運用起來面 臨幾個問題發光細菌世代很短，不能保證其長期穩定的發光；插入凝膠里的光纖探頭檢 測時感光性較差；不能重復利用等。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種基于固定化發光細菌生物敏感元件的水 質急性毒性在線監測的設備。本發明還要解決的技術問題，是提供上述設備對水質急性毒性在線監測的方法。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下—種水質急性毒性在線監測的設備，它包括發光細菌連續培養系統、加樣系統、排 液系統、程序控制系統、光電檢測系統、數據處理與傳輸系統和數據顯示系統；發光細菌連續培養系統由營養液儲備瓶、儲液槽、泵、反應試管和軟管組成；營養 液儲備瓶倒置放置通過軟管與儲液槽相連通，儲液槽通過軟管與反應試管相連通，并由泵控制儲液槽向反應試管8的營養液流加速度，反應試管置于可開合的暗室內，反應試管內 放有1 10粒發光細菌生物敏感元件；加樣系統由樣本槽、泵和軟管組成，樣本槽通過軟管與發光細菌連續培養系統中 的反應試管相連通，并由泵控制樣本向反應試管的流加速度，插入反應試管中的軟管要接 近反應試管的底部；排液系統由廢液槽、泵和軟管組成，廢液槽通過軟管與發光細菌連續培養系統中 的反應試管相連通，并由泵控制反應試管中檢測完畢后的廢液向廢液槽的排放速度，插入 反應試管中的軟管要接近反應試管的底部；光電檢測系統設置在反應試管底部，數據處理與傳輸系統通過線路與光電檢測系 統連接，自動計算相對發光強度，并將數據存儲在數據存儲卡中，數據結果在數據顯示系統 里顯示； 發光細菌連續培養系統、加樣系統、排液系統、光電檢測系統、數據處理與傳輸系 統和數據顯示系統都是由程序控制系統控制實現全自動操作。其中，所述發光細菌生物敏感元件為直徑為凝膠小球；由如下方法制備得到將 發光細菌菌懸液與海藻酸鈉溶液混合均勻，將混合液逐滴滴入到氯化鈣溶液中，固化。上述發光細菌生物敏感元件的制備方法，包括如下步驟(1)將斜面發光細菌菌種接種到ASW培養基中培養15 18小時，培養溫度為18 22°C，轉速為 180 250r/min ；(2)取步驟(1)制得的菌懸液，進行稀釋至光密度為0. 1 0. 6，將稀釋液加入已 滅菌的冷卻的海藻酸鈉溶液中，在18 22°C下混合均勻；(3)將步驟(3)制得的混合液，用注射器逐滴滴入氯化鈣溶液中，然后固化4 6 小時，用蒸餾水清洗，即得。步驟(2)中，優選的條件是，菌懸液，進行稀釋至光密度為0. 1 0. 2。步驟(2)中，所述的海藻酸鈉溶液的濃度為40 80g/L，優選40 50g/L。步驟(2)中，所述稀釋液與所述海藻酸鈉溶液的體積比為1 1 10，優選 1 1 2。步驟(3)中，所述的氯化鈣溶液的濃度為20 30g/L，優選20 23g/L。步驟(3)中，所述混合液與所述氯化鈣溶液的體積比為2 3 100。上述發光細菌生物敏感元件的保存方法，將發光細菌生物敏感元件在4°C條件下 保存于儲液中，所述儲液為含有30 40g/L NaCl和0. 5 lg/L CaCl2的水溶液。其中，所述的光電檢測系統使用的可以是任一種光電傳感器。利用上述設備進行水質急性毒性在線監測的方法，向反應試管內放入3 5粒發 光細菌生物敏感元件，利用發光細菌連續培養系統向反應試管內加入營養液，再利用加樣 系統向反應試管內加入樣本，光電檢測系統檢測發光強度，數據處理與傳輸系統采集數據 并進行數據處理，檢測結束后，由排液系統將反應試管內的廢液排入廢液槽，發光細菌生物 敏感元件繼續保留在反應試管中重復加入發光細菌培養基、加入樣本、檢測發光強度、采集 數據和排液的操作，連續監測7 10天后，更換新的發光細菌生物敏感元件，繼續在線監 測。有益效果本發明的水質急性毒性在線監測裝置結構簡單，成本低廉，操作方便，非專業人員只需經過簡單培訓即可操作和維護；本方法能完全實現水質連續自動化急性毒 性監測，而且靈敏度與國標的發光細菌法相當，極大的簡化監測步驟。使用本裝置和方法為 突發環境事故提供預警及時的采取相應措施，可以極大減少損失。
圖1是本發明的水質急性毒性在線監測設備的結構示意圖。其中，1是營養液儲備 瓶，2是儲液槽，3是樣本槽，4是廢液槽，5是泵，6是泵，7是泵，8是反應試管，9是光電檢測 系統，10是數據顯示系統，11是發光細菌生物敏感元件。圖2是本發明的發光細菌生物敏感元件復蘇后的發光強度圖。圖3是本發明的發光細菌生物敏感元件對蒸餾水連續運行效果圖。圖4是本發明的發光細菌生物敏感元件對pH的響應圖。圖5是本發明的發光細菌生物敏感元件對毒性物質的響應圖。圖6是本發明的發光細菌生物敏感元件重現性實驗。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實 施例所描述的僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發 明。實施例1 發光細菌生物敏感元件的制備。將斜面發光細菌菌種接種到ASW液體培養基中培養16小時左右，培養溫度為 200C，轉速為200r/min ；取上述菌懸液，進行50倍的稀釋，光密度在0. 1左右，將稀釋液加 入已滅菌的冷卻的40g/L海藻酸鈉溶液中，稀釋液與海藻酸鈉溶液的體積比為1 1，在 20°C充分混勻；將上述混合液用注射器逐滴滴入20g/L氯化鈣溶液中固化4小時，混合液與 氯化鈣溶液的體積比為2%，用蒸餾水清洗后浸泡于含有30g/L NaCl和0. 5g/L CaCl2的水 溶液中，放在4°C儲存備用。將保存的發光細菌敏感元件放在20°C的環境下復蘇10分鐘(所述復蘇為將敏感 元件從4°C取出來放在20°C的環境下的過程)，其發光強度如圖2所示。實施例2 水質急性毒性在線監測設備。如圖1所示，水質急性毒性在線監測設備包括發光細菌連續培養系統、加樣系統、 排液系統、程序控制系統、光電檢測系統、數據處理與傳輸系統和數據顯示系統。發光細菌 連續培養系統由營養液儲備瓶1、儲液槽2、泵7、反應試管8和軟管組成；營養液儲備瓶1， 倒置放置通過軟管與儲液槽2相連通，儲液槽2通過軟管與反應試管8相連通，并由泵7控 制儲液槽2向反應試管8的營養液流加速度，反應試管8置于可開合的暗室內。加樣系統 由樣本槽3、泵6和軟管組成，樣本槽3通過軟管與發光細菌連續培養系統中的反應試管8 相連通，并由泵6控制樣本向反應試管8的流加速度，插入反應試管8中的軟管要接近反應 試管8的底部。排液系統由廢液槽4、泵5和軟管組成，廢液槽4通過軟管與發光細菌連續 培養系統中的反應試管8相連通，并由泵5控制反應試管8中檢測完畢后的廢液向廢液槽4 的排放速度，插入反應試管8中的軟管要接近反應試管8的底部。光電檢測系統設置在反應 試管8底部。數據處理與傳輸系統通過線路與光電檢測系統連接，自動計算相對發光強度，并將數據存儲在SD卡中，數據結果在數據顯示系統里顯示，例如加入試劑、樣本、5分鐘、10 分鐘、15分鐘的發光強度和相對發光強度。發光細菌連續培養系統、加樣系統、排液系統、光 電檢測系統、數據處理與傳輸系統和數據顯示系統都是由程序控制系統控制實現全自動操 作。營養液儲備瓶1內裝有營養液，營養液包括如下組分發光細菌的培養基10% (ν/ ν)，CaCl25g/L，NaCl 300g/L，溶劑為水。其中，發光細菌的培養基組分如下(g/mL) :Tryptone 0. 5%, Yeast extract 0. 5%, NaCl 3%, Na2HPO4O. 5%, KH2PO4O. 1%，甘油 0. 3%，溶劑為水。使用時，向反應試管內放入3 5粒用本發明方法制備的發光細菌生物敏感元件，利用發光細菌連續培養系統向反應試管內加入35 μ L營養液，再利用加樣系統向反應試管 內加入315 μ L樣本，光電檢測系統檢測發光強度，每5分鐘、10分鐘和15分鐘，數據處理與 傳輸系統分別采集數據并進行數據處理，檢測結束后，由排液系統將反應試管內的廢液排 入廢液槽，發光細菌生物敏感元件繼續保留在反應試管中重復加入發光細菌培養基、加入 樣本、檢測發光強度、采集數據和排液的操作，連續監測7 10天后，更換新的發光細菌生 物敏感元件，繼續在線監測。實施例3 發光細菌生物敏感元件對蒸餾水的連續運行。采用實施例2所描述的水質急性毒性在線監測設備對蒸餾水的連續監測，監測的 效果如圖3所示。說明隨著測試的進行，菌的生長狀況會隨之發生變化，造成其抑光率發生 變化，但除個別點外，可以在一定的時間內保持相對的穩定，可以根據所測歷史數據計算和 設定動態報警線來消除這種影響，使計算更為準確。實施例4 發光細菌生物敏感元件對ρΗ的響應。采用實施例2所描述的水質急性毒性在線監測設備，進行到100個循環的時候將 樣本槽的樣本換成不同PH的蒸餾水水樣依次進行測試，其效果如圖4所示。說明本發明的 生物元件有一個較寬的PH耐受范圍，能夠抵抗環境中酸堿的影響。實施例5 發光細菌生物敏感元件對毒性物質的響應。采用實施例2所描述的水質急性毒性在線監測設備，進行到100個循環的時候將 樣本槽的樣本換成不同濃度的硫酸鋅水樣依次進行測試，其效果如圖5所示。說明本發明 能夠靈敏的對不同濃度的毒性物質做出響應，并且能很快的恢復隨著暴露濃度的提高恢復 時間相應的延長，為后續的測試提供了保障。實施例6 發光細菌生物敏感元件重現性實驗。用蒸餾水作為樣本進行了 7天的測試，測試的參數為35 μ L營養液，315 μ L樣本， 時間間隔為2分鐘，反應時間15分鐘，連續自動加樣排液，測試的效果如圖6所示。說明在 連續測試的過程中小球能夠連續運行一周的時間而不發生解體，并且發光值也穩定在一個 很好的范圍內，隨著測試時間的延長，會發生自身的衰減從而使抑光率逐漸上升，但是不影 響測試的進行。
權利要求
一種水質急性毒性在線監測的設備，其特征在于它包括發光細菌連續培養系統、加樣系統、排液系統、程序控制系統、光電檢測系統、數據處理與傳輸系統和數據顯示系統；發光細菌連續培養系統由營養液儲備瓶(1)、儲液槽(2)、泵(7)、反應試管(8)和軟管組成；營養液儲備瓶(1)倒置放置通過軟管與儲液槽(2)相連通，儲液槽(2)通過軟管與反應試管(8)相連通，并由泵(7)控制儲液槽(2)向反應試管(8)的營養液流加速度，反應試管(8)置于可開合的暗室內，反應試管(8)內放有1～10粒發光細菌生物敏感元件(11)；加樣系統由樣本槽(3)、泵(6)和軟管組成，樣本槽(3)通過軟管與發光細菌連續培養系統中的反應試管(8)相連通，并由泵(6)控制樣本向反應試管(8)的流加速度，插入反應試管(8)中的軟管要接近反應試管(8)的底部；排液系統由廢液槽(4)、泵(5)和軟管組成，廢液槽(4)通過軟管與發光細菌連續培養系統中的反應試管(8)相連通，并由泵(5)控制反應試管(8)中檢測完畢后的廢液向廢液槽(4)的排放速度，插入反應試管(8)中的軟管要接近反應試管(8)的底部；光電檢測系統(9)設置在反應試管(8)底部，數據處理與傳輸系統通過線路與光電檢測系統(3)連接，自動計算相對發光強度，并將數據存儲在數據存儲卡中，數據結果在數據顯示系統(10)里顯示；發光細菌連續培養系統、加樣系統、排液系統、光電檢測系統、數據處理與傳輸系統和數據顯示系統都是由程序控制系統控制實現全自動操作。
2.根據權利要求1所述的水質急性毒性在線監測的設備，其特征在于所述發光細菌生 物敏感元件(11)為凝膠小球；由如下方法制備得到將發光細菌菌懸液與海藻酸鈉溶液混 合均勻，將混合液逐滴滴入到氯化鈣溶液中，固化。
3.利用權利要求1所述的設備進行水質急性毒性在線監測的方法，其特征在于向反應 試管內放入1 10粒發光細菌生物敏感元件，利用發光細菌連續培養系統向反應試管內加 入營養液，再利用加樣系統向反應試管內加入樣本，光電檢測系統檢測發光強度，數據處理 與傳輸系統采集數據并進行數據處理，檢測結束后，由排液系統將反應試管內的廢液排入 廢液槽，發光細菌生物敏感元件繼續保留在反應試管中重復加入發光細菌培養基、加入樣 本、檢測發光強度、采集數據和排液的操作，連續監測7 10天后，更換新的發光細菌生物 敏感元件，繼續在線監測。
全文摘要
本發明公開了一種水質急性毒性在線監測的設備，它包括發光細菌連續培養系統、加樣系統、排液系統、光電檢測系統、數據顯示系統，且能實現全自動操作。本發明還公開了利用上述設備進行水質急性毒性在線監測的方法。本發明的水質急性毒性在線監測設備結構簡單，成本低廉，操作方便，非專業人員只需經過簡單培訓即可操作和維護；本方法能完全實現水質連續自動化急性毒性監測，而且靈敏度與國標的發光細菌法相當，極大的簡化監測步驟。使用本設備和方法為突發環境事故提供預警及時的采取相應措施，可以極大減少損失。
文檔編號C12Q1/02GK101871927SQ201010200079
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月13日 優先權日2010年6月13日
發明者孫旭, 曹妮妮, 楊柳燕, 肖 琳, 趙背生 申請人:南京大學;深圳市朗石生物儀器有限公司