專利名稱：人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量pcr檢測試劑盒及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒及其制備方法和 用途。屬于生物技術領域。
背景技術：
瞬時受體電位通道(簡稱TRPC)是一種非選擇性陽離子通道家族(包含TRPCl TRPC7)，對鈣離子具有通透性，該家族蛋白具有六個高度保守跨膜區，根據結構和功能的相 似性可以分為 4 個亞組TRPC1 ；TRPC2 ；TRPC3、TRPC6 和 TRPC7 ；TRPC4 和 TRPC5。TRPC 可通 過同源或異源四聚體方式組合構成功能性SOCC通道，后者介導產生SOCE引起細胞鈣內流， TRPC表達異常引起SOCE的變化影響細胞生命活動，參與多種良惡性疾病，例如呼吸系統 疾病哮喘、慢性阻塞性肺疾病、特發性肺動脈高壓；心血管系統疾病心肌肥大、高血壓、 脈管炎；泌尿系統疾病局灶性節段性腎小球硬化癥；神經系統疾病神經退行性變、肌營 養不良；免疫系統疾病T/B細胞免疫反應(炎癥反應)和腫瘤疾病肝癌、前列腺癌、乳腺 癌、卵巢癌、胃癌和食管癌等。尤其是TRPC基因表達在腫瘤發生發展中的作用開始受到廣 泛關注。因此，闡明TRPC的分子機理對于各種疾病的診斷和治療至關重要。實時熒光定量聚合酶鏈反應技術(RT-qPCR)是指在PCR反應體系中加入熒光基 團，實時收集累積熒光信號強度監測整個PCR進程，建立實時擴增曲線并確定Ct值，最后通 過標準曲線對未知模板進行始點定量分析的方法。具有靈敏度高、特異性強、線性關系好、 操作簡單等優點，可高通量的進行基因定量檢測及相對表達分析。廣泛應用于人類各種疾 病的基因快速檢測、早期診斷、基因分型等方面。目前采用該方法進行基因定量分析首先需 要設計、合成基因特異性的引物，并反復對該引物進行效率和特異性的檢測，最終篩選出合 適的引物。因此，過程相對繁瑣、耗時、操作性低。
發明內容
本發明的第一個目的，是為了提供一種人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢 測試劑盒。本發明的第二個目的，是為了提供一種人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢 測試劑盒的制備方法。本發明的第三個目的，是為了提供一種人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢 測試劑盒的用途。本發明的第一個目的可以通過如下措施達到人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒，它包括盒體，在盒體內設有 反應板和陽性對照品，其特征在于在反應板中設有若干反應孔，所述反應板包括熒光定量 PCR標準曲線反應板和熒光定量PCR待測樣品反應板；在熒光定量PCR標準曲線反應板、熒 光定量PCR待測樣品反應板中設有目的基因TRPCl TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液，所述目的基因TRPCl TRPC7反應混合液包括TRPCl TRPC7基因引物序列、 SYBR熒光染料、DNA聚合酶和反應離子緩沖液，所述內參基因IP08反應混合液包括IP08基 因引物序列、SYBR熒光染料、DNA聚合酶和反應離子緩沖液；所述目的基因TRPCl TRPC7 反應混合液和內參基因IP08反應混合液設置在反應孔中。本發明以Gene Bank中瞬時受體電位通道(TRPC)基因轉錄產物(信使核糖核酸， mRNA)為模板，設計、合成人TRPC基因引物，通過標準化實時熒光定量聚合酶鏈反應技術， 篩選出高效、特異的TRPC基因引物，并將這些引物同其它PCR反應成分制作成的瞬時受體 電位通道(TRPC)基因熒光定量檢測試劑盒。本發明的第一個目的還可以通過如下措施達到本發明第一個目的進一步實施方案是，其特征是1)所述TRPCl基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ IDNa 1所示；2)所述TRPC2基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 2所示；3)所述TRPC3基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 3所示；4)所述TRPC4基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 4所示；5)所述TRPC5基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 5所示；6)所述TRPC6基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 6所示；7)所述TRPC7基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 7所示；8)所述IP08基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID Na 8所示。本發明第一個目的進一步實施方案，其特征是陽性對照品為人腦組織cDNA。本發明第一個目的進一步實施方案，其特征是所述熒光定量PCR標準曲線反應 板、熒光定量PCR待測樣品反應板各設有96個反應孔，構成96孔板。本發明的第二個目的可以通過采取如下技術方案達到人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括 如下步驟1)制備盒體和安置于盒體內的熒光定量PCR標準曲線反應板和熒光定量PCR待測 樣品反應板，在所述的熒光定量PCR標準曲線反應板和熒光定量PCR待測樣品反應板中按 區域設置目的基因TRPCl TRPC7和內參基因IP08的反應孔，每個樣品設置一個重復孔； 每個基因設置兩個無模板陰性對照-NTC ；2)設計目的基因TRPCl TRPC7及內參基因IP08引物，測定所述引物的效率與特 異性；3)將所測引物分別與SYBR熒光染料、DNA聚合酶和反應離子緩沖液混合，分別構 成目的基因TRPCl TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液；4)將目的基因TRPCl TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液分別加于 在前述對應反應孔中，構成目的基因TRPCl TRPC7及內參基因IP08熒光定量PCR各反應 板；5)制備人腦組織cDNA為.TRPCl TRPC7基因陽性對照樣品，檢測時取該樣品按 2倍倍比稀釋成5個濃度梯度后加于標準曲線反應板的反應孔中，構成梯度反應孔。本發明的第三個目的可以通過采取如下技術方案達到人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒的用途，其特征是可用于人
4類TRPC基因相關良惡性疾病的分析研究。本發明的有益效果是本發明提供一種人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑盒制 作、保存方便，操作性及重復性好，可以根據TRPC基因研究重點的不同進行多樣化設計，能 夠一次性完成多基因多樣本的TRPC相對定量分析。歸納出如下有益效果1、高效、特異試劑盒反應板的混合液中含有特異的TRPCl TRPC7基因引物，可 高效的進行TRPC基因定量分析。解決了研究者設計、合成、篩選TRPC基因引物的困難問題。2、定量準確可靠各基因實際引物效率可通過試劑盒中人腦組織cDNA(陽性對 照)檢測，避免了實際效率與參考效率之間差異所帶來的計算誤差。3、操作方便研究者在使用過程中，僅需加入推薦量的待測cDNA樣品便可一次性 完成所有T RPC定量分析，簡化了 PCR反應體系的制備。4、模塊化設計反應板的制作(樣品檢測數量、焦點TRPC基因)可根據研究要求 進行變更。5、制作簡單，操作性強，保存、運輸方便，適用范圍廣。
圖Ia是本發明試劑盒的陽性對照品的結構示意圖。圖Ib是本發明試劑盒的反應板的結構示意圖。圖Ic是本發明試劑盒的熒光定量PCR標準曲線反應板的結構示意圖。圖Id是本發明試劑盒的熒光定量PCR待測樣品反應板的結構示意圖。其中，圖Ic中-1，-2，-3，-4，-5表示TRPC和IP08基因引物標準曲線5梯度等比稀釋 孔；NTC表示無模板陰性對照。a、b、c、d、e、f、g和h分別對應為=TRPCU TRPC2、TRPC3、 TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7 禾口 IP08。圖Id中:sl, s2, s3, s4, s5表示待測樣品；NTC表示無模板陰性對照。a、b、c、 d、e、f、g 禾Π h 分別對應為TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6、TRPC7 和 IP08。圖2a是本發明內參基因IP08熒光定量PCR標準曲線圖。
圖2b是本發明內參基因IP08熒光定量PCR擴增曲線圖。
圖2c是本發明內參基因IP08熒光定量PCR產物融解曲線圖
圖2d是本發明內參基因IP08熒光定量PCR產物序列測定圖。
圖2e是本發明內參基因IP08熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖3a是本發明目的基因TRPCl熒光定量PCR標準曲線圖。
圖3b是本發明目的基因TRPCl熒光定量PCR擴增曲線圖。
圖3c是本發明目的基因TRPCl熒光定量PCR產物融解曲線圖。
圖3d是本發明目的基因TRPCl熒光定量PCR產物序列測定圖。
圖3e是本發明目的基因TRPCl熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。
圖4a是本發明目的基因TRPC2熒光定量PCR標準曲線圖。
圖4b是本發明目的基因TRPC2熒光定量PCR擴增曲線圖。
圖4c是本發明目的基因TRPC2熒光定量PCR產物融解曲線圖。
圖4d是本發明目的基因TRPC2熒光定量PCR產物序列測定圖。圖4e是本發明目的基因TRPC2熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖5a是本發明目的基因TRPC3熒光定量PCR標準曲線圖。圖5b是本發明目的基因TRPC3熒光定量PCR擴增曲線圖。圖5c是本發明目的基因TRPC3熒光定量PCR產物融解曲線圖。圖5d是本發明目的基因TRPC3熒光定量PCR產物序列測定圖。圖5e是本發明目的基因TRPC3熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖6a是本發明目的基因TRPC4熒光定量PCR標準曲線圖。圖6b是本發明目的基因TRPC4熒光定量PCR擴增曲線圖。圖6c是本發明目的基因TRPC4熒光定量PCR產物融解曲線圖。圖6d是本發明目的基因TRPC4熒光定量PCR產物序列測定圖。圖6e是本發明目的基因TRPC4熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖7a是本發明目的基因TRPC5熒光定量PCR標準曲線圖。圖7b是本發明目的基因TRPC5熒光定量PCR擴增曲線圖。圖7c是本發明目的基因TRPC5熒光定量PCR產物融解曲線圖。圖7d是本發明目的基因TRPC5熒光定量PCR產物序列測定圖。圖7e是本發明目的基因TRPC5熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖8a是本發明目的基因TRPC6熒光定量PCR標準曲線圖。圖8b是本發明目的基因TRPC6熒光定量PCR擴增曲線圖。圖8c是本發明目的基因TRPC6熒光定量PCR產物融解曲線圖。圖8d是本發明目的基因TRPC6熒光定量PCR產物序列測定圖。圖8e是本發明目的基因TRPC6熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖9a是本發明目的基因TRPC7熒光定量PCR標準曲線圖。圖9b是本發明目的基因TRPC7熒光定量PCR擴增曲線圖。圖9c是本發明目的基因TRPC7熒光定量PCR產物融解曲線圖。圖9d是本發明目的基因TRPC7熒光定量PCR產物序列測定圖。圖9e是本發明目的基因TRPC7熒光定量PCR瓊脂糖凝膠電泳圖。圖IOa是本發明目的基因TRPCl和TRPC6在NSCLC組織中的表達示意圖。圖IOb是本發明目的基因TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5和TRPC7在NSCLC組織中 的表達示意圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例、應用實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述具體實施例參照圖la、圖lb、圖Ic和圖ld，本實施例包括盒體，在盒體內設有反應板1和陽性 對照品2，在反應板1中設有六組反應孔3，反應板1包括熒光定量PCR標準曲線反應板11 和熒光定量PCR待測樣品反應板12 ；在熒光定量PCR標準曲線反應板11、熒光定量PCR待 測樣品反應板12中設有目的基因TRPCl TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液， 目的基因TRPCl TRPC7反應混合液包括TRPCl TRPC7基因引物序列、SYBR熒光染料、
6DNA聚合酶和反應離子緩沖液，內參基因IP08反應混合液包括IP08基因引物序列、SYBR熒 光染料、DNA聚合酶和反應離子緩沖液；所述目的基因TRPCl TRPC7反應混合液和內參基 因IP08反應混合液設置在反應孔3中。本實施例中，所述陽性對照品2為人腦組織cDNA。所述熒光定量PCR標準曲線反 應板11、熒光定量PCR待測樣品反應板12均為96孔板，每個待測基因設置無模板陰性對照 NTC，每個樣品設置重復反應孔3，可同時對5個樣品進行TRPCl TRPC7和IP08基因的檢 測。本實施例所述的人瞬時受體電位通道蛋白(TRPC)熒光定量PCR檢測試劑盒主要 是通過以下技術方案來實現的1、TRPCl 7基因及內參基因IP08引物設計與合成；2、引 物效率與特異性測定3、目的基因TRPCl 7及內參基因IP08熒光定量PCR各反應板的制 備；4、TRPCl 7基因陽性對照(人腦組織cDNA)的制備。具體如下1. TRPCl 7基因及內參基因IP08引物設計與合成參照表1，以GeneBank目的基因TRPCl TRPC7及IP08內參基因轉錄產物(mRNA) 為模板設計相應引物，設計方法采用Primerf在線設計軟件引物送大連TAKARA公司合成。表1人TRPC及IP08引物信息表
權利要求
人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒，它包括盒體，在盒體內設有反應板(1)和陽性對照品(2)，其特征是在反應板(1)中設有若干反應孔(3)，所述反應板(1)包括熒光定量PCR標準曲線反應板(11)和熒光定量PCR待測樣品反應板(12)；在熒光定量PCR標準曲線反應板(11)、熒光定量PCR待測樣品反應板(12)中設有目的基因TRPC1～TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液，所述目的基因TRPC1～TRPC7反應混合液包括TRPC1～TRPC7基因引物序列、SYBR熒光染料、DNA聚合酶和反應離子緩沖液，所述內參基因IP08反應混合液包括IP08基因引物序列、SYBR熒光染料、DNA聚合酶和反應離子緩沖液；所述目的基因TRPC1～TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液設置在反應孔(3)中。
2.根據權利要求1所述的人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征是1)所述TRPCl基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQIDNo 1所示；2)所述TRPC2基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 2所示；3)所述TRPC3基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 3所示；4)所述TRPC4基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID Na 4所示；5)所述TRPC5基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 5所示；6)所述TRPC6基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID Na 6所示；7)所述TRPC7基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQID No 7所示；8)所述IP08基因引物序列的核苷酸序列如序列表SEQ ID No 8所示。
3.根據權利要求1或2所述的人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒，其 特征是所述熒光定量PCR標準曲線反應板(11)、熒光定量PCR待測樣品反應板(12)各設 有96個反應孔(3)，構成96孔板。
4.人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒的制備方法，其特征在于包括如 下步驟1)制備盒體和安置于盒體內的熒光定量PCR標準曲線反應板(11)和熒光定量PCR待 測樣品反應板(12)，在所述的熒光定量PCR標準曲線反應板(11)和熒光定量PCR待測樣品 反應板(12)中按區域設置目的基因TRPCl TRPC7和內參基因IP08的反應孔(3)，每個樣 品設置一個重復孔；每個基因設置兩個無模板陰性對照-NTC ；2)設計目的基因TRPCl TRPC7及內參基因IP08引物，測定所述引物的效率與特異性；3)將所測引物分別與SYBR熒光染料、DNA聚合酶和反應離子緩沖液混合，分別構成目 的基因TRPCl TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液；4)將目的基因TRPCl TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液分別加于在前 述對應反應孔中，構成目的基因TRPCl TRPC7及內參基因IP08熒光定量PCR各反應板；5)制備人腦組織cDNA為.TRPCl TRPG7基因陽性對照樣品，檢測時取該樣品按2倍 倍比稀釋成5個濃度梯度后加于標準曲線反應板(11)的反應孔(3)中，構成梯度反應孔。
5.人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒的用途，其特征是用于人類 TRPC基因相關良惡性疾病的分析研究。
全文摘要
本發明涉及人瞬時受體電位通道蛋白熒光定量PCR檢測試劑盒及其制備方法和用途，包括盒體，在盒體內設有反應板(1)和陽性對照品(2)，其特征是在反應板(1)中設有若干反應孔(3)，反應板(1)包括熒光定量PCR標準曲線反應板(11)和熒光定量PCR待測樣品反應板(12)；在熒光定量PCR標準曲線反應板(11)、熒光定量PCR待測樣品反應板(12)中設有目的基因TRPC1～TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液；所述目的基因TRPC1～TRPC7反應混合液和內參基因IP08反應混合液設置在反應孔(3)中。本發明具有制作、保存方便，操作性及重復性好的特點，可以根據TRPC基因研究重點的不同進行多樣化設計，能夠一次性完成多基因多樣本的TRPC相對定量分析。
文檔編號C12Q1/68GK101948912SQ20101019881
公開日2011年1月19日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者何建行, 盧文菊, 張奇, 張晨婷, 張雅潔, 王健 申請人:廣州醫學院第一附屬醫院;廣州呼吸疾病研究所