專利名稱：一種與水稻抗逆性相關的OsGRAS1基因、其啟動子及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種與水稻抗逆性相關的基因，具體地說，涉及一種新的水稻抗逆相關基因OsGRASI、其啟動子GRASlP及其應用，屬于基因工程領域。
背景技術：
水稻是我國的主要糧食作物之一，提高水稻的抗逆性對保障我國糧食產量穩定具有重要意義。利用基因工程這一分子育種技術，將抗逆基因轉入當前廣泛應用的優良水稻品種中，從而改良其抗逆性，培育既抗逆又高產優質的農作物新品種是水稻抗逆育種的有效途徑之一。利用轉錄因子來調節植物對逆境的響應是提高作物抗逆性的一個研究熱點。在環境脅迫下，植物體通過信號傳導，啟動或關閉某些相關基因，以達到抵抗逆境的目的。植物感受干旱，干旱脅迫信號經過一系列傳遞過程，最后誘導特定功能基因的表達。至今，已克隆出一些與植物抗逆相關的轉錄因子。擬南芥中，已發現的轉錄因子有DREBlA C和 DREB2A B，CBFl 3、Hs、AtGluR2、ATHB6、SCOF-U Atmyb2 等，水稻中的 OsSNACl (Hu et al.，2006，)，煙草中的Tsil等也為重要的轉錄因子。通過確定與植物抗逆性有關的信號傳導中起關鍵作用的調控因子，從這些關鍵的調控因子著手，就有可能通過轉基因方法有效地綜合提高作物抗逆性。GRAS 轉錄因子家族為植物所特有，包括 GAI(gibberellic acid insensitive), RGA(repressor of GA1-3), SCL(scarecrow like)三大類，具有多變的 N-端和保守的 C-端(Di Laurenzio et al. 1996 ；Peng et al. 1997 ；Silverstone et al. 1998 ；Pysh et al. 1999 ；Bolle 2004)。GRAS基因家族產物在C-端有顯著的相似性，在大約110氨基酸殘余N-端有高度保守的VHllD序列。保守的C端的結構域特點是含兩個富含亮氨酸區域 (LHRI及LHRII)及3個不同的氨基酸標簽VHIID、PFYRE及SAW。VHllD序列在家族的成員中已被廣泛認識，盡管它不是絕對的保守纈氨酸的替換，異亮氨酸和亮氨酸在1，3，4位置上發生置換，在VHllD模體的較大的區域內，P-N-H-D-Q-L殘基是絕對保守的。PFYRE模體沒有VHllD和SAW模體那么高度保守，但在此結構域中，序列表現較大的共線性，表明在家族成員間序列相似性水平較高。SAW模體主要有三對保守位點R_E，W-G和W-W，其中W-W 是絕對保守的，W-G和W-W之間的間隔則不是保守的。到目前為止，已經分別從水稻和擬南芥中發現了 57和33個GRAS基因，作為轉錄因子。GRAS蛋白參與植物根及腋芽的發育，根輻射方向結構分布，光信號轉導，植物激素赤霉素信號轉導和植物高度控制等多種重要的生理和發育過程。番茄的Lateral Suppressor (Ls)基因是GRAS家族成員，該基因控制著番茄的側枝形成(Schumacher et al.，1999)。我國科學家克隆的控制水稻分蘗的基因MOCl也屬GRAS家族，MOCl主要在腋芽中表達，功能是促進分蘗和促進腋芽的生長(Li et al.，2003)。本發明中的OsGRASI序列與該家族的其它成員比對結果表明，該基因具有該家族典型的結構域，屬SCL類型。本發明OsGRASI基因克隆自水稻第4染色體的抗旱QTL區段， 在干旱、鹽、外源ABA處理下的基因表達譜分析表明，該基因可響應逆境脅迫，該基因啟動子OsGRASIP可調節基因對逆境的響應程度。
發明內容
本發明的目的在于提供一種新的水稻抗逆相關基因OsGRASl，具有該家族典型的結構域，屬SCL類型，可響應逆境脅迫。本發明的另一目的在于提供所述水稻抗逆相關基因OsGRASl的啟動子GRAS1P，該基因啟動子OsGRASIP可調節基因對逆境的響應程度。本發明的再一目的是提供含有水稻基因OsGRASl在提高水稻抗逆性中的應用。本發明從水稻中分離克隆的一段完整編碼區段的DNA片段，對這個基因編碼的蛋白序列進行分析表明，它具有植物特有GRAS轉錄因子家族的保守結構域，因此命名為 OsGRASl。本發明分離和應用一種包含OsGRASl基因的DNA片段，該基因能響應冷、鹽、外源 ABA和PEG脅迫處理，發生表達變化。本發明所述OsGRASl基因DNA序列為序列表SEQ ID NO. 1所示，或者與SEQID NO. 1 至少90%同源的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO. 1所示序列的亞片段。優選為，本發明與水稻抗逆性相關的OsGRASl基因，是SEQ ID NO. 1中第16_1擬6 位所示的DNA序列和相似性達90 %的DNA序列。本發明所述基因的編碼蛋白的氨基酸序列為序列表SEQ ID N0. 2所示，或者SEQ ID N0. 2序列的同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體，在高或低的嚴謹條件下能與水稻OsGRASl相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白。可以采用已克隆的OsGRASl基因為探針，從cDNA文庫和基因組文庫中篩選得到本發明的基因或同源基因。也可以采用PCR(polymerase chain reaction)技術，從基因組， mRNA和cDNA中擴增得到本發明的OsGRASl基因以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術，可以分離得到包含OsGRASl基因和OsGRASIP啟動子的序列，將這一序列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體連接后轉化植物，可獲得對逆境響應的轉基因植株。本發明還提供了一種載體，它包含上述的DNA分子。攜帶本發明OsGRASl基因的表達載體可通過使用Ti質粒，植物病毒載體，直接DNA 轉化，微注射，電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞。本發明OsGRASl基因表達載體轉化宿主是包括水稻在內的多種植物。本發明從水稻中分離克隆了 OsGRASl的上游調控區，并命名為啟動子OsGRASIP。本發明所述OsGRASl基因的啟動子OsGRASIP序列為序列表SEQ ID N0. 3所示，或者基本上相當于SEQ ID N0. 3所示的70%同源的DNA序列。優選為，所述OsGRASl基因的啟動子OsGRASIP序列是SEQ ID N0. 3所示l_1370bp 序列和相似性達70 %的DNA序列。本發明所述OsGRASIP啟動子序列與120份水稻材料同源序列中的其它三種序列類型相比，缺少一個CAAT-box，多出一個TATAbox，和三個順式作用兀件，即一 個 MYB1LEPR(regulates defence-related gene expression), 一個 NTBBF1ARR0LB(Required for tissue-specific expression and auxin induction) 和一個 0SE2R00TN0DULE(organ-specific elements (OSE) characteristic of the promotersactivated in infected cells of root nodules)。本發明所述OsGRASIP啟動子能在冷、鹽、外源ABA和PGE處理下調節OsGRASI基因的表達。可采用已克隆的OsGRASIP啟動子為探針，從基因組文庫中篩選得到本發明的啟動子片段或其同源序列。也可以采用PCR技術，從基因組中擴增得到本發明的OsGRASIP啟動子片段以及任何感興趣的一段DNA或與其同源的一段DNA。采用以上技術，可以分離得到包含OsGRASIP啟動子的序列，將這一序列與任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體連接后轉化植物，可獲得對逆境響應的轉基因植株。本發明OsGRASIP啟動子可響應逆境，調節下游基因表達。因此以本發明OsGRASIP 啟動子與任何感興趣的基因構建的植物表達載體，可使其下游基因在逆境下的表達發生變化。本發明通過對水稻基因分離克隆及其對逆境脅迫的響應，提供了一種水稻DNA片斷包含一個1934bp的編碼基因OsGRASI及其啟動子OsGRASIP。該基因含有GRAS基因家族保守結構域，為該基因家族SCL類型成員。OsGRASI基因受干旱、鹽及外源ABA誘導表達， 與水稻抗逆性相關。OsGRASIP啟動子序列的差異使其下游OsGRASI基因受干旱、鹽及外源 ABA處理上調表達的響應時間及表達量發生變化，該啟動子可用作逆境脅迫誘導的基因調控元件。本發明可以用于研究利用此基因遺傳轉化獲得轉基因植物的分子方法，及該啟動子序列差異對此基因表達的影響。本發明的水稻基因及其啟動子對逆境產生明顯響應，可應用于在植物抗逆育種， 提高植物的抗逆性。
圖1-1和圖1-2分別為本發明的OsGRASI基因在苗期及幼穗分化期不同干旱條件下的表達水平；圖2為本發明的OsGRASI基因在苗期冷、鹽、PEG和外源ABA處理下的表達水平；圖3為本發明利用ClustalW2軟件將OsGRASI基因預測的蛋白序列與同源蛋白序列進行比對的結果；圖4為本發明的OsGRASI基因超表達載體轉化水稻植株的Southern blot檢測；圖5為本發明的OsGRASI基因超表達載體轉化水稻植株的表達水平檢測；圖6為本發明的OsGRASIP啟動子四種不同序列類型的比對結果；圖7-1，圖7-2，圖7-3，圖7_4分別為本發明的OsGRASIP啟動子四種不同序列類型 I，II，III，IV在冷、鹽、外源ABA和PEG處理下，對其下游GRASl基因表達水平的調控。
具體實施例方式下述實施例進一步描述本發明，但所述實施例僅用于說明本發明而不是限制本發明。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換， 均屬于本發明的范圍。下述實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1水稻基因OsGRASI在脅迫條件下的表達分析1.干旱脅迫處理苗期IRAT109種子催芽后，在發芽盒內水培生長。三葉期后施加營養液(國際水稻所標準營養液)。待幼苗長至4葉后開始干旱處理。共設4種旱處理和對照。旱處理的方法是將幼苗從營養液中取出，用吸水紙吸干根表面水分后，置于干凈濾紙上，在生長箱內 (T = ^°C，RH = 70%，遮光)放置30min，3h，8h和20h，然后快速剪取葉片和根，投入液氮中冷凍后于_80°C保存用于RNA提取。幼穗分化期采用PVC根管法。根管內徑20cm，高100cm，內裝入細沙。將IRAT109 種植在根管內，根管置于抗旱大棚內。分別設有水對照和干旱脅迫兩種處理。有水對照保持根管表土濕潤。干旱處理于植株開始進入幼穗分化時斷水，同時去除根管管壁上小孔處的膠塞，以便排除根管內水分。分別于斷水后2周(土壤含水量25% )、4周(土壤含水量 13% )剪取劍葉、未抽出的幼穗及根，經液氮冷凍后于_80°C保存備用。2.冷、鹽、外源ABA和鹽脅迫處理種子催芽后，在發芽盒內水培生長。三葉期后施加營養液(國際水稻所標準營養液)。在^°C，Wh/8h的光照培養室中培養一個月，當水稻苗長到三葉一心時做如下不同處理冷脅迫，4°C 處理 0h，0. 5h，6h，12h ；鹽脅迫，200mmol/LNaCl 處理 lh, 6h, 12h, 24h ；ABA 處理，100umol/L ABA (脫落酸)溶液均勻地噴曬到水稻葉片上處理0h，0. 5h，3h，12h,24h, 20% PEG 模擬干旱處理 Oh，0. 5h，3h，12h，24h，48h。3. RNA提取與第一鏈cDNA合成采用植物葉RNA小量抽提試劑盒(離心柱法，上海華舜生物技術有限公司)分別提取苗期與生長后期各處理和對照的葉片、穗和根的總RNA，并測定各樣品的RNA濃度 (Beckman Coulter DU 640)。每個樣品取 15ug進行DNAase I (Invitrogen 公司和 Takara 公司)消化，除去RNA中殘留的DNA。用反轉錄試劑盒(Promega公司)將去除了 DNA的RNA 樣品反轉錄合成cDNA第一鏈，于_20°C保存備用。4.半定量與定量PCR分析苗期與幼穗分化期的旱脅迫處量樣品采用半定量PCR法分析以水稻持家基因Actin(GenBank accession No. AY212324)為參照基因，根據其cDNA序列設計上游引物 Acf :5，-CTTCCTCATGCCATCCTGC-3，(SEQ ID N0. 4)和下游引物 Acr 5，-GCAAGCTTCTCCTTGATGTCC-3，(SEQ ID N0. 5)。分別設置 25、27、29、31 四個 PCR 循環數進行RT-PCR，從每個樣品中擴增持家基因。嚴格控制PCR反應體系的配制，確保各PCR管內體系的一致性。各取IOuIPCR產物，在3%的TAE凝膠中電泳。DNA擴增帶成像后，分析各條帶的強度(Intensity)，確定各樣品的最佳擴增循環數。然后，分別以各樣品cDNA為模板，擴增 OsGRAS 1 基因片段，擴增前引物 Gf 1 為5 ‘ TGAACGCATCCAAGGGTATGACAAGGT3 ‘ (SEQ ID NO. 6)，擴增后引物 Grl 為5' AGGGCGGAATCCCGGCTGTGGTAAGTC3 ‘ (SEQ ID NO. 7)。 同時擴增參照基因Actin，取IOuIPCR產物，在3%的TAE凝膠中電泳。DNA擴增帶成像后， 分析各條帶的強度antensity)，以抗旱EST對參照基因的相對強度作為該基因的表達量。 結果表明，OsGRASI基因在苗期和幼穗分化期干旱處理后，表達量均有明顯提高。對苗期的IRAT109進行干旱處理0. 5h，;3h，8h，20h，分別對OsGRASI在葉中及根中的表達進行分析 (圖1-1)。發現OsGRASI基因在葉中的表達量在0. 5h時有所下降，其后呈上升趨勢，并且在干旱脅迫處理20h時達到最大。在根中的表達量呈上升趨勢，并且在干旱脅迫處理他時達到最大，在20h又有所下降。對幼穗分化期進行干旱處理2周和4周，分別對OsGRASI在葉、根及穗中的表達進行分析(圖1-2)，發現干旱處理后在葉、根、幼穗中表達量均有明顯提高，表達量最高時都能達到水處理的5-7倍。在干旱處理2周時，葉中OsGRASI基因的表達呈現上升趨勢，并且在干旱4周的時候達到最大，是同時期水處理的7倍。根中OsGRASI 基因的表達也呈現上升趨勢，并且響應時間比葉中更短，在干旱2周的時候即達到最大值。冷、鹽、外源ABA和PEG脅迫處理樣品采用定量PCR法分析PCR反應使用美國 ABI PRISM 7000定量PCR儀，使用Takara公司的定量PCR試劑盒。每一個PCR反應重復三次。反應體系包含STOR Premix Ex TaqT、2X) 12. 5 μ 1，正反向引物各0. 5 μ 1，各種處理的cDNA模板1 μ 1，加水補足體積至20μ 1。反應條件如下反應條件如下95°C lmin，然后在95°C 15s，62°C lmin，循環40次，在每個循環中62°C Imin讀取熒光值，同時進行ROX值校正，最后添加熒光PCR產物融解曲線分析，其他具體操作按儀器使用說明書。定量分析結果顯示(圖2)，在鹽、外源ABA及PEG處理下，OsGRAS 1基因的表達量總體上呈現上升表達的趨勢。鹽脅迫下，OsGRASI基因的表達量隨時間延長，表達量上升。 外源ABA處理，OsGRASI基因的表達在30min內就達到對照的2倍，并持續到處理池。在此之后表達量有所下降，但仍高于對照。在PEG處理的早期(30min)，OsGRASl基因表達有所下降，隨后明顯增加，在處理4 時達到最高，是對照的3倍。OsGRASl基因受到冷脅迫呈下降表達，表達量隨處理時間的延長而減少。實施例2水稻OsGRAS 1基因的克隆1.幼苗培育水稻(品種為“IRAT109”，國外引進的旱稻品種)為上海市農業生物基因中心種質資源庫收集保存，將水稻置于35°C萌發48小時，然后播種于溫室中，待水稻葉片為3-5片時，準備抽取DNA或RNA。2. RNA的分離按照實施例1中的方法提取RNA。3.基因的全長克隆通過PlantQTL-GE查詢獲得水稻第4染色體抗旱QTL區間(R1C41-RM349)內的抗旱相關EST。根據其中一條EST(Geneband accesionNo :CB096362)的序列信息，對水稻基因組及全長基因數據庫進行BLAST搜索，獲得其對應的全長cDNA(AK100784)和預測基因 Loc_0s04g50060。根據預測信息設計上下游引物 Gf2 (5，GAAGATTCAAGAGTCATGTT3，) (SEQ ID N0. 8)和 Gr2(5，ACAGTTTGCTAGTTTGGTTCC3，)(SEQ ID NO. 9)，從 cDNA 中直接克隆獲得了 OsGRASl基因(1934bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在 ABI3730 測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序。測序結果經BLAST比對確認。4.水稻OsGRASI蛋白的序列信息與同源性分析本發明新的水稻OsGRASI全長cDNA的長度為1911bp，詳細序列見SEQ IDN0. 1第 16-1926bp。根據全長cDNA推導出水稻OsGRASI的氨基酸序列，共636個氨基酸殘基，分子量為71655. 98道爾頓，等電點(pi)為5. 51。詳細序列見SEQID NO. 2。將OsGRASl蛋白序列與已克隆的植物GRAS基因氨基酸序列進行比對(ClustalW2，在線比對http://WWW. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html)，結果見圖3，GRAS家族高度保守的區域主要包括5個可識別的模體，在VHIID和SAW模體中絕對保守的堿基已用粗體標示，PFYRE模體中的P-F-Y-R-E也用粗體標示。本發明OsGRASl具有GRAS家族特有的模體保守位點，聚類分析顯示，OsGRASl為SCL類型的GRAS基因。實施例3水稻基因OsGRASl超量表達轉化水稻1.利用GATEWAY重組克隆技術構建含OsGRASl基因的超量表達載體以實施例1中已獲得含有旱稻IRAT109的OsGRASl基因的pGEMT-Easy載體為模板，用前引物 Gf3 :5' AAAAAGCAGGCTATGTTGGATTCTGGTT 3' (SEQ ID N0. 10)，后引物 Gr3 5' AGAAAGCTGGGTCTAGTTTGGTTCCCAT 3' (SEQ ID N0. 11)進行第一輪 PCR 擴增。再利用通用引物 attBl adapter :5，-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-3，(SEQ ID N0. 12)。 attB2adapter :5，-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT-3(SEQ ID NO. 13)進行第二輪PCR擴增，擴增產物經回收純化后，通過BP反應，將擴增產物片斷克隆到入門載體PD0NR207，篩選陽性克隆，通過LR反應，將目的基因重組克隆到GATEWAY超表達載體pCB4004 (該載體是在中國科技大學向征斌研究員贈送的PCB2004基礎上，將BASTA抗性基因(除草劑抗性基因) 替換為潮霉素抗性基因改造而來，命名為PCB4004)。具體過程如下(1)第--輪PCR擴增
步驟時間溫度循環次數
預變性2分鐘98 0C1
變性10秒98 0C
退火10秒60 0C10
延伸1分鐘/xkb 68/72 0C
(2)第二二輪PCR擴增
取上述PCR產物IOul作為模板
步驟時間溫度循環次數
預變性1分鐘95 0C1
變性15秒94 0C
退火30秒45 0C5
延伸1分鐘/xkb 68/72 0C
然后設置下一步的PCR程序。
步驟時間溫度循環次I
變性15秒94 0C
退火30秒55 0C15-20X
延伸1 分鐘/kb68/72 "C最后取5ul電泳檢測PCR質量。(3) PCR產物的純化采用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)進行純化。(4) BP重組反應BP反應的目的在于將含有線性attB表達克隆或attB接頭的PCR產物克隆到含有attP的供體載體上以產生入門克隆。重組反應可在0. 5ml的離心管中進行，室溫配制混勻。組分用量attB-PCR 產物(> IOng)l_7ulpD0NR207 載體(150ng/ul)Iul5X BP重組反應液2ulTE 緩沖液(pH 8.0)至 IOul25°C溫浴l_16h。隨后，在混合液中加Iul蛋白酶K 37°C溫浴IOmin終止反應。最后取l-5ul BP反應液轉化大腸桿菌。重組大腸桿菌需在含慶大霉素平板上生長。挑取陽性克隆，進行PCR驗證，然后抽提質粒。(5) LR重組反應重組反應可在0. 5ml的離心管中進行，室溫配制混勻。組分用量入門克隆(50_150ng)l_7ul目的載體(150ng/ul)Iul5X LR重組反應液2ulTE 緩沖液(pH 8. 0)至 IOul25°C溫浴l_16h。隨后，在混合液中加Iul蛋白酶K 37°C溫浴IOmin終止反應。最后取l-5ul LR反應液轉化大腸桿菌。重組大腸桿菌需在含卡那平板上生長。挑取陽性克隆，進行PCR驗證，然后抽提質粒。2.農桿菌轉化根癌農桿菌(EHA105)感受態細胞的制備根癌農桿菌菌液于培養至0D600 = 0. 5時，4°C離心收集菌體，用500 μ 1、 0. lmol/L冰浴CaC12重懸，冰浴30min后離心，去上清，用IOOul, 0. lmol/L冰CaC12重懸后，于4°C保存。農桿菌轉化(凍融法)(1)向感受態農桿菌(IOOul)中加入5ul植物表達載體質粒DNA，輕輕混勻，冰水浴30min后，于液氮中速凍冷激aiiin ；(2)取出，加入400 800ul YEP培養液(含卡那霉素，Kan) ，200r/min振蕩培養3-5h ；(3)室溫離心(5000r/min，5min)，保留IOOul上清重懸菌體，涂布于LB固體培養基(含Kan)上，28°C倒置培養2天直至長出合適大小的菌落。
(4)挑取單克隆進行PCR檢測，得到陽性菌株。3.愈傷誘導種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70%的乙醇消毒1分鐘，然后用次氯酸鈉(1.5%有效濃度)溶液振蕩消毒20min。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干接種在誘導愈傷培養基中，25°C暗培養2周。愈傷誘導培養基采用表5的誘導培養基，加入0. 3g脯氨酸、0. 6g水解酪蛋白酶、 30g蔗糖和2. 5ml 2，4-D (濃度lmg/ml)，配成IL溶液，調pH至5. 9，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。4.繼代培養把胚性愈傷組織切下，接入繼代培養基中，250C暗培養2周。繼代培養基采用表5的繼代培養基，加入0.5g脯氨酸、0.6g水解酪蛋白酶、30g 蔗糖和anl 2，4-D (濃度lmg/ml)，配成IL溶液，調pH至5. 9，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。5.農桿菌浸染和愈傷組織共培養培養農桿菌挑，取陽性單菌落，在Iml農桿菌培養液(含抗生素)中，28°C培養過夜；取以上培養物，加入50ml農桿菌培養液(含抗生素) 中，28°C培養至0D600 = 0. 6-1. 0。將獲得的農桿菌菌液離心，將收集到的菌體加入懸浮培養液中，震蕩培養30min至0D600 = 0.6-1.0。然后將愈傷組織放入含有農桿菌菌液的懸浮培養液中，振蕩培養20min左右。將愈傷組織在滅菌濾紙上晾干，轉入共培養培養基中， 25°C暗培養5d。懸浮培養液采用表5的懸浮培養液，加入0. 08g水解酪蛋白酶、2g蔗糖和0. 2ml 2，4-D (濃度lmg/ml)，配成IOOml溶液，調pH至5. 4，分成兩瓶(每瓶50ml)，高溫高壓滅菌。 使用之前加入Iml 50%的葡萄糖和100 μ 1 AS(IOOmM)。共培養培養基采用表5的共培養培養基，加入0.8g水解酪蛋白酶、20g蔗糖和 3. Oml 2，4-D (濃度lmg/ml)，配成IL溶液，調pH至5. 6，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入20ml 50%的葡萄糖和Iml AS (IOOmM)。6.篩選培養共培養3d后，選取好的愈傷組織，轉入篩選培養基中，25°C暗培養2 周，篩選兩次。篩選培養基采用表6的篩選培養基，加入0. 6g水解酪蛋白酶、30g蔗糖和2. 5ml 2，4-D (濃度lmg/ml)，配成IL溶液，調pH至6. 0，加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。使用之前加入 Iml Hn 和 Iml Cn(IOOppm)。7.分化培養挑取胚性愈傷組織接入分化培養基，24°C，1 / 光暗培養誘導分化芽周)。分化培養基采用表6的分化培養基，加入2. Omg/L 6_ΒΑ、2· Omg/L KT,0. 2mg/ LNAA、0· 2mg/L IAA、1. Og水解酪蛋白酶和30g蔗糖，配成IL溶液，調pH至6. 0，加入7g瓊
脂粉，高溫高壓滅菌。8.生根培養待芽長至2cm左右時，將幼芽切下，插入生根培養基中，25°C左右， 16h/ i光暗培養，誘導生根。生根培養基采用表6的生根培養基，加入30g蔗糖，配成IL溶液，調pH至5. 8， 加入7g瓊脂粉，高溫高壓滅菌。9.轉化植株培養；待根系發達后，打開試管口，加入無菌水練苗2-3天后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養基，移入土壤中，剛開始遮蔭避風，待植株健壯后進行常規田間或溫室管理培養。
表5基本培養基成分權利要求
1.一種與水稻抗逆性相關的OsGRASI基因，其特征在于，其為SEQ ID NO. 1中所示的 DNA序列，或者與SEQ ID NO. 1至少90%同源的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO. 1 所示序列的亞片段。
2.根據權利要求1所述的OsGRASI基因，其特征在于，其為SEQID NO. 1中第16_1擬6 位所示的DNA序列和相似性達90 %的DNA序列。
3.根據權利要求1或2所述的OSGRASI基因，其特征在于，其氨基酸序列為序列表SEQ ID NO. 2所示，或者SEQ ID N0. 2序列的同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、 誘導突變體。
4.一種水稻啟動子，它是權利要求1-3任意一項所示編碼基因的啟動子，其特征在于， 其DNA序列是序列表SEQ ID N0. 3所示，或者基本上相當于SEQ IDN0. 3所示的70%同源的 DNA序列。
5.根據權利要求4所述的水稻啟動子，其DNA序列是SEQID N0. 3所示l_1370bp序列和相似性達70 %的DNA序列。
6.一種含有權利要求4或5所述水稻啟動子的植物表達載體。
7.一種由權利要求6所述載體轉化的宿主細胞。
8.根據權利要求7所述宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞為包括水稻在內的多種植物。
9.權利要求1-3任意一項所述基因在用于提高水稻抗逆性中的應用。
全文摘要
本發明提供一種與水稻抗逆性相關的OsGRAS1基因、其啟動子及其應用。該基因含有GRAS基因家族保守結構域，為該基因家族SCL類型成員。OsGRAS1基因受干旱、鹽及外源ABA誘導表達，與水稻抗逆性相關。OsGRAS1P啟動子序列的差異使其下游OsGRAS1基因受干旱、鹽及外源ABA處理上調表達的響應時間及表達量發生變化，該啟動子可用作逆境脅迫誘導的基因調控元件。本發明的水稻基因及其啟動子對逆境產生明顯響應，可應用于在植物抗逆育種，提高植物的抗逆性。
文檔編號C12N15/82GK102277358SQ20101019780
公開日2011年12月14日 申請日期2010年6月10日 優先權日2010年6月10日
發明者丁雪峰, 劉鴻艷, 羅利軍 申請人:上海市農業生物基因中心