專利名稱：一種用于發酵生產環磷酸腺苷的節桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物技術領域，涉及一種高產環磷酸腺苷節桿菌及其應用。
背景技術：
環磷酸腺苷是人體內廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質，作為細胞內的第二信使，它對糖、脂肪、核酸、蛋白質等的代謝以及合成調節起著重要的作用。臨床上用于治療心絞痛、心肌梗死、心肌炎及心源性休克；對改善風濕性心臟病的心悸、氣急、胸悶等癥狀也有一定的作用；可提高急性白血病結合化療的療效，亦可用于急性白血病的誘導緩解； 此外，對老年慢性支氣管炎、各種肝炎和銀屑病也有一定療效。環磷酸腺苷也可作為藥物中間體制備二丁酰環磷酸腺苷和環磷酸腺苷葡甲胺，提高脂溶性，從而更有效地發揮生理及藥理作用。環磷酸腺苷亦可用于畜禽食品添加劑，在離體條件下模擬生長激素的作用，促進畜禽生長，增加優質禽產品產量。環磷酸腺苷的生產方法有化學合成法、酶法和發酵法三種。國內外產業化生產全部采用化學合成法，以一磷酸腺苷為原料，采用高效分離柱進行中間體分離，該方法溶劑損耗量大，收率低，成本高，產量小，且環境污染嚴重。利用酶法可以高效地催化三磷酸腺苷生成環磷酸腺苷，但是此方法僅僅局限于實驗室階段，離產業化還有一定的距離。目前，國內還沒有發酵法制備環磷酸腺苷的報道。在國外，1963年馬克曼等在大腸桿菌Crookes株細胞中最早檢出了 1. 1納克/毫升的環磷酸腺苷。1971年，石山等分離篩選了某種小桿菌No. 205 ATCC21376以及數株屬于榜狀桿菌科的細菌，通過化學誘變成抗藥性突變株后，可從葡萄糖直接發酵生成2g/L以上的環磷酸腺苷。1973年，鈴木報道，利用烴同化菌玫瑰色石蠟節桿菌ATCC15584菌株，能以正十四烷為碳源，發酵積累1. 4g/L環磷酸腺苷。離子注入技術作為一種生物品種改良的新技術已在誘變育種、植物轉基因、生命起源和進化以及環境輻射與人類健康等方面取得了一些重要研究成果。其中，在微生物誘變育種的研究中，離子注入已廣泛用于對微生物菌種的誘變育種，并取得了良好效果。離子注入與傳統誘變源相比，除了具有能量沉積效應外，還有動量傳遞、質量沉積及電荷中和與交換效應，是一種將物理誘變和化學誘變特性集于一身的綜合誘變方法，能夠在低劑量注入、細胞損傷較輕的情況下，強烈地影響生物細胞的生理、生化性能，造成遺傳物質的基本單位-堿基的改變，誘發染色體結構變異(余增亮，物理，1997，沈(6) :333-338)。趙洪英 (天津理工學院學報，2001，17(1) :14-17)等用礦離子注入慶大霉素產生菌的成熟孢子，經篩選得到的菌株產抗生素能力提高27. 39%。王紀(微生物學雜志，1998，18 ) :25-28)等通過離子注入誘變篩選得到一株遺傳性能穩定的高產菌，得率較出發菌提高55% 60%。 姚建銘(生物工程學報，2000 (16) =478-481)等應用離子注入誘變篩選得到高產花生四烯酸的一株菌株，并應用于大規模生產，其產量比國外專利報道高1倍
發明內容
因此，本發明所要解決的技術問題是提供一株環磷酸腺苷的高產發酵。為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下一種用于發酵生產環磷酸腺苷的節桿菌，該節桿菌的保藏編號為CGMCC No. 3584。這種作為生產菌株的高產環磷酸腺苷的節桿菌的分類命名為節桿菌 (Arthrobacter sp.)A302,目前該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3584，保藏日期為2010年1月18日。該菌株是通過對土壤篩選到的節桿菌進行低能離子束注入，然后將誘變后的菌株轉接于平板培養基中培養，挑選單菌落轉接于牛肉膏斜面培養，后經含碳源、氮源、無機鹽和水的液體種子培養基和發酵培養基培養從而篩選出的環磷酸腺苷高產菌。CGMCC No. 3584菌株具有下述性質1、菌落形態學特征在固體培養基上菌落呈圓形，濕潤，低凸起，表面光滑，直徑為約1.5-2mm;有光澤，菌落呈黃色，幼齡菌為淺黃色，隨著菌齡增加，菌落呈深黃色2、生理與生化特性菌株為專性好氧菌，厭氧條件不生長；氧化酶反應為陰性，接觸酶反應為陽性，硝酸鹽還原反應為陽性；該菌的最佳生長溫度為30°C，最適pH值為7. 0，可在pH 10. 0下生長；最適的NaCl濃度為(質量比)，在NaCl濃度為5% (質量比)時也能生長；有耐熱性(55°〇，加熱20分鐘)。3、16S rDNA 序列分析CGMCC No. 3584菌株的16S rDNA序列已在GenBank數據庫登記，登記號為 GQ141738。將所測序列與GenBank數據庫中的相關種進行比較，構建16S rDNA全序列為基礎系統的發育樹。結果表明菌株A302與節桿菌(Arthrobacter)的同源性達到99%，因此認定本發明得到的菌株為節桿菌，即節桿菌A302 (CGMCC No. 3584)。4、營養特征該菌能利用葡萄糖、肌醇、山梨醇、木糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、棉籽糖、乳糖、鼠李糖；水解尿素，不產生H2S ；噴哚反應為陰性；可水解淀粉，不水解明膠。本發明還提供了上述節桿菌在提高發酵生產環磷酸腺苷的產量中的應用。本發明又提供了一種生產環磷酸腺苷的發酵方法，該方法包括采用上述節桿菌在液體發酵培養基中發酵。在上述發酵方法中，液體種子培養基可以包含碳源1 100g/L，優選為10 30g/L ；氮源1 100g/L,優選為10 30g/L ；無機鹽0. 01 100g/L, 1 10g/L ；其余為水。液體發酵培養基可以包含碳源1 100g/L，優選為30 50g/L ；氮源1 100g/L，優選為10 30g/L ；無機鹽0. 01 100g/L，10 20g/L ；其余為水。其中，碳源可以選自葡萄糖、木糖、果糖和甘油中的一種或多種；氮源可以選自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、尿素和硫酸銨中的一種或多種；無機鹽可以選自鉀鹽、鈉鹽、磷酸鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的一種或多種。液體發酵培養基的初始PH可以為4. 5 9. 5，優選為6 8。在上述發酵方法中，發酵溫度可以為25 37°C，優選為30 35°C;發酵時間可以為對 120小時，優選為60 100小時。其中，發酵前按照體積比為1 30 100，優選為8 12 100的接種量接種。本發明的有益效果包括1.與傳統的輻射法及化學誘變劑相比，離子束誘變具有損傷輕、突變率高、突變譜廣、遺傳穩定、易于獲得理想新品種等特點。2.本發明的環磷酸腺苷高產菌節桿菌A302 (CGMCC No. 3584)，具有高產性狀穩定的特點，該菌株經過10代以上傳代，生產環磷酸酸的性能保持穩定。3.本發明的環磷酸腺苷高產菌節桿菌A302(CGMCC No. 3584)能夠利用多種碳源和氮源發酵生產環磷酸腺苷，操作方便簡單。牛物材料的保藏節桿菌(ArthrcAacter sp. )A302已經于2010年1月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCCNo. 3584。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明進行進一步的詳細描述，根據下述實施例可以更好地理解本發明。然而，本領域技術人員應容易理解的是，實施例所描述的具體物料配比、 工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書所涵蓋的本發明的范圍。實施例1以從土壤中分離得到的產環磷酸腺苷的菌株為出發菌株，將經N+離子束誘變(低能離子注入機靶室內真空度為2X 10_4，注入能量為20kev，劑量為5X 1013ions ^nT2. s—1)后的孢子懸浮液經無菌水稀釋100倍后，取0. Iml涂布于牛肉膏平板培養基上30°C下培養3 天，從中挑選單菌落在牛肉膏斜面培養2天。轉接一環于裝有30mL液體種子培養基(葡萄糖10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL搖瓶中，于30°C 下250rpm搖床培養20小時。再轉接4mL于裝有40mL液體發酵培養基(葡萄糖50g/L， K2HP0410g/L, KH2P0410g/L, MgS04lg/L，尿素 5g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 搖瓶中，于 30°C下 ^Orpm搖床發酵培養72小時。經過初篩，得到88株比出發菌株產量高的突變株。用同樣的條件下進行復篩，最終得到產量最高的菌株A302，環磷酸苷產量最高產量達到2. 4g/L， 比原始菌株的1. 2g/L提高2倍。實施例2將菌株A302從牛肉膏斜面轉接一環于裝有30mL液體種子培養基(葡萄糖20g/ L，蛋白胨8g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏15g/L，NaCl 3g/L)的500mL搖瓶中，于30°C下250rpm 搖床培養20小時。轉接4mL于裝有40mL液體發酵培養基(葡萄糖40g/L，K2HP0410g/L, KH2P045g/L，MgS044g/L，尿素 8g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 搖瓶中，于 32°C下 ^Orpm搖床發酵培養72小時。環磷酸苷產量達到2. Og/L。實施例3將菌株A302從牛肉膏斜面轉接一環于裝有30mL液體種子培養基(葡萄糖IOg/ L，蛋白胨3g/L，酵母膏4g/L，牛肉膏10g/L，NaCl 3g/L)的500mL搖瓶中，于30°C下250rpm 搖床培養20小時。轉接4mL于裝有40mL液體發酵培養基(葡萄糖45g/L，K2HP045g/L,KH2P0410g/L, MgSO4O. 5g/L，尿素 3g/L，蛋白胨 5g/L)的 500mL 搖瓶中，于 30°CT 300rpm 搖床發酵培養72小時。環磷酸苷產量達到3. 6g/L。實施例4將菌株A302連續傳10代，在實施例3的培養條件下進行發酵培養，生產環磷酸腺苷。結果表明(見表1和幻，連續10代遺傳培養，菌株A302生產環磷酸腺苷的性能穩定。表1連續傳1 5代的菌株A302的生產環磷酸腺苷性能
權利要求
1.一種用于發酵生產環磷酸腺苷的節桿菌，該節桿菌的保藏編號為CGMCC No. 3584。
2.根據權利要求1所述的節桿菌在提高發酵生產環磷酸腺苷的產量中的應用。
3.—種生產環磷酸腺苷的發酵方法，該方法包括采用根據權利要求1所述的節桿菌在液體發酵培養基中發酵。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述發酵的液體種子培養基包含碳源 1 100g/L，優選為10 30g/L ；氮源1 100g/L，優選為10 30g/L ；無機鹽0. 01 100g/L，優選為1 10g/L ；其余為水。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述發酵的液體發酵培養基包含碳源 1 100g/L，優選為30 50g/L ；氮源1 100g/L，優選為10 30g/L ；無機鹽0. 01 100g/L，10 20g/L ；其余為水。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述碳源選自葡萄糖、木糖、果糖和甘油中的一種或多種
7.根據權利要求4至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述氮源選自牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米漿、豆餅粉、尿素和硫酸銨中的一種或多種。
8.根據權利要求3至7中任一項所述的方法，其特征在于，所述無機鹽選自鉀鹽、鈉鹽、 磷酸鹽、鹽酸鹽和硫酸鹽中的一種或多種。
9.根據權利要求3至8中任一項所述的方法，其特征在于，所述液體發酵培養基的初始 pH為4. 5 9. 5，優選為6 8。
10.根據權利要求3至9中任一項所述的方法，其特征在于，所述發酵溫度為25 37°C，優選為30 35°C ；發酵時間為M 120小時，優選為60 100小時。
11.根據權利要求3至10中任一項所述的方法，其特征在于，所述發酵前按照體積比為 1 30 100，優選為8 12 100的接種量接種。
全文摘要
本發明提供一種用于發酵生產環磷酸腺苷的節桿菌及其應用，該節桿菌的保藏編號為CGMCC No.3584。保藏編號為CGMCC No.3584的本發明的節桿菌A302菌株比出發菌株的環磷酸腺苷產量提高了3倍，該菌株經過10代以上傳代，生產環磷酸腺苷的性能保持穩定。
文檔編號C12P19/32GK102268385SQ20101019151
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月4日 優先權日2010年6月4日
發明者應漢杰, 柏建新, 熊健, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業大學