專利名稱：一種人LIGHT-Fc融合蛋白的制備方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學和基因工程藥物領域，具體涉及重組質粒LIGHT-Fc-pPIC9K的構建及LIGHT-Fc融合蛋白在畢赤酵母中的表達的方法。
背景技術：
LIGHT(homologous to lymphotoxins exhibiting inducible expression andcompeting with herpes simplex virus glycoprotein D for herpesvirus entrymediator[HVEM], a receptor expressed by T lymphocytes)最早是 Mauri 等 在對單純皰疹病毒入侵活化T細胞的研究中發現的，又稱為HVEM-L (herpesvirus entrymediator-ligand)，屬于TNF超家族的第14個成員(TNFSF14)。目前發現它有3個受 體HVEM、LT β R及TR6。LIGHT通過與這3個受體相互作用而發揮不同的生物學功能。其 中HVEM主要在T細胞上表達，與LIGHT結合后可以共刺激T細胞活化并調節T細胞免疫應 答，介導同種異體移植排斥反應。LT β R主要在非淋巴細胞如上皮細胞和基質細胞上表達， LIGHT-LT β R信號途徑可以誘導細胞凋亡，促進多種細胞因子產生，參與淋巴結的發生發育 以及二級淋巴組織結構和功能的恢復。TR6是LIGHT的一個可溶性受體，它的mRNA在人體 許多正常組織如胃、脊髓、結腸、淋巴結、脾都有高表達，但在胸腺中表達很少，在外周血淋 巴細胞中不表達。TR6通過競爭結合LIGHT，抑制LIGHT與HVEM或LT β R的相互作用，從而 干擾或阻斷1^6肌-^^11及1^6肌-1^^1 所引發的生物學效應。另外，TR6還可以與FasL 競爭性結合以阻斷其誘導的細胞凋亡，從而有助于腫瘤免疫逃逸及自身免疫病的發生。因 此，LIGHT在腫瘤等多種免疫相關疾病中發揮著非常重要的作用，有很大的應用前景，克隆 LIGHT基因并獲得重組蛋白對其生物學功能的研究具有重要意義。畢赤酵母是一種嗜甲醇酵母，能以甲醇為唯一碳源，是繼釀酒酵母之后發展起來 的一種新型酵母表達系統，畢赤酵母能在體外大規模高密度發酵，并受醇氧化酶強啟動子 的控制，在甲醇存在條件下誘導表達，使表達量大幅度提高，并能精密控制；另外，酵母屬于 真核生物，對表達的蛋白質能進行如蛋白質的裂解、二硫鍵的形成等翻譯后的加工、修飾， 并具有適于真核基因表達產物正確折疊的細胞內環境和糖基化系統，表達產物以活性形式 存在，因此，很多在大腸桿菌中以非活性的包涵體形式存在的蛋白質，在畢赤酵母中可以以 活性蛋白形式得到表達；畢赤酵母還能很好的分泌外源蛋白，幾乎不受分子量限制，且其自 身蛋白很少分泌到培養基中，為后續的純化帶來了極大的方便。目前，在原核細胞和哺乳動物細胞中表達人LIGHT蛋白的方式已有報道，但尚未 有人在酵母中進行嘗試。探索人LIGHT在畢赤酵母中的表達條件，尋找一種更為高效、簡 單、大規模易工業化的LIGHT蛋白制備方式極為必要。
發明內容
本發明的目的在于運用畢赤酵母表達系統獲得人LIGHT-Fc融合蛋白，為人LIGHT 蛋白的生物學功能及腫瘤免疫治療的研究提供一種新型的生物制劑。
本發明所提供的獲取人LIGHT-Fc融合蛋白的方法，包括以下步驟1、重組質粒 LIGHT-Fc_pPIC9K 的構建(1)人LIGHT胞外段cDNA的PCR體外擴增根據GenBank公布的人LIGHT基因序列設計如下引物Primer 1:5' ~CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG~3‘(劃線部分為 EcoR I 酶切 位點，178-197)Primer 2:5' ~CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT~3‘(劃線部分為 BamH I 酶切 位點，701-720)以pET32a_LIGHT重組質粒為模板，進行PCR反應擴增人LIGHT胞外段基因。(2)將含Fc片段的重組質粒pKS-IL-15-Fc用EcoR I和BamH I雙酶切后回收大 片段(含pKS載體部分和Fc片段)，與用EcoR I和BamH I雙酶切后的PCR產物于16°C過 夜連接，經轉化和酶切鑒定后得到pKS-LIGHT-Fc重組質粒。(3) EcoR I和Not I雙酶切pKS-LIGHT-Fc重組質粒回收LIGHT-Fc融合基因，與用 相同限制性內切酶雙酶切的PPIC9K質粒于16°C過夜連接，酶切鑒定及測序正確的重組質 粒命名為pPIC9K-LIGHT-Fc。2、人LIGHT-Fc融合蛋白在畢赤酵母中的表達及鑒定①將構建的重組質粒pPIC9K-LIGHT-Fc用Sal I酶切線性化，同時將空載體 PPIC9K相同酶切線性化，去磷酸化處理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE緩沖液中。電轉化 GS115感受態細胞，涂布MD平板，所得的his+轉化子又涂布含不同濃度G418的YPD平板， 獲得高G418抗性的陽性克隆。②提取多拷貝轉化子的基因組，以基因組為模板，PCR擴增其Aoxl基因，瓊脂糖凝 膠電泳鑒定，僅出現一條帶(1726bp)者為甲醇利用慢型(Muts),出現兩條帶(上述條帶及 2. 2Kb條帶)者為甲醇利用快型(Mut+)。3、人LIGHT-Fc融合蛋白在畢赤酵母中的表達(1)在畢赤酵母中誘導表達LIGHT-Fc融合蛋白將篩選出的重組子接種5mlYPD試管，30°C，250rpm振蕩培養16_18h，再以1 %接種 量接種至20mL BMGY培養基中，30°C，250rpm振蕩培養至0D600 = 2_6，離心收集菌體，用等 體積的BMMY培養基重懸(若為Mut+型轉化子，則加入等體積的BMMY培養基，若為Muts型 轉化子，則加入1/5倍體積的BMMY培養基)，30°C，250rpm振蕩培養96h，每隔24h補加甲醇 至0. 5 %，分別在Oh、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取ImL培養基分析表達水平，以確 定最佳收菌時間。 (2) LIGHT-Fc融合蛋白的鑒定①抽提誘導后酵母菌體的總RNA，以Primer UPrimer 2為引物進行RT-PCR反應。②重組子經過甲醇誘導后，收集其培養基，加入上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳。③以鼠抗人LIGHT血清為一抗，以HRP標記的兔抗鼠IgG為二抗，Western Blot鑒 定人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重組子中的表達。本發明所用的酵母電轉化的條件為電壓1500V，電容25uF，電阻200。本發明進行多拷貝轉化子篩選時所用的G418的最大濃度為4. Omg/ml。本發明中制備人LIGHT-Fc融合蛋白的方法具有操作簡單、成本低、所表達的蛋白能進行正確的加工、修飾，從而表達具有完整生物活性蛋白的特點。分泌表達的產物中雜蛋 白少，易于對目的蛋白的分離純化。而且，融合蛋白中的人類免疫球蛋白Fc片段既不影響 LIGHT蛋白的生物學活性，又可使融合蛋白不容易被蛋白酶降解，從而在體內外應用過程中 具有較好的穩定性。
圖1為重組質粒pPIC9K-LIGHT_Fc構建流程2為重組質粒pPIC9K-LIGHT_Fc的酶切鑒定圖(EcoR I/BamH I)，圖中1為DL 2000分子量標準；2為EcoR I/BamH I雙酶切后的pPIC9K-LIGHT_Fc ;3為未酶切的 pPIC9K-LIGHT-Fc。圖3為重組質粒pPIC9K-LIGHT_Fc的酶切鑒定圖(EcoR I/Not I)，圖中1為 DL 2000分子量標準；2為EcoR I/Not I雙酶切后的pPIC9K-LIGHT_Fc ;3為未酶切的 pPIC9K-LIGHT-Fc。圖4為酵母轉化子的表型鑒定圖，圖中1為500bp DNA Ladder ；2為未轉化GS115 的鑒定結果；3為GS115/pPIC9K轉化子的鑒定結果；4 13為GS115/pPIC9K-LIGHT_Fc轉 化子的鑒定結果。圖5為酵母轉化子表達的RT-PCR鑒定結果，圖中1為DL 2000分子量標準；2為 GS115/pPIC9K轉化子的鑒定結果；3為GS115/pPIC9K-LIGHT_Fc轉化子的鑒定結果。圖6為酵母表達的SDS-PAGE分析圖，圖中1為蛋白質分子量標準；2為GSl 15空 菌體的分析結果；3為GS115/pPIC9K轉化子的分析結果；4為GS115/pPIC9K-LIGHT_Fc轉化 子的分析結果。圖7為酵母表達產物的Western blot分析圖，圖中1為蛋白質分子量標 準；2為GS115空菌體的分析結果；3為GS115/pPIC9K轉化子的分析結果；4為GS115/ pPIC9K-LIGHT-Fc轉化子的分析結果。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。實施例1重組質粒LIGHT-Fc-pPIC9K的構建流程圖如圖1所示，具體步驟如下1.根據 Genebank公布的人LIGHT基因序列設計如下引物Primer 1:5' ~CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG~3‘(劃線部分為 EcoR I 酶切 位點，178-197)Primer 2:5' ~CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT~3‘(劃線部分為 BamH I 酶切 位點，701-720)以pET32a-LIGHT重組質粒為模板，以Primer 1和Primer 2分別為上下游引物進 行PCR反應。
反應程序95°C2min，94°C 30s，55°C 30s, 72°C lmin，30 個循環后，72°C繼續延伸 IOmin0PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，按照DNA凝膠回收試劑盒說明書回收并純 化，得到5'端為EcoR 1,3'端為BamH I酶切位點的PCR產物。2.將含Fc片段的重組質 粒pKS-IL-15-Fc用EcoR I和BamH I雙酶切后回收大片段(含pKS載體部分和Fc片段)， 與用EcoR I和BamH I雙酶切后的PCR產物于16°C過夜連接，經轉化和酶切鑒定后得到 pKS-LIGHT-Fc 重組質粒。3. EcoR I 和 Not I 雙酶切 pKS-LIGHT_Fc 重組質粒回收 LIGHT-Fc 融合基因，與用相同限制性內切酶雙酶切的PPIC9K質粒于16°C過夜連接，酶切鑒定及測序 正確的重組質粒命名為pPIC9K-LIGHT-Fc。經雙酶切鑒定所構建的重組質粒pPIC9K-LIGHT-Fc正確(圖2和圖3)，經基因測 序分析證實重組質粒中LIGHT基因序列與GenBank公布的基因序列(AF036581) —致。實施例2將實施例1中所構建的重組質粒轉化畢赤酵母感受態并篩選多拷貝轉化子，具體 步驟如下1.制備感受態畢赤酵母GS115(1)取凍存的GS115酵母菌株，在YPD平板上劃線，30°C靜置培養36_48h待其長出
單克隆菌落。(2)挑單克隆菌落接種至5mLYPD培養基中，30°C，250rpm振蕩培養12_16h。(3)取0.2mL菌液轉接至IOOmL YPD培養基中，30°C，250rpm振蕩培養12_16h，至 0D600 = 1. 3-1. 5。(4) 40C、1500rpm離心5min，棄上清，加IOOmL冰預冷的無菌雙蒸水重懸沉淀。(5) 40C、1500rpm離心5min，棄上清，加50mL冰預冷的無菌雙蒸水重懸沉淀。(6) 40C、1500rpm離心5min，棄上清，加5mL冰預冷的lmol/L山梨醇重懸沉淀。(7)4°C、1500rpm離心5min，棄上清，加0. 2mL冰預冷的lmol/L山梨醇重懸沉淀， 冰浴備用。2.重組質粒pPIC9K-LIGHT_Fc的預處理(1)用Sal I酶切重組質粒pPIC9K_LIGHT-Fc，使其完全線性化。酶切后取3 μ 1 酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(2)線性化質粒去磷酸化處理，于37°C水浴30min。(3)線性化質粒的純化a)加入等體積的酚/氯仿抽提2次。b)入等體積的氯仿抽提1次。c)加入2. 5倍的冷乙醇，混勻，-20°C下放置30_60min。d) 12000rpm離心lOmin，棄上清。沉淀用200ul 70%冷乙醇洗凈，減壓干燥。e)加20 μ 1以下的TE緩沖液溶解沉淀。3.電轉化畢赤酵母感受態菌(1)取10 μ 1上述線性化重組質粒(10-20呢)，加入8(^1感受態畢赤酵母65115， 混勻后轉入冰冷的0. 2cm電轉化杯中，冰浴lOmin。(2)電擊電壓 1500V，電容 25 μ F,電阻 200 Ω。
(3)電擊一次后，立即加入Iml lmol/L山梨醇，混勻。(4)取轉化液，涂布MD平板。30°C靜置培養48h至長出單克隆菌落。4.篩選多拷貝轉化子(1)在MD平板上挑單克隆接種至96孔細胞培養板中，每孔200 μ 1 YPD培養基， 30°C靜置培養24h。(2)取10 μ 1菌液接種至新的96孔細胞培養板中，每孔加190 μ 1 YPD培養基， 30°C靜置培養24h。(3)重復上步操作一次。(4)取 2μ 1 菌液分別接種至含 0,0. 5,1. 0,2. 0,4. Omg/ml G418 的 YPD 平板上， 30°C靜置培養至長出單克隆菌落。5.轉化子表型鑒定(1)轉化子酵母基因組的抽提a)在高濃度G418-YPD平板上挑單克隆至5ml YPD液體培養基中，30°C，250rpm振 蕩培養12-16h。b)取 Iml 菌液，2500rpm 離心 5min。c)棄上清，500 μ 1 PBS 懸浮沉淀，2500rpm 離心 3min。d) 100 μ 1 TE 懸浮沉淀，煮沸 IOmin。e) -80 V 冷凍 30min。f)再次煮沸 IOmin。g) 1500rpm 離心 5min，取上清。(2) PCRPrimer 3 5' -GAC TGG TTC CAA TTG ACAAGC-3' (5’ AOXl Primer)Primer 4 5' -GCAAAT GGC ATT CTG ACA TCC—3’ (3’ AOXl Primer)以上一步得到的酵母基因組為模板，以Primer 3,Primer 4為引物進行PCR反應。 反應程序95°C預變性5min，94°C lmin，55°C lmin，72°C 3min，30個循環后，72°C繼續延伸 IOmin0擴增結束后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定轉化子表型(見圖4所示)，僅出現一條帶 (1726bp)者為甲醇利用慢型(Muts)，出現兩條帶(上述條帶及2. 2Kb條帶)者為甲醇利用 快型(Mut+)。實施例3將實施例2經G418篩選和表型鑒定為陽性的酵母轉化子在甲酵誘導下表達 LIGHT-Fc融合蛋白，具體步驟如下1.在畢赤酵母中誘導表達LIGHT-Fc融合蛋白(1)挑取單克隆，接種至5ml YPD培養基中，30°C，250rpm振蕩培養16_18h。(2)取200 μ 1菌液接種于20mL BMGY培養基中，30°C，250rpm振蕩培養至OD6tltl = 2-6。(3)室溫，1500-3000rpm 離心 5min，去上清。(4)用無菌水洗滌菌體沉淀一次。(5)用BMMY培養基重懸菌體沉淀(若為Mut+型轉化子，則加入等體積的BMMY培養基，若為Muts型轉化子，則加入1/5倍體積的BMMY培養基)，30°C，250rpm振蕩培養96h， 每隔24h補加甲醇一次。(6)分別在011、1211、2411、3611、4811、6011、7211、8411、9611取 ImL 培養基至 Ependorf管 中，離心，分離培養及和菌體沉淀，分析表達水平，以確定收集菌體的最佳時間。2. LIGHT-Fc融合蛋白表達情況的鑒定(I)Trizol法抽提酵母重組子的總RNA，以oligo dT(20)為引物進行反轉錄，并以 Primer 1和Primer 2為引物進行PCR反應，若含有LIGHT片斷，則說明目的基因可以在酵 母中進行轉錄反應。(2)酵母重組子經過誘導表達后，收集培養基，加入SDS上樣緩沖液，進行 SDS-PAGE電泳分析。(3)以鼠抗人LIGHT血清為一抗，以HRP標記的兔抗鼠IgG為二抗，WesternBlot 鑒定人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重組子中的表達。RT-PCR結果顯示，有一特異性DNA條帶出現(見圖5所示)。SDS-PAGE檢測結果 顯示，在相對分子量45KD 66. 2KD之間有一特異性條帶(見圖6所示)，與預期融合蛋白 的分子量相同。Western blot結果顯示，該蛋白具有很好的特異性，可與鼠抗人LIGHT抗體 發生特異性結合(見圖7所示)，證實該表達蛋白是LIGHT-Fc融合蛋白。
權利要求
1.一種人LIGHT-Fc融合蛋白的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟(1)重組質粒pPIC9K-LIGHT-Fc的構建①人LIGHT胞外段cDNA的PCR擴增根據GenBank公布的人LIGHT基因序列設計如下引物Primer 1 5' -CCGGAATTCCAGCTGCACTGGCGTCTAGG-3 ‘，劃線部分為 EcoR I 酶切位點， 178-197Primer 2:5' -CGCGGATCCCACCATGAAAGCCCCGAAGT-3 ‘，劃線部分為 BamH I 酶切位點， 701-720以pET32a-LIGHT重組質粒為模板，進行PCR反應擴增人LIGHT胞外段基因；②將含Fc片段的重組質粒pKS-IL-15-Fc用EcoRI和BamH I雙酶切后回收含pKS載 體和Fc的大片段，與用EcoR I和BamH I雙酶切后的PCR產物于16°C過夜連接，經轉化和 酶切鑒定后得到pKS-LIGHT-Fc重組質粒；③EcoRI和Not I雙酶切pKS-LIGHT-Fc重組質粒回收LIGHT-Fc融合基因，與用相同 限制性內切酶雙酶切的PPIC9K質粒于16°C過夜連接，酶切鑒定及測序正確的重組質粒命 名為pPIC9K-LIGHT-Fc ；(2)人LIGHT-Fc融合蛋白在畢赤酵母中的表達及鑒定①將構建的重組質粒pPIC9K-LIGHT-Fc用SalI酶切線性化，同時將空載體pPIC9K相 同酶切線性化，去磷酸化處理后，酚/氯仿抽提回收，溶于TE緩沖液中；電轉化GS115感受 態細胞，涂布MD平板，所得的his+轉化子又涂布含不同濃度G418的YPD平板，獲得高G418 抗性的陽性克隆；②提取多拷貝轉化子的基因組，以基因組為模板，PCR擴增其Aoxl基因，瓊脂糖凝膠電 泳鑒定，僅出現一 1726bp條帶者為甲醇利用慢型，即Muts型，出現上述條帶及一 2. 2Kb條 帶者為甲醇利用快型，即Mut+型；(3)人LIGHT-Fc融合蛋白在畢赤酵母中的表達①在畢赤酵母中誘導表達LIGHT-Fc融合蛋白將篩選出的重組子接種5ml YPD試管，30°C，250rpm振蕩培養16_18h，再以接種量 接種至20mL BMGY培養基中，30°C，250rpm振蕩培養至OD6tltl = 2-6，離心收集菌體。若為 Mut+型轉化子，則加入等體積的BMMY培養基重懸，若為Muts型轉化子，則加入1/5倍體積的 BMMY培養基重懸；30°C，250rpm振蕩培養96h，每隔24h補加甲醇至0. 5%，分別在Oh、12h、 24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h取ImL培養基分析表達水平，以確定最佳收菌時間；②LIGHT-Fc融合蛋白的鑒定A)抽提誘導后酵母菌體的總RNA，以Primer1、Primer 2為引物進行RT-PCR反應；B)重組子經過甲醇誘導后，收集其培養基，加入上樣緩沖液進行SDS-PAGE電泳；C)以鼠抗人LIGHT血清為一抗，以HRP標記的兔抗鼠IgG為二抗，WesternBlot鑒定 人LIGHT-Fc融合蛋白在酵母重組子中的表達。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于所述酵母電轉化的條件為電壓1500V，電容 25uF,電阻 200 Ω。
3.根據權利要求1所述方法，其特征在于所述G418的最大濃度為4.Omg/ml。
全文摘要
本發明公開了一種利用畢赤酵母表達系統制備人LIGHT-Fc融合蛋白的方法，步驟包括(1)構建重組表達質粒pPIC9K-LIGHT-Fc；(2)表達人LIGHT-Fc融合蛋白酵母工程菌的制備及篩選；(3)人LIGHT-Fc融合蛋白在畢赤酵母中的表達及鑒定。本發明彌補了傳統人LIGHT制備方法以及原核表達系統表達方式的不足；此外，若將本發明應用于工業化人LIGHT蛋白的生產，則具有操作簡單，原料生物體生長周期短，生產規模大(可以高密度發酵)，提取成本低，產物活性高等優點，具有重要的工業應用前景和實際意義。
文檔編號C12N15/62GK101993883SQ201010190548
公開日2011年3月30日 申請日期2010年6月1日 優先權日2010年6月1日
發明者杜佳妮, 樊燕, 江文正, 郝文麗, 聞潔君 申請人:華東師范大學