華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原蛋白及其應用的制作方法

專利名稱：華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程領域，尤其涉及華支睪吸蟲，特別是一種華支睪吸蟲特異性 GRA2a抗原及其應用。
背景技術：
華支睪吸蟲病(Clonorchiasissinensis)是由華支睪吸蟲[Clonorchis sinensis, C. s]感染所引起的人獸共患病。該病主要分布于亞洲，如中國、日本、韓國(為 韓國主要人體寄生蟲)、朝鮮、越南、東南亞等國家。估計全球有3500萬人感染。在我國，除 新疆、內蒙古、甘肅、青海、西藏、寧夏等省、自治區未見報道外，其余25個省、市、自治區以 及臺灣省和香港特別行政區都已有該病的流行報道或病例報告。由于移民的流動，以及日 益頻繁的全球范圍的旅游和經濟活動，在一些非流行區和發達國家(包括北美和西歐)該 病的病例報告也越來越多。根據衛生部于2001年6月 2004年底在全國(除臺灣、香港、澳門外)進行的人 體重要寄生蟲病現狀調查結果顯示，華支睪吸蟲感染率比1990年全國寄生蟲病分布調查 的結果上升了 75%，其中廣東、廣西、吉林3省(區)分別上升了 182%、164%和630%。估 計目前全國華支睪吸蟲感染者達1200多萬人。華支睪吸蟲病是我國少數個別幾個呈現上 升趨勢的寄生蟲病之一，該病的防治工作已迫在眉睫。在我國南方(如廣東、廣西)及部分北方地區(如東北3省的朝鮮族居住區)，當 地人群有吃生的或未煮熟的淡水魚肉的習慣，魚肉中活的囊蚴被攝入人體，引起人的感染。 這些地區居民雖知吃“魚生”會感染本病，但飲食習慣一時難以改變。而且隨著生活水平的 提高，以往不吃或很少吃“魚生”的人群也開始吃“魚生”，現在生魚片的風味吃法在非流行 區，特別是大中城市也很盛行。同時由于市場開放，流行區含華支睪吸蟲囊蚴的魚運往各 地，因此城鎮居民感染華支睪吸蟲的人數有增加的趨勢。華支睪吸蟲成蟲寄生于人或其它終宿主的肝膽管內，蟲體的分泌/代謝產物及蟲 體本身的機械刺激，可引起膽管，特別是引起次級膽管的炎癥反應，中度感染膽管可出現局 限性擴張，膽管上皮增生、管壁增厚、管腔狹窄，如合并細菌感染，可引起膽管炎和膽管肝 炎，周圍纖維組織增生，晚期可發生肝硬化。有證據表明，華支睪吸蟲感染可增加患者患膽 管癌(CLG)的風險，華支睪吸蟲感染相關性肝膽管腫瘤是華支睪吸蟲病流行區一個重要的 公共衛生問題。為了快速診斷、及時治療和有效控制華支睪吸蟲病，需要特異、靈敏、簡便的方法 檢測人群中華支睪吸蟲的感染。對于華支睪吸蟲病人的診斷，傳統的糞便檢查仍是目前確診華支睪吸蟲病的主要 方法。但由于患者依從性較差，且華支睪吸蟲蟲卵較小易于漏檢，該方法有一定的缺陷。目前在現場防治工作中較廣泛地應用了免疫診斷方法(主要是ELISA法)。但是 仍存在一些問題對健康人有不同程度的假陽性，對華支睪吸蟲病人有一定的假陰性，對其 它寄生蟲(血吸蟲、并殖吸蟲)感染也有一定的交叉反應。Yong TS應用ELISA方法檢測48例華支睪吸蟲病人血清抗體，只有75%的陽性反應，但在觀例正常對照和16例并殖吸 蟲病例中，分別出現了 7. 和37. 5%的假陽性。已有研究資料表明一些寄生蟲的排泄分泌抗原(ESA)或重組的ESA可應用于寄生 蟲病的血清學診斷。Kim SI用ESA來檢測活動性華支睪吸蟲病病人血清相應抗體動態反 應，發現30Ku和7Ku區帶與患者血清呈強陽性反應，而與吡喹酮治療6個月后的病人血清 反應較弱，其中7Ku區帶未見與衛氏并殖吸蟲病、橫川后殖吸蟲病、華支睪吸蟲病患者痊愈 后的血清起交叉反應，特異性比30Ku區帶更強，據此認為7KDa抗原可作為活動性華支睪 吸蟲病的標志性診斷抗原。Min-Ho CHOI對華支睪吸蟲的排泄分泌抗原(ESA)檢測抗體的 ELISA法和成蟲粗抗原(CA)檢測抗體的ELISA法的診斷價值進行了比較和評估。ESA檢測 抗體的ELISA法的特異性顯著高于用CA檢測抗體的ELISA法(前者特異性為93. 1%，后者 為87. 8% )，表明ESA用于檢測華支睪吸蟲患者血清抗體優于粗抗原。因此，與華支睪吸蟲 的CA相比，ESA作為華支睪吸蟲病的診斷抗原具有更高的特異性和敏感性。然而傳統的蟲 源性抗原制備復雜，質量可控性較低，制備量有限，難以適應大規模查病的需求。此外，由于該蟲寄生于肝膽管這一特定的部位，決定了宿主血清中的抗原和抗體 水平較低，難以檢測(也是目前該病缺乏良好診斷試劑的原因)，但在糞樣中卻有ESA的存 在。Yong TS等鑒定了與IgE抗體反應的華支睪吸蟲抗原，發現^Ku的抗原與IgE反應 最強，該蛋白也存在于糞便排泄物中。Sirisinha S等人用單克隆抗體ELISA(Monoclonal antibody ELISA，McAb_ELISA)檢測麝貓后睪吸蟲患者糞樣中的抗原，能檢測的抗原最低量 為0. 05ng-0. Ingo研究表明，檢測患者糞樣中的特異抗原，可提供早期診斷、現癥患者確診 及療效考核的依據。而診斷抗體或抗原的特性決定著糞樣和血清中抗原或血清抗體檢測等免疫學方 法的診斷效果。同時由于難以取得高純度的特異抗原或大量的天然抗原，故使用分子生物 學技術，構建特異性重組抗原的技術路線是尋找合適抗原的必由之路。

發明內容
本發明的目的在于提供一種華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白，所述的這種華 支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白要解決現有技術中診斷華支睪吸蟲病的特異性和敏感 性不高的技術問題。本發明的這種華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白，含有至少2- 個重復的保守 氨基酸片段，所述的保守的氨基酸片段的序列為QPKSGGGDA。進一步的，所述的抗原蛋白的N和C端含有高度疏水區。進一步的，所述的華支睪吸蟲特異性GRAM類抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示、或者對SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或者幾個 氨基酸后的由SEQ IDNO 2所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。進一步的，所述的華支睪吸蟲特異性GRAM類抗原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO :3所示、或者對SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或者幾個 氨基酸后的由SEQ IDNO 3所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。本發明還提供了一種抗體，特異性的結合上述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原 蛋白。
進一步的，所述的抗體為單克隆抗體。本發明還提供了一種編碼上述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白的抗原基 因。進一步的，所述的一種華支睪吸蟲特異性GRAM抗原(Cs4)基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO :1所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列與SEQ ID NO :1所示核苷酸序列同 源性達90%以上、或者其部分經過取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列 所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。本發明還提供了一種載體，含有上述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原基因、或 者含有去除部分信號肽序列的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原基因、或者含有去除全部信 號肽序列的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原基因。進一步的，所述的載體的氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示。本發明還提供了一種宿主細胞，含有上述的載體，或者采用上述的一種華支睪吸 蟲特異性GRAh抗原基因轉化或轉染。本發明還提供了一種疫苗，含有上述的抗體、或者上述的華支睪吸蟲特異性GRAh 類抗原蛋白、或者上述的載體。本發明還提供了上述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白在制備治療、診斷或 者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。本發明還提供了上述的抗體在制備治療、診斷或者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。本發明還提供了上述的載體在制備治療、診斷或者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。本發明還提供了上述的疫苗在制備治療、診斷或者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。本發明還提供了一種試劑盒，含有上述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、 或者上述的抗體。本發明通過對本發明人構建的華支睪吸蟲成蟲cDNA表達文庫，用采自廣西壯族 自治區的華支睪吸蟲病人混合血清以及華支睪吸蟲成蟲排泄分泌抗原(ESA)免疫小鼠血 清，使用免疫篩選法篩選華支睪吸蟲成蟲cDNA表達文庫。共獲得101個陽性克隆，有76個 克隆完成測序。其中共有57例與Glycine rich antigen 2 (富甘氨酸蛋白2，GenBank序列 號AF461709，韓國科學家Sim. S等在GenBank提交序列后，之后未見任何報道)高度同源， 占可測序陽性克隆的75. 0%，該類抗原為華支睪吸蟲占壓倒性優勢的標識性抗原家族。經 同源性比較，本發明的華支睪吸蟲GRAM抗原與韓國科學家提交的Glycinerich antigen 2抗原相比，抗原蛋白的N端和中段完全一致，C端也高度同源，但有一 AASDSS插入，故命名 為富甘氨酸加抗原(GRAM)。華支睪吸蟲特異性GRAh抗原是迄今為止還沒有進行功能研 究的華支睪吸蟲特異性抗原。通過華支睪吸蟲抗原GRAh家族中Cs4抗原(GenBank序列 號⑶124749)的表達純化，已進一步建立了高特異性和敏感性的華支睪吸蟲病診斷初步 方法；并易制備多/單克隆抗體，可應用華支睪吸蟲病的科研和防治等不同方面。本發明的 試劑盒還可以用來檢測華支睪吸蟲病。Cs4抗原已涵蓋了所有華支睪吸蟲GRAh類抗原成 熟蛋白的氨基酸序列特征，Cs4抗原蛋白的功能研究具有代表性。


圖1、圖2、圖3是華支睪吸蟲GRAM類抗原基因家族Alignment分析結果。圖中 1-17號序列為本發明人獲得的部分華支睪吸蟲GRAM序列，GRA2為Glycine rich antigen 2序列。圖4是將Cs4抗原的氨基酸序列傳送至SignalP 3.0 Server (網址http //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)，使用神經網絡法(NN)進行在線信號肽剪切位點分析 圖。圖5是將Cs4抗原的氨基酸序列傳送至SignalP 3. 0 Server (網址http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)，使用隱馬可夫模型(HMM)進行在線信號肽剪切位點分 析圖。圖 6 是 Cs4DSPM PCR 擴增的 1 % 瓊脂糖凝膠電泳圖，M =DNAMarker ； 1-3 :Cs4DSPM PCR擴增結果06 Ibp)。圖7是Cs4DSPM NcoI/XhoI雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳圖，M =DNA Marker ；1 Cs4DSPM Ncol/Xhol 雙酶切結果。圖8是pET28a-Cs4DSPM重組蛋白表達鑒定12 %的聚丙烯胺凝膠電泳圖，M Protein Marker (FERMENTAS MBI) ；1 :pET28a_Cs4DSPM未誘導；2 :pET28a_Cs4DSPM誘導；3 誘導上清；4 誘導沉淀。圖9是pET28a_Cs4DSPM可溶性蛋白純化12%聚丙烯酰胺凝膠電泳圖，M =Protein marker ；1 =Ni-NTA純化流出液(含IOmM咪唑)；2_3 含20mM咪唑洗滌液管2、4 ；4-6 含 50mM咪唑洗脫液1-3管；7-9 含IOOmM咪唑洗脫液1_3管；10-14 含250mM咪唑洗脫液1_5 管，其中，pEI^8a-Cs4DSPM可溶性蛋白集中在含250mM咪唑的洗脫液中。圖10是Cs4DSPM可溶性重組蛋白ELISA法檢測各類血清抗體散點圖。為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指 出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論 述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見了，而這些等價修改， 均應屬于本發明所限定的范圍。
具體實施例方式以下所述實驗方法，沒有具體說明的，均按照《分子克隆實驗指南》，2002年，科學 出版社)所述方法進行。實施例1華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫的構建用采自廣西壯族自治區的華支睪吸蟲囊蚴，通過灌胃法感染貓5只。42天后，檢查 糞便蟲卵，然后剖殺，收集華支睪吸蟲成蟲，用滅菌的生理鹽水沖洗干凈，液氮保存。利用TRIzol (GIBC0/BRL公司)試劑盒抽提華支睪吸蟲成蟲(1克華支睪吸蟲成蟲 壓積，液氮保存)的總RNA。采用mRNA純化試劑盒(mRNA Purification Kit，Amersham公司)，從提取的總 RNA 中純化mRNA。具體步驟見產品說明書。華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫采用定向克隆法，利用ZAP-cDNASynthesisKit (Stratagene公司)構建。參照試劑盒說明書操作，主要過程包括1. cDNA第一鏈的合成，應用含有Β ο I內切酶位點的多聚T引物，為了使cDNA第 一鏈在合成過程中不受限制性內切酶的破壞，用5-甲基dCTP替代dNTP中的dCTP，使合成 的DNA半甲基化，從而在B10 I消化cDNA時，只有位于多聚T引物內的非甲基化位點可被 裂解；2. cDNA第二鏈的合成，由RNase H消化第一鏈合成產物mRNA_DNA雜合體中的RNA， 產生的cDNA片段作為引物在DNA聚合酶I作用下合成第二鏈；3.用Pfu DNA聚合酶將合成的雙鏈cDNA的末端補平，之后在補平的雙鏈DNA的 5’端加上含有EcoR I酶切位點的接頭(adaptor)，并使接頭磷酸化；4.用限制性內切酶Β ο I消化，消化后的雙鏈DNA通過kphar0SeCL-2B凝膠柱層 析，進行分級分離，去除游離接頭；5.將分離后的DNA片段合并濃縮，連接到Uni-ZAP XR載體上；6.最后用包裝抽提液(GigapackIII Gold Packing Extract, Stratagene)包裝 噬菌體蛋白外殼。華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫構建完成后，進一步對文庫容量及插入片段平均長度 等進行檢測。檢測計算結果，華支睪吸蟲成蟲cDNA文庫的容量為1. 43X 106pfu/ml。從文庫中隨機挑取16個重組克隆進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物 鑒定。重組克隆擴增片段長度范圍在0.61Λ 21Λ。平均插入片段長度為1. 11Λ。重組插入率為99. 6 %。實施例2華支睪吸蟲ESA免疫小鼠血清的制備以無菌的生理鹽水多次洗滌獲得的新鮮華支睪吸蟲成蟲，轉入臺氏培養基(含雙 抗體和兩性霉素B各10 μ g/ml)中，5% C02，37°C培養。成蟲培養基于3000g離心15min， 除去沉淀(蟲卵)。上清液再以20000g超速離心，去除可能包含蟲體碎片等沉淀物。所得 上清液即為排泄分泌抗原(ESA)。按常規制備免疫鼠血清。Balb/c小鼠接種抗原30ug，首次接種使用福氏完全佐劑 (Sigma公司)，皮下注射；每隔3周，使用福氏不完全佐劑(Sigma公司)加強，腹腔注射，共 強化免疫4次。取小鼠血制備血清，即為華支睪吸蟲ESA免疫小鼠血清。實施例3cDNA文庫的免疫篩選噬菌體感染取XLl-blue MRF'菌液200 μ 1與適量cDNA文庫噬菌體液混合(根據文庫滴度預 先確定，約3000噬菌斑/每板)，37°C溫育15分鐘后，加入:3ml 48°C的上層瓊脂(top agar) 混勻，立即鋪于NZY培養基平板上。室溫下凝固10分鐘，于42°C孵育。融合蛋白的誘導表達觀察到噬菌斑出現后(約3. 5小時)，用經IPTG (15mM/L)浸泡30分鐘的硝酸纖維 素膜(Hybond-C extra, Amersham, NC)覆蓋平板，于37°C再培育3. 5小時；取出平板4°C冷 卻15分鐘，然后用針在膜以及板上做上標記。將膜取下置于TBST中洗3次，每次10分鐘， 然后浸于NC膜浸在封閉液中，室溫，輕微振蕩，封閉過夜。將NC膜從封閉液中取出，用TBST洗膜2次，每次5分鐘。加入華支睪吸蟲病人混合血清(采自廣西壯族自治區)或華支睪吸蟲ESA免疫小鼠血清5ml/膜，室溫下輕微振蕩 3小時。再用TBST洗膜3次，每次10分鐘。加入二抗(5ml/膜)即羊抗人堿性磷酸酶結 合物(AP-GAH，BIO-RAD, 1 3000稀釋)室溫下反應1小時，用TBST洗膜3次，每次10分 鐘，用TBS洗膜2次，每次5分鐘，洗去殘留的Tween20。將NC膜從TBS中取出，用Whatman 3MM的濾紙吸干多余的溶液，放入AP buffer 浸泡NC膜3分鐘。用Color Development Solution 稀釋 NBT 至終濃度 0. 3mg/ml, BCIP 終濃度為 0. 15mg/ml (BCIP應逐滴加入已稀釋的NBT中，防止沉淀形成。)，配制成NBT-BCIP顯色液。 將NC膜浸入NBT-BCIP顯色液中，在暗處進行顯色反應直到陽性斑點清晰可見。終止顯色 反應。根據NC膜上陽性斑點在原培養板上的相應位置，挑取陽性噬菌斑，再經過復篩、 三篩使得陽性噬菌體單克隆化。實施例4噬菌體刪除環化為pBluescript SK_噬菌粒及提取噬菌粒E. coli XLl-blue MRF'于 LB 培養基(含有 IOmM MgS04，0. 2%麥芽糖，15μ g/ml Tet)中培養過夜。次日，取培養液100μ1轉接到新的LB培養基中，37°C，200rpm振蕩培 養約2小時。培養液經2000g，離心10分鐘，沉淀細菌，用IOmM MgS04重懸至OD6tltl = 1. 0。 在細菌培養管中加入200 μ 1 Ε. coli XLl-blue MRF'重懸液、50 μ 1含有陽性噬菌體的SM buffer和1 μ 1輔助噬菌體。將細菌培養管放置于37°C水浴中15分鐘。然后加入:3ml LB, 于37°C振蕩培養5小時。取出細菌培養管，在65°C加熱20分鐘，然后3000g，離心15分鐘， 將上清轉入一個新離心管中，置于4°C保存。SOLR菌于LB培養基(含有IOmM MgS04, 50 μ g/ml Kan)中振蕩培養，然后2000g， 離心10分鐘，用IOmM MgS04重懸至OD600 = 1. 0，在1. 5ml Ep離心管中加入200 μ 1 SOLR 和上述制備的上清保存液1 μ 1，在37°C溫育15分鐘，然后取出25 μ 1均勻涂布于LB (含 100 μ g/ml Amp)瓊脂平板上，37°C倒置培養過夜。培養基上生長的菌落，即為含華支睪吸蟲cDNA插入片段的pBluescript 31(_噬菌 粒的SOLR菌落。使用Axyft^p質粒DNA小量試劑盒[愛思進生物技術(杭州)有限公司]提取 pBluescript 51(_噬菌粒。實施例5華支睪吸蟲GRAh抗原基因家族的分離和Alignment分析篩選獲得的陽性克隆，經刪除環化為pBluescript SK_質粒。由上海hvitrogen 公司測序，共得到57個與華支睪吸蟲Glycine rich antigen2高度同源的抗原基因的完整 或部分mRNA(cDNA)序列。從中選取17個含有較完整序列的克隆，與Glycine rich antigen 2序列一同使用0miga2. 0軟件進行多序列alignment分析，經手工調整后，18個序列的 alignment分析如圖1、圖2及圖3所示。Alignment分析表明華支睪吸蟲GRAh抗原基 因是一類同源多基因家族。該類抗原蛋白的N和C端含有高度疏水區，由大量的疏水性氨 基酸組成；該類蛋白的中段為富含甘氨酸的重復多肽，由“QPKSGGGDA”九個氨基酸組成，九 氨基酸重復多肽的串列次數在不同的GRAh抗原基因中可發生變化，呈4- 次不等。與韓 國科學家提交的Glycine rich antigen2抗原相比較，GRAM類抗原蛋白的N端和中段完 全一致，C端也高度同源，但有一 AASDSS插入。
實施例6華支睪吸蟲Cs4抗原基因的分離和SignalP分析根據57個華支睪吸蟲GRAh抗原基因的mRNA序列以及alignment分析結果。為 易于重組蛋白的表達，挑選九氨基酸重復序列的串列次數較少的Cs4陽性克隆開展進一步 的實驗。經刪除環化為pBluescript SK_Cs4的質粒由上海hvitrogen公司測序，得到華 支睪吸蟲Cs4抗原基因的mRNA (⑶NA)序列(如SEQ ID NO 1所示)。Cs4基因共含有532 堿基，第1位為起始子(ATG)，第304位為終止子(TAG)。推導的Cs4抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。含101個氨基酸。預測分子 量為 10. 13Ku。將Cs4抗原的氨基酸序列傳送至SignalP 3. 0 Server (網址:http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)，使用神經網絡法(NN)進行在線信號肽剪切位點分析，結果 如圖4和下面計算結果> Sequencelength=101
#MeasurePositionValueCutoffsignal ]
max. C260. 7180. 32YES
max. Y210. 6930. 33YES
max. S40. 9890. 87YFS
mean S1-200.9430.48YES
D1-200.8180.43YES#Most likely cleavage site between pos.20 and 21 CSA-ER將Cs4抗原的氨基酸序列傳送至SignalP 3. 0 Server (網址:http//www. cbs. dtu. dk/services/SignalP/)，使用隱馬可夫模型(HMM)進行在線信號肽剪切位點分析，結 果如圖5和下面計算結果> SequencePrediction :Signal peptideSignal peptide probability :0.999Signal anchor probability :0.000Max cleavage site probability :0.423 between pos.25 and 26根據SignalP分析結果，表明華支睪吸蟲Cs4抗原確實含有信號肽結構。并進一步 依據實施例5中的Alignment分析結果，綜合其他GRAh的信號肽剪切位點，最終確定Cs4 抗原的信號肽剪切位點位于第25和第沈個氨基酸之間。經信號肽剪切后的Cs4抗原成熟 蛋白的氨基酸序列(含76個氨基酸)如SEQ ID NO 3所示。預測分子量為7. 25ku。由此可推經信號肽剪切后的成熟華支睪吸蟲GR^a類抗原由不同串列次數的 “QPKSGGGDA”九氨基酸重復多肽和高度疏水性的C端構成。盡管Cs4抗原蛋白較其他華支 睪吸蟲GRAh類抗原蛋白相比，分子量較小，其成熟蛋白中的“QPKSGGGDA”九氨基酸重復多 肽只重復4次，但Cs4抗原已涵蓋了所有華支睪吸蟲GRAh類抗原成熟蛋白的氨基酸序列 特征，所以Cs4抗原蛋白的功能研究具有代表性。實施例7pET28a_Cs4DSPM表達載體的構建根據Cs4基因的序列，去除大部分信號肽序列，以提高重組蛋白的表達和純化的 效果；并采用制備不帶N端融合標簽的天然蛋白的策略，利用pET載體的NcoI位點，在引物序列中加入AUG起始密碼子，并由該起始密碼子起始翻譯蛋白質，使重組蛋白N端不再帶有 冗長的載體編碼序列，更接近天然蛋白。設計如下引物(由上海化“廿呢甜公司合成)PF-CS4DSPM 5，CATGCCATGGAACGCGGCGATGCACA 引入 Nco I 位點PR-CS-34NC0I 5，CCGCTCGAGGAAGTGATCGGAGGCCTTG 引入 Xho I 位點以pBluescript SK_Cs4噬菌粒為模板，進行PCR擴增。反應體系50ul，其中模 板 0. 2ul，雙向引物各 lul，dNTP(賽百勝公司)lul，IOXbuffer 5ul, platinum Taq 酶 (Invitrogen公司)0. 5ul，50mM鎂離子1. 5ul，去離子水39. 8ul。反應條件為預變性95°C 5 分鐘；變性95°C 1分鐘；退火53°C 1分鐘；復性72°C 1分鐘；循環30次，最后一個循環復 性延長至7分鐘，樣品保存于4°C。PCR產物在的瓊脂糖凝膠電泳(如圖6所示)，在紫 外燈下切割分離的目的片段，用Ε. Z. N. A. Ultra- Sep Gel Extraction Kit (Omiga公司) 純化回收。純化回收的Cs4DSPM PCR片段用Ncol、XhoI限制性內切酶(NEB公司)酶切過 夜；使用小牛腸堿性磷酶(CIP，NEB公司)去磷酸化。酶切PCR產物在的瓊脂糖凝 膠電泳(如圖7所示)，在紫外燈下切割分離的目的片段，用Ε. Z. N. A. Ultra- Sep Gel ExtractionKit (Omiga ^w] )pET28a表達載體質粒同樣使用Ncol、BioI限制性內切酶雙酶切。并使用上述同 樣方法回收。將目的片段和載體片段按8 1摩爾比進行連接，連接體系中含T4DNA連接酶 (NEB公司)lul，10XT41igaSe buffer 2ul，去離子水，目的片段和載體片段共計體積為 20ul于1. 5ml Eppendorf管中16°C連接過夜，構建成pET28b_Cs4DSPM的原核表達的重組 質粒。該重組蛋白的氨基酸序列(含90個氨基酸)如SEQ ID N0:4所示。預測分子量為 9. 12Ku。該重組蛋白的氨基酸序列與天然成熟Cs4抗原相比，N端只增加了 6個氨基酸，C 端增加了 8個氨基酸，具有和天然抗原極高的相似性，可較好地保持原抗原的免疫原性。連接好的表達載體轉化至DH5a，提取質粒后，驗證插入序列無誤。并進一步轉化 E.coli BL21(DE3)感受態細胞。實施例8重組蛋白的表達鑒定及純化轉化好的表達宿主菌接種于細1的LB培養基(含50 μ g/ml的Kan)中，于37°C， 200rpm,振蕩培養至OD6tltl = 0. 6時，取出2ml菌液加入2 μ 1 IM的IPTG進行誘導，剩余的 2ml菌液不加IPTG作為對照，37°C，200rpm，振蕩培養4小時。將培養好的菌液于4°C，經 5000rpm離心10分鐘收集菌體，棄去上清。向誘導管和對照管中分別加入200 μ 1 0. 15Μ的 PBS重懸菌體。分別從誘導管和對照管中取出5μ 1的重懸液，加入2XSDS-PAGE加樣緩沖 液5 μ 1，混勻后于100°C煮沸5分鐘變性。以8 μ 1/孔樣品進行SDS-PAGE分析(濃縮膠為 5%，分離膠為12%或16%)。電泳條件為濃縮膠80V，分離膠100V。電泳結束后，用染色液 染色4小時，再用脫色液脫色，直到蛋白條帶清晰可見。結果pET28a-Cs4DSPM在ImM的IPTG條件下37°C誘導，在16Ku處可見明顯的重組蛋白 條帶。該重組蛋白在上清和沉淀中均有表達。如圖8所示。
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重組蛋白的純化誘導后的菌液(500ml)經4000rpm，4°C，離心10分鐘，棄盡上清。按每克細菌 糊加入5ml的比例，向菌體中加入BugBuster 蛋白抽提劑(NOvagen公司)，并加入5Ku rLysozyme(每克細菌糊，NOvagen公司)以及125u Benzonase核酸酶(每克細菌糊， NOvagen公司)，充分懸浮沉淀后，室溫振蕩30min。然后于4°C，9000rpm離心10分鐘。可溶性蛋白的純化取Iml的Ni-NTAAgarose (Qiagen公司)裝柱，加入大量0. 15M的PBS沖洗，除去 殘留的乙醇。將離心后的誘導細菌上清液加入到已經處理好的Ni-NTAAgarose中，置于搖床 上，室溫振蕩60-90分鐘，使蛋白與Ni-NTAAgarose充分結合。停止振蕩后，待Ni-NTA Agarose沉降，打開柱子下面的塞子，收集流出的液體。用4倍床體的Washing Buffer洗柱兩次，收集流出的液體。然后用2-4倍床體的含不同濃度咪唑的Elution Buffer洗滌柱子，分別收集洗脫 液。將收集的液體進行SDS-PAGE電泳檢測分析，檢測蛋白純化的效果。結果如圖9所示。實施例9酶聯免疫吸附試驗檢測抗體1.間接ELISA方法檢測血清中的抗體方法用重組蛋白包被酶標板(Nunc公司，96孔板)，4°C過夜；1 % BSA37°C封閉1小時； 分別加入1 100稀釋的華支睪吸蟲病人、正常人血清100ul，37°C反應1.5小時；加入 ΙΟΟμ 1的HRP標記羊抗人IgG (Sigma公司，1 10000稀釋)，37 °C反應1小時；加入底物 TMB (天根公司)顯色，酶標儀450nm讀取數值。2. pET28a-Cs4DSPM可溶性純化蛋白檢測抗體效果評價對采自廣西橫縣的35份華支睪吸蟲病人血清，采自華支睪吸蟲病非流行區的 廣西靖西市的36份正常人血清，15例日本血吸蟲病人血清、15例衛氏并殖吸蟲病人血 清和13例豬囊尾蚴病人血清，以上述間接ELISA方法檢測血清中的抗體。重組抗原 pET28a-Cs4DSPM的可溶性純化蛋白的包被濃度為0. 5ug/ml，每孔IOOul。ELISA結果如下pET28b-Cs4DSPM可溶性純化蛋白檢測血清中特異性抗體間接ELISA結果
權利要求
1.一種華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白，其特征在于含有至少2- 個重復的保 守氨基酸片段，所述的保守氨基酸片段的序列為QPKSGGGDA。
2.如權利要求1所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白，其特征在于所述的抗 原蛋白的N和C端含有高度疏水區。
3.如權利要求1所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白，其特征在于其氨基酸 序列如SEQ ID NO :2所示、或者對SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加 一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
4.如權利要求1所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白，其特征在于其氨基酸 序列如SEQ ID NO :3所示、或者對SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加 一個或者幾個氨基酸后的由SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列所衍生的氨基酸序列。
5.一種抗體，其特征在于特異性的結合權利要求1所述的華支睪吸蟲特異性GRAh 類抗原蛋白、或者權利要求2所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、或者權利要求 3所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、或者權利要求4所述的華支睪吸蟲特異性 GR^a類抗原蛋白。
6.如權利要求5所述的抗體，其特征在于所述的抗體為單克隆抗體。
7.一種編碼權利要求1所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白的抗原基因。
8.如權利要求7所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原基因，其特征在于所述的抗 原基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示、或者所述的抗原基因的核苷酸序列與SEQ ID NO 1所示核苷酸序列同源性達90%以上、或者其部分經過取代、缺失或者添加后如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列所衍生的具有抗原性的核苷酸序列。
9.一種載體，其特征在于含有權利要求7或者權利要求8所述的華支睪吸蟲特異性 GRAh類抗原基因、或者含有去除部分信號肽序列的權利要求7或者權利要求8所述的華支 睪吸蟲特異性GRAh類抗原基因、或者含有去除全部信號肽序列的權利要求7或者權利要 求8所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原基因。
10.如權利要求9所述的載體，其特征在于其氨基酸序列如SEQIDNO :4所示。
11.一種宿主細胞，其特征在于含有權利要求9所述的載體，或者用權利要求7或者 權利要求8所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原基因轉化或轉染。
12.—種疫苗，其特征在于含有權利要求5所述的抗體、或者權利要求1所述的華支 睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、或者權利要求2所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原 蛋白、或者權利要求3所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、或者權利要求4所述的 華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、或者權利要求9所述的載體。
13.權利要求1、或者權利要求2、或者權利要求3、或者權利要求4所述的華支睪吸蟲 特異性GRAh類抗原蛋白在制備治療、診斷或者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。
14.權利要求5所述的抗體在制備治療、診斷或者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。
15.權利要求9所述的載體在制備治療、診斷或者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。
16.權利要求12所述的疫苗在制備治療、診斷或者預防華支睪吸蟲病的藥物中的應用。
17.—種試劑盒，其特征在于含有權利要求1所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原 蛋白、或者權利要求2所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、或者權利要求3所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類抗原蛋白、或者權利要求4所述的華支睪吸蟲特異性GRAh類 抗原蛋白、或者權利要求5所述的抗體。
全文摘要
本發明提供了一種華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原蛋白，還提供了特異性的結合華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原蛋白的抗體。本發明還提供了一種編碼華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原蛋白的抗原基因。本發明還提供了一種含有華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原基因的載體。本發明還提供了一種試劑盒。本發明還提供了上述的一種華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原蛋白、抗體和試劑盒在制備、預防和治療診斷華支睪吸蟲病的應用。本發明的華支睪吸蟲特異性GRA2a類抗原具有較高的免疫原性，易制備多/單克隆抗體，進而進一步應用于抗原檢測等方面。實驗動物(小鼠)對該抗原免疫應答較強。
文檔編號C12N15/63GK102070710SQ201010188950
公開日2011年5月25日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者馮正, 包意芳, 盧艷, 周巖, 徐斌, 董玉婷, 許學年 申請人:中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所