活化蛋白激酶c受體1作為抗腫瘤耐藥靶點的用途的制作方法

專利名稱：活化蛋白激酶c受體1作為抗腫瘤耐藥靶點的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學和腫瘤防治領域，更具體而言，本發明涉及預測、診斷和治 療腫瘤耐藥性領域。本發明中提供了一種新的腫瘤耐藥標志物在腫瘤組織中高表達并導 致腫瘤耐藥的活化蛋白激酶C受體l(receptor for activated C-kinase 1，RACK1)，將該 蛋白作為靶點，可設計出針對該蛋白及其相關分子的預測、診斷腫瘤耐藥試劑盒、篩選針對 該蛋白及其相關分子的治療腫瘤耐藥的藥物。
背景技術：
惡性腫瘤是危害人類健康的一類疾病，化療是目前治療惡性腫瘤的主要手段之 一。然而，化療過程中產生的腫瘤耐藥，卻成為影響腫瘤治療效果的一大障礙。對腫瘤耐藥 發生機制的研究和尋找開發逆轉耐藥的藥物是當前腫瘤防治中的重要研究領域。為了逆轉腫瘤耐藥，提高化療療效，本領域迫切需要通過多種方式研究腫瘤耐藥 發生的機制、腫瘤耐藥的關鍵基因靶點，并根據這些靶點設計治療腫瘤耐藥的新藥，從而引 導腫瘤耐藥靶向性治療。RACKl (receptor for activated C-kinase 1，活化蛋白激酶 C 受體 1)，最早 被報道為PKCiiII(蛋白激酶C的一種亞型)的受體，分子量約36kd。它含有7個內 在的Trp-Asp (WD40)重復基序，是G蛋白β亞基的同源物(Mol Pharmaco 12002 ；62 1261-1273)。RACKl的特殊結構使它能與多種激酶及膜受體相互作用，在細胞應答過程中發 揮著重要的作用。質譜分析法發現RACKl能和核糖體的小亞基結合，并招募PKC到40S，從而 調控翻譯起始(Nat Struct Mol Biol2004 ；11 :957_962)。另有文獻報道，通過冷凍電鏡觀 察到RACKl定位在核糖體40S亞基的頭部區域，并能和核糖體RNA直接作用，同時，RACKl的 一個WD序列被暴露，能夠招募其它蛋白至核糖體(Mol Pharmacol 2002;62:1261-1273)。

發明內容
本發明的主要目的之一就是為了提供一種腫瘤耐藥的關鍵基因靶點及蛋白靶點， 為逆轉腫瘤耐藥、提高化療療效提供更為有效的工具。本發明的另一個主要目的是根據這些靶點設計預測、診斷腫瘤耐藥試劑盒、篩選 針對該蛋白及其相關分子的治療腫瘤耐藥的藥物。本發明的目的之一是提供一種逆轉腫瘤耐藥的關鍵靶點RACK1，針對該靶點及其 相關分子，如RACKl的配體PKC，設計藥物和治療方案，下調腫瘤中RACKl表達或抑制其功 能，能夠有效治療耐藥腫瘤。在本發明的第一方面中，提供了一種活化蛋白激酶C的抑制劑或活化蛋白激酶C 受體1的抑制劑在制備降低或消除腫瘤治療中的耐藥性的藥物中的用途。在本發明的一個實施方式中，所述活化蛋白激酶C或活化蛋白激酶C受體1來自 人或其它真核生物，例如小鼠、大鼠、牛或猴等，且它們之間具有高度的保守性。在本發明的一個實施方式中，所述抑制劑選自抗活化蛋白激酶C或抗活化蛋白激酶C受體1的抗體、針對活化蛋白激酶C或活化蛋白激酶C受體1編碼序列的RNA干擾 分子或反義寡核苷酸。在一個優選例中，所述抑制劑是抑制活化蛋白激酶C受體1結合到核糖體的抑制 劑、或是抑制活化蛋白激酶C受體1與其配體結合抑制劑。在另一個優選例中，所述活化蛋白激酶C的抑制劑選自PKCi3II的抑制劑 CGP-53353 或者 PKC 的抑制劑 Go6976。在本發明的另一個實施方式中，所述抑制劑是選自下組的RNA干擾分子shRNA、 siRNA、miRNA或dsRNA，更優選這些RNA干擾分子是針對活化蛋白激酶C受體1或其編碼序 列的核糖體定位序列的干擾分子。在一個優選例中，所述RNA干擾分子選自shRNA或SiRNA，優選為針對活化蛋白激 酶 C 受體 1 的 shRNA，更優選所述 shRNA 的序列為CTGACCAGGGATGAGACCA (SEQ ID NO 3)。在本發明的另一個實施方式中，所述抑制劑作用于活化蛋白激酶C受體1或其編 碼序列的核糖體定位序列。在一個優選例中，所述核糖體定位序列為R36/K38。在本發明的另一個實施方式中，所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、膠質瘤、結腸癌、子 宮頸癌、肺癌(優選非小細胞肺癌)、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌，優選肝癌、乳腺癌、膠質瘤和 非小細胞肺癌，更優選肝癌。在本發明的另一個實施方式中，所述腫瘤治療所采用的治療劑選自烷化劑、抗代 謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑。在一個優選例中，所述治療劑選自白消安、順氯氨鉬、環磷酰胺、氮烯咪胺、異環 磷酰胺、鹽酸氮芥/苯丙氨酸氮芥、5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環胞苷、博來霉素、更 生霉素、紅必霉素、阿霉素、黃膽素、長春堿、長春新堿、三尖杉酯堿、足葉乙甙、門冬酰胺酶、 維甲酸、強的松、氟美松、雌激素、抗雌激素、黃體酮和男性激素。在另一個優選例中，所述治療劑優選為抗腫瘤抗生素，優選阿霉素。在本發明的第二方面中，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包含(i)活化蛋白激酶C受體1的抑制劑或活化蛋白激酶C的抑制劑；(ii)腫瘤治療劑；(iii)藥學上可接受的載體或賦形劑。在一個優選例中，所述腫瘤治療劑是化療劑。在本發明的第三方面中，提供了一種藥盒，所述藥盒包含(A)容納有活化蛋白激酶C受體1的抑制劑和/或活化蛋白激酶C的抑制劑的容 器；(B)容納腫瘤治療劑的容器；和(C)使用說明書。在一個優選例中，本發明的藥物組合物或藥盒中所包含的抑制劑選自抗活化蛋 白激酶C受體1的抗體、針對活化蛋白激酶C受體1編碼序列的RNA干擾分子或反義寡核 苷酸、活化蛋白激酶C的抑制劑如PKCi3 II的抑制劑CGP-53353或者經典PKC的抑制劑 Go6976)、針對活化蛋白激酶C編碼序列的RNA干擾分子或反義寡核苷酸。在另一個優選例中，本發明的藥物組合物或藥盒中所包含的抑制劑為選自下組的
4RNA干擾分子shRNA、siRNA、miRNA或dsRNA，優選為shRNA或siRNA，更優選序列為針對 RACKl 的 19 個堿基序列CTGACCAGGGATGAGACCA。在另一個優選例中，所述抑制劑作用于活化蛋白激酶C、活化蛋白激酶C受體1或 其編碼序列的核糖體定位序列，優選所述核糖體定位序列為R36/K38。在另一個優選例中，所述活化蛋白激酶C受體1的抑制劑是shRNA，所述腫 瘤治療劑是阿霉素，兩者在腫瘤治療中具有協同作用，更優選所述shRNA的序列為 CTGACCAGGGATGAGACCA。在另一個優選例中，所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、膠質瘤、結腸癌、子宮頸癌、肺癌、 胰腺癌、胃癌、或膀胱癌，優選肝癌、乳腺癌、膠質瘤、結腸癌、子宮頸癌或非小細胞肺癌，更 優選肝癌。在另一個優選例中，所述治療劑選自烷化劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗 癌藥、激素、或免疫制劑，優選白消安、順氯氨鉬、環磷酰胺、氮烯咪胺、異環磷酰胺、鹽酸氮 芥/苯丙氨酸氮芥、5-氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、阿糖胞苷、環胞苷、博來霉素、更生霉素、紅必 霉素、阿霉素、黃膽素、長春堿、長春新堿、三尖杉酯堿、足葉乙甙、門冬酰胺酶、維甲酸、強的 松、氟美松、雌激素、抗雌激素、黃體酮和男性激素，更優選阿霉素。在本發明的第四方面中，提供了一種篩選抗耐藥的腫瘤治療藥物的方法，所述方 法包括(a)提供表達活化蛋白激酶C受體1及其配體的腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤動 物；(b)將候選藥物與步驟(a)中提供的腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤動物接觸，作 為給藥組；(C)檢測給藥組中活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達水平，并與未給予候選藥 物的對照腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤動物的活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達水 平進行比較；如果檢測結果顯示，給藥組的活化蛋白激酶C受體1和/或其配體的表達水平顯 著低于對照組，則表明該候選藥物是抗耐藥的腫瘤治療藥物。在一個優選例中，所述方法用于篩選不會對患有腫瘤的個體產生腫瘤治療耐藥性 的腫瘤治療藥物。在本發明的一個實施方式中，所述活化蛋白激酶C受體1的配體是PKCii II。本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。


圖1 :RACK1在各正常組織及腫瘤細胞系中蛋白表達情況。圖Ia 成年小鼠不同組織中RACKl的表達情況，GAPDH作為內參；圖Ib 人腫瘤細胞系中RACKl的表達情況，GAPDH作為內參。圖2 =RACKl在肝癌組織中表達上調。圖2a =RACKl在肝細胞系(L02和Chang)和肝癌細胞系(Huh7、!fepG2和H印3B)中 表達情況，GAPDH作為內參；
圖2b =RACKl在癌組織⑴與癌旁組織(N)中的蛋白表達情況，GAPDH作為內參；圖2c =RACKl在原發性肝癌病人腫瘤組織中的mRNA表達情況，β -肌動蛋白作為 內參；圖2d =RACKl在不同 Μ分期的原發性肝癌病人腫瘤組織中表達情況，GAPDH作為 內參；圖2e 免疫組化檢測RACKl在原發性肝癌病人腫瘤組織中表達情況。圖3 體外驗證核糖體定位的RACKl促進肝癌化療抵抗。圖3a 肝癌細胞系中過表達RACKl增強細胞阿霉素治療抵抗。轉染空載體或野生 型 RACK124h 后，用阿霉素分別處理 IfepG2(100ug/ml)、Huh7 (20ug/ml)和 H印3B (50ug/ml)。 膜聯蛋白AKArmexin V)染色檢測細胞凋亡。圖3b 抑制肝癌細胞中RACKl表達能促進細胞發生阿霉素誘導的凋亡。轉染空載 體或 shRACK172h 后，用阿霉素分別處理 HepG2 (100ug/ml)、Huh7 (20ug/ml)和 Hep3B(50ug/ ml) 24h，再檢測細胞凋亡。圖3c =RACKl定位至核糖體是其促進腫瘤耐藥所必須的。瞬轉野生型RACKl或其 突變體24h后再用阿霉素處理細胞24h，膜聯蛋白V染色檢測細胞凋亡。圖3d =RACKl的DE突變體使Huh7細胞對阿霉素誘導的細胞凋亡敏感。在Huh7細 胞中瞬轉不同濃度的野生型RACKl或其DE突變體。24h后再用阿霉素處理細胞24h，膜聯 蛋白V染色檢測細胞凋亡。圖3e 在RACKl耗竭的肝癌細胞中轉染野生型RACKl能夠使得肝癌細胞獲得耐藥 性，而DE突變體則不可。在表達shRACKl的H印G2、Huh7和H印3B細胞系中進一步轉染空 載體、野生型RACKl或DE突變體，24h后再用阿霉素處理細胞24h，膜聯蛋白V染色檢測細 胞凋亡。圖4 體外驗證核糖體定位的RACKl促進肝癌化療抵抗。圖4a_b 阿霉素協同RACKl耗竭在體內抑制腫瘤生長。Huh7細胞裸鼠皮下成瘤， 2周后將攜帶shRNA的逆轉錄病毒載體和阿霉素進行瘤內注射。圖4a 在不同時間點觀察的腫瘤體積(mm3)；圖4b 最后一天處死小鼠后觀察的小鼠腫瘤重量(g)；圖4c_f 核糖體定位的RACKl促進腫瘤化療抵抗。將分別穩轉空載體、野生型 RACKl或DE突變體的Huh7細胞裸鼠皮下成瘤，2周后瘤內注射阿霉素。圖4c 在不同時間點觀察腫瘤體積(mm3)；圖4d 最后一天處死后觀察小鼠腫瘤重量(g)；圖4e =TUNEL染色檢測凋亡細胞DNA片段；圖4f TUNEL染色量化柱狀圖。
具體實施例方式本發明人通過長期而深入的研究發現RACK1在腫瘤組織中高表達，并通過體內、 體外實驗證實了 RACKl是腫瘤發生化療抵抗的關鍵分子。過表達的RACKl可優先啟動一系 列抗凋亡蛋白的翻譯，抑制細胞凋亡，引起腫瘤耐藥。采用諸如RNA干擾的方法下調RACKl 表達，或轉染不能定位于核糖體的RACKl突變體，可降低或消除腫瘤的耐藥性。在此基礎上，本發明人完成了本發明。活化蛋白激酶C、其警體1及它們的抑制劑如本文所用，術語“RACK1 ”、“活化蛋白激酶C受體1 ”可互換使用，均是指可與PKC 特異性結合，且具有SEQ ID NO :2所示序列或其同源序列的蛋白質或其活性片段。它們的 表達受到抑制后，可改善腫瘤治療中的藥物耐藥性。該定義中也包括所述蛋白質或多肽的 保守性變異多肽、或其同源多肽。在本發明的一個實施方式中，所述活化蛋白激酶C受體1 來自人或其它真核生物，例如小鼠、大鼠、牛或猴等，且它們之間具有高度的保守性。如本文所用，術語“活化蛋白激酶C”或“RACK1配體”可互換使用，均是指可被 RACKl所結合的氨基酸序列。在本發明的一個實施方式中，所述活化蛋白激酶C來自人或其 它真核生物，例如小鼠、大鼠、牛或猴等，且它們之間具有高度的保守性。在本發明的一個實 施方式中，所述RACKl配體是蛋白激酶C的亞型，例如PKCii II。如本文所用，術語“核糖體定位序列”是指RACKl與核糖體40S小亞基結合的序列 或者關鍵位點。在SEQ ID NO :1所示的序列中，其核糖體定位序列為RACKl編碼序列的第 106-108和112-114位堿基，其對應于SEQ ID NO :2所示氨基酸序列中的R36/K38。因此， 本發明抑制劑所優選針對的核糖體定位序列為R36/K38。本發明中首次揭示了 RACKl是一種腫瘤耐藥相關蛋白，其在腫瘤組織中異常高表 達，優先啟動一系列抗凋亡蛋白的翻譯，抑制細胞凋亡，引起腫瘤耐藥。基于本發明的上述發現，本領域普通技術人員可將RACKl或其配體PKC(優選 RACKl的核糖體結合位點)作為靶點，設計或篩選抗耐藥的腫瘤藥物。例如，本領域普通技 術人員可根據已知的RACKl或其配體的序列設計或篩選出RACKl的抑制劑，將其與化療藥 物共同給予腫瘤患者，從而改善腫瘤對治療藥物的耐藥性、提高腫瘤治療的成功率、減少腫 瘤治療藥物的用量、以及減輕患者的痛苦。活化蛋白激酶C或RACKl的抑制劑包括但不限于抗RACKl的抗體、針對RACKl編 碼序列的RNA干擾分子或反義寡核苷酸、活化蛋白激酶C的抑制劑(如PKCiiII的抑制劑 CGP-53353或者經典PKC的抑制劑Go6976)、針對活化蛋白激酶C編碼序列的RNA干擾分子 或反義寡核苷酸，優選選自下組的RNA干擾分子shRNA、siRNA,miRNA或dsRNA。例如本發 明實施例中所提供針對RACKl的19個堿基序列CTGACCAGGGATGAGACCA。更優選，所述抑制 劑作用于RACKl的核糖體定位序列(為RACKl序列的第106-108和112-114堿基，即氨基 酸序列中R36和K38)。本發明的抑制劑包括對RACKl或其活性片段具有特異性的多克隆抗體和單克隆 抗體，尤其是單克隆抗體。本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免 疫活性的抗體片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv 分子(Ladner等人，美國專利No. 4，946，778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍 保留來自人的抗體部分的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，可將 純化的RACKl蛋白或者其具有抗原性的片段施用于動物(如家兔，小鼠，大鼠等)以誘導 多克隆抗體的產生。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交 瘤技術來制備(見 Kohler 等人，Nature 256 ；495，1975 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 511，1976 ；Kohler 等人，Eur. J. Immunol. 6 -.292,1976 ；Hammer ling 等人，In Monoclonal
7Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N. Y.，1981)。多種佐劑可用于增強免疫反 應，包括但不限于弗氏佐劑等。就siRNA而言，隨著SiRNA研究的深入，已有公司可商業化提供siRNA的 設計和合成服務。如QIAGEN提供siRNA設計合成一體化服務“4-for Silencing siRNAduplexes”(QIAGEN News, 2003 年 9 月第 3 期第 55-56 頁，可從 Qiagen 公司網站上找 至丨J并下載該新聞 http://wwwl. qiagen. com/1 iterature/qiagennews/0303/ 1024467_low. pdf)針對客戶給出的一個基因序列，由QIAGEN的專家設計并合成4對siRNA，HPP純度，保 證其中至少一對siRNA的抑制效率達到70%以上，如果達不到，免費為客戶另行設計合成 另外4對siRNA。顯然，通過上述的商業途徑和服務，本領域研究人員只需提供靶基因序列，就可以 獲得高質量的siRNA。此外，本領域普通技術人員也可采用本領域中已知的方法和軟件來自行設計和篩 選 siRNA。例如，Status of siRNA Design Software (siRNA 設計軟件現狀，http //i. cs. hk/ sirna/software/status. php)中列舉了用于siRNA設計的多種軟件及其特點。因此，只要本領域普通技術人員獲知了靶基因RACKl的序列，他們就可以通過商 業途徑很容易地獲得針對該靶基因的小分子干擾RNA，也可以根據本領域中已知的原理，采 用已知的軟件和方法來獲得具有抑制作用的小分子干擾RNA。根據本領域中的常識，“反義寡核苷酸”是根據核酸雜交原理設計針對特定靶序列 的反義核酸，從而可用于抑制特定基因的表達，其包括反義RNA、反義DNA及核酶，它們通過 人工合成和生物合成獲得。本領域普通技術人員可通過計算機模擬和人工智能等技術(例 如計算機模擬RNA次級結構、反義寡核苷酸與RNA雜交后的事件分子等)，由已知的蛋白質 或基因序列獲知其空間結構，確定其“可接近部位”，在結合具體實驗成功設計出針對性的 反義寡核苷酸。這些設計方法可參見例如，袁守軍等，反義藥物設計方法研究進展(解放軍藥學 學報，第20卷第2期ppl26-129)，其中綜述了確定mRNA “可接近部位”和設計反義寡核 苷酸的各種常用技術和手段，通過這些現有技術可使得反義寡核苷酸設計的命中率顯著提 高，甚至可達到高于92%。藥物組合物和藥盒本發明提供了一種藥物組合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ；較佳的 0. 00001-20wt% ；更佳的，0. OOOl-IOwt % )的所述RACKl抑制劑，以及藥學上可接受的載 體。本發明的藥物組合物可用于通過抑制RACKl的表達和/或與核糖體的結合，改善腫瘤 耐藥性，提高腫瘤治療藥物在腫瘤治療中的有效性。如本文所用，“藥學上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良 副反應(如毒性、刺激和變態反應)的，即具有合理的效益/風險比的物質。術語“藥學上 可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。本發明的藥物組合物中藥學上可接受的載體，包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、 葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應與給藥方式相匹配，本發明的藥物組合 物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法 進行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量。本
8發明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。本發明藥物組合物中抑制劑的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴重程 度等而變化。優選的有效量的選擇可以由本領域普通技術人員根據各種因素來確定(例如 通過臨床試驗)。所述的因素包括但不限于本發明抑制劑配合使用的腫瘤治療劑的種類 和用量；抑制劑的藥代動力學參數例如生物利用率、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病 的嚴重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。例如，由治療狀況的迫切要求， 可每天給予若干次分開的劑量，或將劑量按比例地減少。本發明藥物組合物的給藥方式沒有特別的限制，可以是全身的或局部的。優選的， 本發明的藥物組合物可通過靜脈注射的方式給予對象。當所述抑制劑為RNA或寡核苷酸 時，也可采用基因治療的手段進行給藥，比如可直接將抑制劑通過諸如注射等方法給藥于 受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶蛋白質或多肽類抑制劑的表達單位(比如表達載 體或病毒等)遞送到靶點上，并使之表達活性抑制劑蛋白。可將腫瘤治療藥物與本發明的抑制劑配制在同一藥物組合物中，或以單獨的形式 提供于藥盒中。優選腫瘤治療藥物與本發明的抑制劑在聯合使用時可產生協同效果，例如 針對RACKl的shRNA與阿霉素的聯合使用可對肝癌治療產生協同作用。本領域普通技術人 員可根據本發明中的常規手段(例如參考本發明實施例中所揭示的方法)對這些組合進行 蹄選。篩詵抗耐藥的腫瘤治療藥物的方法本發明中還提供了一種以RACKl為靶點，篩選抗耐藥的腫瘤治療藥物(例如腫瘤 治療藥物)的方法，所述方法包括(a)提供表達活化蛋白激酶C受體1的腫瘤細胞系、腫 瘤培養物或荷瘤動物；(b)將候選藥物與步驟(a)中提供的腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤 動物接觸，作為給藥組；(c)檢測給藥組中活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達水平，并 與未給予候選藥物的對照腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤動物的活化蛋白激酶C受體1及 其配體的表達水平進行比較；如果檢測結果顯示，給藥組的活化蛋白激酶C受體1和/或其 配體的表達水平顯著低于對照組，則表明該候選藥物是抗耐藥的腫瘤治療藥物。本發明的方法可用于從化合物庫中篩選出針對腫瘤的非耐藥性抗腫瘤藥物，可作 為化合物篩選評估的一個重要指標。本發明的方法也可用于臨床中對腫瘤患者的個性化治 療的預測和診斷中，篩選出針對個體具有最佳腫瘤治療效果的抗腫瘤藥物。本發明的優點本發明的主要優點如下(1)揭示了 RACKl與腫瘤耐藥性之間的關系，為設計和篩選耐藥腫瘤藥物提供了 新的途徑和靶點；(2)提供了通過抑制RACKl及其相關信號傳導途徑來提高腫瘤對腫瘤治療的敏感 性的新方法，從而起到了提高腫瘤治療效果、減少腫瘤治療劑用量、緩解患者痛苦的積極作 用，具有臨床的實用性。實施例下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆實驗室指南(New York =Cold SpringHarbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和
份數按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所 述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1. RACKl在正常小鼠組織和人腫瘤細胞中高表達為了研究RACKl在不同組織器官中的表達差異，發明人首先通過蛋白質印跡法 (western blot)檢測了 RACKl在正常小鼠各種組織中的表達情況。所用材料和方法如下所 述動物健康BALB/c小鼠，雄性，4_6周齡，購自中科院上海實驗動物中心。RIPA組織裂解液50mM Tris HCl, pH 7. 5,150mM NaCl，0. 1% Nonidet P_40，5mM EDTA, 5mM EGTA, 15mM MgCl2,60mM β-磷酸甘油，0. ImM 原釩酸鈉，0. ImM NaF, 0. ImM 苯甲酰胺，10 μ g/ml 抑 肽酶，10 μ g/ml 亮肽素，ImM PMSF實驗方法稱量0. 5g組織，加入Iml RIPA組織裂解液，冰浴下玻璃勻漿器充分勻漿。勻漿結 束后100°C煮沸10 15min，離心取上清。蛋白定量，蛋白質印跡法(參考《分子克隆》)檢 測蛋白表達水平。實驗結果結果如圖Ia所示。該結果顯示RACK1的蛋白水平在正常動物的肝臟、胰臟、睪丸、 乳腺、肺、直腸和腎臟等組織中較高，在這些組織中，RACKl在肝臟中的表達水平最高。發明人接下來檢測了 RACKl在不同組織來源的腫瘤細胞系(各細胞系均購自中 科院細胞所)中的表達情況，這些細胞系包括乳腺癌細胞系MB-MDA-231、膠質瘤細胞系 U251、非小細胞肺癌細胞系A549和肝癌細胞系(Huh7、!fep3B和H印G2)。2 X SDS細胞裂解液Tris 1. 9376g, NaCl 3. 5064g, EDTA 0. 1169g, SDS 4g,加ddH20定容至200ml，用HCl調節pH值至7. 4，常溫保存備用。IX SDS細胞裂解液50% 2XSDS細胞裂解液，5% β-巰基乙醇(Fluka)，2 %完全蛋白酶抑制劑(Roche)，2% PhosSTOP 磷酸酶抑制劑(Roche)41% ddH20 定容，_20°C保存備用。試驗方法將培養細胞用Iml PBS (pH = 7. 4)沖洗三次，再加入Iml PBS，用細胞刮刀刮下細 胞，收集細胞懸液于1. 5ml Eppendorf管中；4°C 4000rpm離心5min，盡棄上清，加入適量體 積的IXSDS細胞裂解液，吹打均勻；100°C煮沸10-20min，離心取上清。蛋白定量，蛋白質 印跡法(參考《分子克隆》)檢測蛋白表達水平。
試驗結果結果如圖Ib所示。由該結果可知RACK1在各腫瘤細胞中均有表達，其中在肝癌 細胞株(Huh7、!fep3B*!fepG2)中普遍高表達，在乳腺癌細胞系MB-MDA-231、膠質瘤細胞系 U251和非小細胞肺癌細胞系A549中也高表達。實施例2. RACKl在肝癌中表達的普遍上調發明人首先采用蛋白質印跡法(方法同實施例1)，檢測了 RACKl在肝細胞系(L02 和Chang，購自中科院細胞所)和肝癌細胞系(Huh7、!fepG2和H印3B，同實施例1)中的表達情況。結果如圖2a所示。該結果表明，RACKl在肝癌細胞系(Huh7、HepG2和H印3B)的 表達水平明顯高于其在正常肝細胞系(L02和Chang)中的表達。同時，發明人還通過蛋白質印跡檢測了 RACKl在原發性肝癌病人腫瘤組織及其對 應的癌旁組織中的表達情況。組織來源和患者情況6對原發性肝癌病人腫瘤組織，來源于南通大學附屬腫瘤醫院。檢測方法同實施例1中健康小鼠組織裂解和檢測方法。試驗結果結果如圖2b所示。該結果表明，RACKl在腫瘤組織中的表達較其對應的癌旁組織 有明顯的上調。發明人進一步進行了實時PCR實驗，檢測腫瘤組織中的RACKl的mRNA水平。組織來源和患者情況34對原發性肝癌病人腫瘤(HCC)組織，獲自南通大學附屬腫瘤醫院。檢測方法1.組織RNA抽提使用Trizol試劑(Invitrogen公司)，按照Invitrogen公司RNA抽提方法進行操作。2. RNA 逆轉錄使用RNA PCR 試劑盒(AMV) Ver. 3. O (Takara Biotechnology,中國大連)，按照 Takara公司該試劑盒說明書進行操作。3.實時PCR檢測使用 LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche AppliedScience，德國曼海姆)實時PCR，按照Roche公司該試劑盒說明書進行操作。結果分析實時PCR 的結果用 LightCycIer 軟件 3. 5 版(Roche Applied Science，德國曼海 姆)軟件進行分析。試驗結果實時PCR的結果如圖2c和圖2d所示。圖2c的數據表明RACK1的mRNA水平也在絕大多數腫瘤組織中上調。并且，如圖2d所示，經過統計分析，結果顯示隨著 Μ分期(惡性腫瘤國際臨床病期分類)的提升，RACKl的表達水平也呈現明顯增高的趨勢。為了進一步研究RACKl是否參與了肝癌發展的過程，發明人利用免疫組織化學的 方法檢測了 RACKl在162例原發性肝癌病人腫瘤組織中的表達情況。組織來源和患者情況162例原發性肝癌病人腫瘤組織，獲自復旦大學附屬華山醫院。檢測方法1.石蠟切片免疫組化切片和烤片石蠟包埋組織5μπι連續切片，貼于APES處理過的載玻片上， 600C (于電熱恒溫干燥箱內，下同)烤片6 8h。脫蠟、水化組織切片二甲苯15minX3次(60°C )—無水乙醇10minX2次一95% 乙醇5minX2次一80%乙醇5min — 70%乙醇5min —自來水沖洗片刻一ddH20作用5min。 PBS 沖洗 3minX3 次。阻斷內源性過氧化物酶31^H2O2-甲醇37°C (于恒溫培養箱內，下同)孵育40min， PBS 沖洗 3minX3 次。抗原修復高壓鍋內加適量水置電爐上煮沸，將切片浸入裝有0. OlM檸檬酸緩沖 液(pH 6.0)的燒杯中，放入高壓鍋內，加熱至噴氣，維持3min。取出切片使其自然冷卻至室 溫，PBS沖洗3minX3次。封閉擦去多余水分，滴加封閉血清，室溫孵育2h，不洗。甩去切片上的血清，滴加一抗，室溫孵育Ih后4°C過夜。使用一抗同型IgG作為陰 性對照。PBS沖洗3minX3次。擦去多余水分，滴加Polymer Helper，37°C孵育20min。PBS 沖洗3minX3次。擦去多余水分，HRP標記的二抗，37°C孵育30min。PBS沖洗3minX 3次。顯色將切片浸入DAB工作液中2 5min，同時在顯微鏡下觀察控制顯色程度，待 出現陽性反應，則置流水下沖洗及時終止反應。襯染蘇木素復染30s 2min，流水沖洗，鹽酸-乙醇分化，流水沖洗。脫水70%乙醇3min — 80%乙醇3min — 95%乙醇5min —無水乙醇5min —二甲 苯 8minX2 次。封片中性樹脂封固。一抗所用到抗RACKl抗體和同型對照IgG均購自BD公司；熒光二抗購于Santa Cruz公司ο試驗結果結果如圖2e所示。該結果顯示RACK1在肝癌中的表達普遍上調。由此表明RACK1 參與了肝癌發生和發展的過程。實施例3.核糖體定位的RACKl在體外參與了肝癌細胞系的化療抵抗發明人首先在肝癌細胞系H印G2、Huh7和H印3B中轉染了野生型RACKl的真 核表達載體(真核表達質粒 pcDNA-HA-RACKl 由 Jean-Luc Parent 博士(Universit6de Sherbrooke,Canada)饋贈(也可購買商品化的RACKl cDNA序列，例如購自Invitrogen公 司或Proteintech公司或從cDNA文庫中擴增RACKl cDNA序列，然后經本領域常規的試驗 方法構建所述真核表達載體)。質粒由LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)轉染試劑轉染)，并使用阿霉素0fepG2
12100ug/ml, Huh7 20ug/ml, H印3B 50ug/ml ；分別處理24和48小時)誘導三種肝癌細胞系
的凋亡。采用膜聯蛋白V染色檢測肝癌細胞的凋亡情況將細胞重懸于結合緩沖液(IOmM HEPES/NaOH, pH 7.4 ； 140mM NaCl, 2. 5mM CaCl2),在含有約 IO5 個細胞的 195 μ 1 細胞懸液 中加入5 μ 1膜聯蛋白-V-FITC染色液，均勻混合，閉光孵育IOmin ；500g離心5分鐘，收集 細胞，PBS洗滌兩次后重懸于190 μ 1結合緩沖液，加入10 μ 1的20 μ g/ml PI染液，混合均 勻后用FACScan流式細胞儀檢測)。試驗結果如圖3a所示。該結果表明，過表達RACKl增強了這三種肝癌細胞對阿霉 素的化療抵抗效果。發明人接下來使用短發夾RNA (shRNA,針對 CTGACCAGGGATGAGACCA (SEQ ID NO 3) 序列設計引物如下正義引物5 ‘ -gatccccCTGACCAGGGATGAGACCAttcaagagaTGGTCTCATCCCTGGTCAGttttggaaa-3 ‘(SEQ ID NO 4)反義引物5 ‘ -agcttttccaaaaACTGACCAGGGATGAGACCAtctcttgaaTGGTCTCATCCCTGGTCAGggg-3' (SEQ ID NO:5)正、反向引物褪火，插入pSUPER-retro/neo-shRNA載體的BamHI/Hindlll酶切位 點，構建pSUPER-shRACKl質粒來抑制RACKl的表達(pSUPER-shRACKl質粒及載體對照由 LipofectAMINE 2000 (Invitrogen)轉染試劑轉染，72小時后再分別采用阿霉素處理24小 時(處理條件同前)，抑制RACKl蛋白表達的效果由蛋白免疫印跡檢測(同前))，并觀察其 對肝癌細胞化療敏感性的影響。結果如圖3b所示。結果表明，使用了特異性針對RACKl的shRNA下調RACKl的蛋白水平后，肝癌細胞 對阿霉素誘導凋亡的敏感性明顯增強。以上這些數據表明，RACKl在體外參與了肝癌細胞系的化療抵抗。發明人根據以往文獻報道構建了多個RACKl的功能缺陷突變體，包括Y302F(i3 1 整合素結合缺陷，J Biol Chem 2008 ;283 :22952_22961.)、Y52F(FAK 活化缺陷，J Biol Chem 2009 ;284 :20263-20274.)、Y228F/Y246F(Src 活化缺陷，MolCell Biol 2004 ； 24 6788-6798.)和 R36D/K38E(DE 突變體，核糖體定位缺陷，Nat CellBiol 2008 ；10 1324-1332.)。發明人將野生型RACKl以及這四種突變體轉染入Huh7細胞中，并檢測了其 對Huh7對化療(阿霉素20ug/ml)敏感性的影響。結果如圖3c。結果顯示，Y302F、Y52F和Y228F/Y246F仍然有效的發揮了抗凋亡的 功能，而DE突變體卻促進了阿霉素誘導的Huh7細胞的凋亡。為了進一步研究DE突變體促凋亡的效果，發明人在不同肝癌細胞系中轉染了不 同劑量(0、l、2、4yg質粒)的野生型RACKl或者DE突變體真核表達載體(方法同前)。結果如圖3d所示。結果表明，DE突變體呈劑量依賴性的促進了 Huh7細胞的凋亡。接下來發明人使用拯救實驗觀察RACKl的核糖體定位對肝癌細胞化療抵抗的影 響。
首先，在肝癌細胞中轉染pSUPER-shRACKl質粒，抑制RACKl表達(同前)，并構建 穩轉細胞株；然后，在穩轉細胞株中進一步轉染野生型RACKl或者DE突變體。結果如圖3e所示。該結果表明抑制RACKl表達水平后，肝癌細胞顯示出對肝癌 化療的敏感性，而進一步轉染野生型RACKl有效的恢復了肝癌細胞對阿霉素的化療抵抗， 而進一步轉染DE突變體則沒有明顯的影響。這些數據表明，RACKl的核糖體定位對于RACKl發揮抗凋亡的功能是必須的。實施例4.核糖體定位的RACKl在體內參與了肝癌的化療抵抗發明人接下來利用裸鼠成瘤實驗檢測了 RACKl在體內是否發揮了化療抵抗的功 能。發明人首先使用Huh7細胞進行成瘤實驗，并通過瘤內注射shRNA和/或阿霉素(20ug/ kg，一周兩次)來觀察其對腫瘤生長的影響(對腫瘤體積和重量的影響)。具體方法如下實驗動物、試驗方法及數據處理5周齡雄性胸腺缺失裸鼠(Foxnrwnu, BALB/c背景)購自上海實驗動物中心(中 國科學院，中國上海)，飼養于恒溫恒濕無菌SPF (Specific Pathogen-Free)級動物房，實 驗操作遵循文獻(〃 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"，《實驗動物 喂養和使用指南》，國家科學院(NIH出版86-23修訂1985)來進行。1.按照對照組和實驗組各10只裸鼠，每只裸鼠左右脅腹部皮下各注射IX IO7個 細胞；2.在注射腫瘤細胞成瘤2周或3周后，通過瘤內注射shRNA和/或阿霉素(20ug/ kg)來觀察其對腫瘤生長的影響，每周2次；3.定時觀察并測量所形成腫瘤的大小，腫瘤大小按照如下公式計算腫瘤體積=(LXW2)/2其中，L是指腫瘤最寬徑，W是指與L相垂直的最大徑；4.實驗終止當日，處死裸鼠并取腫瘤秤重；部分實驗中，腫瘤固定后用于TUNEL實 驗檢測凋亡DNA片斷。TUNEL實驗方法如下(1) PBS浸洗腫瘤組織5min ；(2)置于4%多聚甲醛溶液的PBS溶液中固定15min ；(3) PBS 浸洗二次，每次 5min ；(3)將載玻片取出，置于水平表面上，用濾紙小心吸去載玻片上的多余液體，滴加 100 μ L新配制的蛋白酶K工作溶液覆蓋在樣本區域上，室溫下放置30min ；(4) PBS 浸洗二次，每次 5min ；(5)制備TUNEL反應混合液(購自Roche公司)，用50 μ 1 TdT與450 μ 1熒光素 標記的dUTP液(購自Roche公司)混勻；(6)玻片干后，加50 μ 1 TUNEL反應混合液于標本上，加蓋玻片或封口膜在暗濕盒 中反應37°C反應Ih;(7) PBS 漂洗 3 次；(8)加50 μ 1 5 μ g/ml DAPI反應液于標本上，室溫反應5min ；(9) PBS 漂洗 3 次;(10)熒光顯微鏡下拍照，計數凋亡細胞。
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采用如下公式計算腫瘤的抑制率
抑制率％ =細月中麵只一冶細中麵只x 100%
對照組腫瘤體積采用金式公式判斷聯合使用RACKl的shRNA與阿霉素(Dox)對抑制腫瘤生長是否 具有協同效果(參考文獻金正均，合并用藥中的相加。中國藥理學報1980 ；1 70-76)q 值=Ea+b/ (Ea+Eb-Ea X Eb)，其中，Ea、Eb和Ea+b分別代表A藥物單獨、B藥物單獨和它們組合使用時所產生的 不同治療效果。當計算所得的9值> 1. 15時，表明兩藥有協同作用。試驗結果結果如圖4a和圖4b所示，單獨使用shRNA抑制RACKl的表達，或者使用阿霉素 (Dox)均可以不同程度的抑制腫瘤的生長；將兩者聯合使用則對抑制腫瘤生長具有明顯的 協同效應。試驗數據顯示未使用任何治療方法時，腫瘤體積為3200mm3 ；使用阿霉素治療 后，腫瘤直徑為2500mm3，其抑制率為21.875 % ；使用RACKl的shRNA治療，腫瘤直徑為 1300mm3，抑瘤率為59. 375% ；同時使用阿霉素和shRNA治療，腫瘤直徑為7500mm3，抑瘤率為 76. 5625% ο由此，聯合使用RACKl的shRNA與阿霉素的q值可計算如下q 值=76. 5625% /[21. 875% +(1-59. 375% )*21· 875% ] = 2. 49 > 1. 15該結果證明了 RACK1的shRNA與阿霉素的聯用具有較強的協同效應。發明人進一步構建了穩定表達野生型RACK1、DE突變體和相應空載的Huh7細胞株 (使用 LipofectAMINE 2000 將 pcDNA3. 1 空載體、pcDNA3. I-RACKlwt 和 pcDNA3. 1-RACK1DE 瞬時轉染到Huh7細胞系中。轉染24h后，加入終濃度為800ug/ml的G418篩選2周。然后 在挑取單克隆細胞繼續傳代培養，并通過免疫印跡分析選取陽性的Huh7穩轉細胞系)，然 后利用這三種細胞株進行裸鼠皮下腫瘤移植實驗(方法同上)去驗證其成瘤性的差異。在成瘤2周后，發明人通過瘤內注射阿霉素(20ug/ml，注射量2mg/kg)來觀察在體 內RACKl的核糖體定位對化療敏感性的影響。實驗結果如圖4c_e所示。結果顯示，野生型RACKl在體內明顯促進了腫瘤的生長；而DE突變體對腫瘤生長 則沒有明顯的影響。相比較對照組(P < 0. 05)，阿霉素并不能明顯抑制過表達野生型RACKl 的腫瘤生長(P = 0. 8)，而卻顯著抑制了過表達DE突變體的腫瘤生長(ρ < 0. 001)。利用TUNEL實驗(同上)檢測凋亡DNA片斷證實，過表達野生型RACKl明顯促進 了腫瘤對阿霉素的化療抵抗，而過表達DE突變體則增強了腫瘤對阿霉素的敏感性。在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
1權利要求
活化蛋白激酶C的抑制劑或活化蛋白激酶C受體1的抑制劑在制備降低或消除腫瘤治療中的耐藥性的藥物中的用途。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制劑選自抗活化蛋白激酶C或抗活 化蛋白激酶C受體1的抗體、針對活化蛋白激酶C或活化蛋白激酶C受體1編碼序列的RNA 干擾分子或反義寡核苷酸。
3.如權利要求2所述的用途，其特征在于，所述抑制劑是選自下組的RNA干擾分子 shRNA、siRNA、miRNA 或 dsRNA。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述抑制劑作用于活化蛋白激酶C受體1或 其編碼序列的核糖體定位序列。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤選自肝癌、乳腺癌、膠質瘤、結腸 癌、子宮頸癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、或膀胱癌。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述腫瘤治療所采用的治療劑選自烷化 劑、抗代謝藥、抗腫瘤抗生素、植物類抗癌藥、激素、或免疫制劑。
7.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含(i)活化蛋白激酶C受體1的抑制劑或活化蛋白激酶C的抑制劑；(ii)腫瘤治療劑；(iii)藥學上可接受的載體或賦形劑。
8.一種藥盒，所述藥盒包含(A)容納有活化蛋白激酶C受體1的抑制劑和/或活化蛋白激酶C的抑制劑的容器；(B)容納腫瘤治療劑的容器；和(C)使用說明書。
9.一種篩選抗耐藥的腫瘤治療藥物的方法，所述方法包括(a)提供表達活化蛋白激酶C受體1及其配體的腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤動物；(b)將候選藥物與步驟(a)中提供的腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤動物接觸，作為給 藥組；(c)檢測給藥組中活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達水平，并與未給予候選藥物的 對照腫瘤細胞系、腫瘤培養物或荷瘤動物的活化蛋白激酶C受體1及其配體的表達水平進 行比較；如果檢測結果顯示，給藥組的活化蛋白激酶C受體1和/或其配體的表達水平顯著低 于對照組，則表明該候選藥物是抗耐藥的腫瘤治療藥物。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述活化蛋白激酶C受體1的配體是 PKCβ IIo
全文摘要
本發明涉及活化蛋白激酶C受體1作為抗腫瘤耐藥靶點的用途。具體而言，本發明中揭示了活化蛋白激酶C及其受體——活化蛋白激酶C受體1(RACK1)對腫瘤藥物治療的影響，并由此提供了活化蛋白激酶C的抑制劑或活化蛋白激酶C受體1的抑制劑在制備降低或消除腫瘤化療耐藥性的藥物中的用途、它們作為腫瘤耐藥標志物及其作為耐藥腫瘤預測、診斷以及耐藥腫瘤藥物設計和篩選的靶點的應用。本發明為克服腫瘤耐藥、提高療效提供新的機理，為抗腫瘤耐藥提供新的靶點。
文檔編號C12Q1/68GK101985037SQ20101018888
公開日2011年3月16日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者惲小婧, 阮元元, 顧建新 申請人:上海醫學生命科學研究中心有限公司