專利名稱：可穩定自發光的細菌質粒及其制備方法
技術領域：
本發明一種可用于標定細菌的發光質粒及其制備方法，尤指技術上提供一種在細菌世代繁殖中可穩定且大量存在于細菌中的革蘭陰性細菌的自發發光載體及其制備方法。
背景技術：
一般欲得知細菌在動物體中的分布和行為，大多是在實驗動物犧牲后，才能分析動物器官標本，而不能直接觀察。于是遂有人研發利用發光基因在細菌中表現的方法，來觀察細菌在動物體中的分布和行為，而利用發光基因在細菌中表現的方法，一般來講有三種主要途徑1.在質粒中直接表現發光基因，但受限于質粒本身的不穩定性，以致大部份的細菌容易遺失所植入的質粒，無法穩定且大量的存在細菌中，而在細菌的繁殖中，質粒難以穩定的存在于各個子細菌，往往只能維持少數幾代而已，因此整體細菌表現的強度很快即轉弱。若使用抗生素篩選，強迫細菌保有該質粒，否則無法存活，但此法卻無法運用于活體動物中，因為如果給動物喂食抗生素，則由抗生素對測試動物所引起的變因將可能復雜化實驗結果。2.將發光基因藉由轉位子(transposon)逢機地插入細菌的染色體中，但不能確定被插入的DNA處是否為重要的基因所在；又因轉位發生機率不高，更增填篩選上的困難度。況且此法只針對該種已轉位的菌株，若應用于其它種菌株則其轉位子的位置將會不同， 如此將更增填變因，以致不能作多種菌株的觀察和比較。3.以雙重組交換將發光基因插入細菌的染色體中，雖然可以準確地插入特定基因中，但其發生機率不高，又因發光基因(IuxAB⑶E-kan)本身很長(至少71Λ)，更降低重組交換的機率，難以完成大分子DNA在細菌中的克隆及傳遞。
發明內容
本發明的目的在于，提供一種可穩定自發光的細菌質粒及其制備方法，欲解決的技術問題點是一般欲得知細菌在動物體中的分布和行為，大多需犧牲動物才能分析動物器官標本，而一般利用發光基因在細菌中表現的方法，有以下幾點缺失1.若在質粒中直接表現發光基因，受限于質粒本身的不穩定性，大部份的細菌容易遺失所植入的質粒，無法穩定且大量的存在細菌中；2.若發光基因藉由轉位子(transposon)逢機地插入細菌的染色體，不能確定被插入DNA處是否為重要的基因所在，且轉位發生機率不高；另外也只受限于該轉位的測試菌株可被使用而已，卻不能廣泛地應用于其它多種菌株上；3.若以雙重組交換將發光基因插入細菌的染色體中，其發生機率不高，且發光基因本身很長不容易完成在細菌中的克隆及傳遞。解決問題的技術特點一種可穩定自發光的細菌質粒，其包含luxABCDE自發發光基因、可啟動luxABCDE自發發光基因的啟動子、ColEl復制子、對氨比西林與卡那霉素的抗性基因、pir、parG、parF、stbD、及StbE穩定質粒的相關基因，以及pilXl至pilXll與taxA、taXB、taXC接合生殖作用相關的基因；本發明的質粒制備步驟如下a.獲得一可啟動發光基因(luxABCDE)的質粒；b.將含ColEl復制子及抗性基因的質粒接入質粒pSE34中；c.結合步驟a.與b.質粒制得本發明的質粒。對照先前技術的功效本發明的革蘭陰性細菌專用的穩定自發發光載體有以下幾點功效第一，可直接使用此發光質粒于細菌中，有利于觀察其在動物體內的分布變化。因而無需犧牲動物，即可直接分析研究細菌在動物體內的分布和行為。第二，本發明的發光質粒可穩定存在于細菌中，并可大量復制質粒，如此有助于細菌的發光強度，能持續而且能高效地表現，因而能克服質粒在細菌的繁殖中，難以穩定且大量的存在細菌中的缺點。第三，本發明可利用質粒的接合生殖作用，既可幫助克隆(cloning)又可便于該質粒在細菌與細菌的間傳遞本發明的發光質粒。如此即可簡單的選出所需要的高效能且持續發光的細菌，而可減少許多在克隆(cloning)時篩選工作的負擔，尤其本發明因含有許多重要功能的基因以致質粒DNA過大，所以當在一般DNA克隆(cloning)的剪接上，成功機率相對上很低。因此，利用接合生殖作用可降低克隆上的困難度。
圖1 本發明其一實施例的步驟流程圖。圖2A 本發明其一實施例的質粒pXen-5架構圖。圖2B 本發明其一實施例構筑質粒p3ZLux4示意圖。圖3A 本發明其一實施例的質粒PSE34架構圖。圖;3B 本發明其一實施例構筑質粒pSE-Luxl示意圖。圖4 為本發明其一實施例的質粒pSE-Luxl架構圖。
具體實施例方式本發明的可穩定自發光的細菌質粒pSE_Luxl(SEQ ID NO 1)，含有至少一 IuxAB⑶E自發發光基因(SEQ ID NO 21)、至少一可啟動IuxAB⑶E自發發光基因的啟動子、 至少一可大量復制的ColEl復制子、至少一抗性基因、至少一pir基因(SEQ ID NO 3)、至少一 parG 基因(SEQ ID NO 4)、至少一 parF 基因(SEQ ID N05)、至少一 stbD 基因(SEQ ID NO 6)與至少一 StbE基因(SEQ ID NO 7)，以及包含至少一 pilXl基因(SEQ ID NO 8)、至少一 pilX2 基因(SEQ ID NO 9)、至少一 pilX4 基因(SEQ ID NO 10)、至少一 pilX5 基因 (SEQ ID NO 11)、至少一 pi 1X6 基因(SEQ ID NO 12)、至少一 pi 1X7 基因(SEQ ID NO 13)、 至少一pilX8基因(SEQID NO 14)、至少一pilX9基因(SEQ ID NO 15)、至少一pilXlO基因 (SEQ ID NO 16)、至少一 pi 1X11 基因(SEQ ID NO 17)、至少一 taxA 基因(SEQ ID NO 18)、 至少一 taxB 基因(SEQ ID NO 19)與至少一 taxC 基因(SEQ ID NO 20)。其中，該可啟動IuxAB⑶E自發發光基因的啟動子為Plaez啟動子(SEQ ID N022)。其中，該抗性基因可為對氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因或對卡那霉素 (kanamycin,Kan)的抗性基因，或含有對氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因加上對卡那霉素(kanamycin，Kan)的抗性基因兩種抗性基因。
其中，該pir、parG、parF、stbD與stbE為穩定質粒的相關基因；該pilXl、pilX2、 pilX4、pilX5、pilX6、pilX7、pilX8、pilX9、pilXlO、pilXll、taxA、taxB 與 taxC 基因為接合生殖相關的基因，有助于質粒的接合生殖作用，幫助質粒的克隆以及在細菌與其他菌種細菌間的傳遞(如將質粒從沙門氏菌傳遞至大腸桿菌)。其中，IuxAB⑶E自發發光基因既含有發光酶IuxAB基因又有脂肪酸還原酶Iux⑶E 基因，即可合成脂肪醛，直接供發光酶于發光時所需的受質，因此無需額外受質(如脂肪醛類)的填加。本發明的質粒pSE-Luxl可表現自發發光基因蛋白質，又可非常穩定的存在細菌中持續發光，在細菌世代繁殖中可穩定且大量存在于細菌中，更有利于活體動物內直接觀察。本發明的可穩定自發光的細菌質粒制備步驟如下(a)、將缺乏啟動子的發光基因(luxABCDE)接入一含啟動子的質粒中，使發光基因(luxABCDE)可利用啟動子來啟動轉錄。(b)、將含至少一 ColEl復制子及至少一抗性基因的革蘭陰性細菌質粒接入質粒 pSE34 中。(C)、將步驟(a)所構筑的質粒接入步驟(b)所構筑的質粒中以制得該可穩定自發光的細菌質粒。實施例本發明實際在制備可穩定自發光的細菌質粒的詳細制備步驟如下(a)、構筑質粒p3ZLux4(10)將缺乏啟動子的發光基因(luxABCDE)從質粒pXen_5 中以I3StI限制酶切出，并接入含&。2啟動子的質粒pGEM3-Zf+中，使發光基因(IuxAB⑶E) 可利用質粒pGEM3-Zf+中的Pla。z啟動子來啟動轉錄。 其中，質粒pXen-5為Xenogen公司的商品化的質粒(Alameda，CA, USA)，有18，357 個堿基對(bp)。含對卡那霉素(kanamyCin，Kan)的抗性基因及IuxAB⑶E的自發發光基因。 但缺啟動子來啟動luxABCED，以致不能啟動發光基因。其中luxABCDE既含有發光酶IuxAB 基因又含有脂肪酸還原酶IuxCDE基因，可將脂肪酸還原成脂肪醛，直接提供發光酶于發光時所需的受質，因此無需額外填加其它如脂肪醛類的受質。其中，質粒pGEM3_Zf+為！Iomega公司的商品化的質粒(Madison，WI, USA)，有 3，199bp。含可大量復制的ColEl復制子、多克隆位點及對氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因，但屬窄寄主范圍的ColEl型復制子，且為不穩定的質粒，容易于數代繁殖后遺漏掉質粒于細菌中。其中，步驟(a)所構筑的質粒P3ZLux4有ll，766bp，為可大量復制的發光質粒，但本身不穩定。(b)、構筑質粒 pBS_SE34(ll)將質粒 pBlueScript II KS (+/")以 XbaI 限制酶切出并接入質粒PSE34中而得的質粒。其中，質粒pBlueScript II KS(+/")為Mratagene公司的商品化的載體(Lajolla，CA, USA)。含可大量復制的ColEl復制子、多克隆位點及對氨比西林 (ampicillin, Amp)的抗性基因。其中，質粒pSE34(SEQ ID NO 2)有32，9501Λ，來自腸內菌的一種穩定的原生型腸炎沙門氏菌(Salmonella enterica serotype Enteritidis)，其噬菌體分型為 PT34。腸炎沙門氏菌是世界上(包括臺灣)造成動物及人的沙門氏菌相關病癥的主要病源，其中噬菌體分型PT34是臺灣第二普遍的腸炎沙門氏菌。此噬菌體分型PT34經本申請人研究團隊研究發現是來自最普遍的噬菌體分型PT4的腸炎沙門氏菌，噬菌體分型PT4的腸炎沙門氏菌因為獲得質粒PSE34后改變而成為噬菌體分型PT34。本申請人研究團隊也發現此質粒擁有 pir、parG、parF、stbD、及stbE基因，有助于細胞增殖分裂時，質粒可穩定地分配于子細菌中。以及含 pilXl、pilX2、pilX4、pilX5、pilX6、pilX7、pilX8、pilX9、pilX10、pilXll、taxA、 taxB及taxC基因可幫助質粒在細菌與其他菌種細菌間以接合生殖作用(conjugation)來散布。其中，步驟(b)所構筑的質粒PBS-SE34有34. 61Λ，具有質粒pSE34的優點，含有穩定質粒的相關基因和接合生殖作用相關的基因特性，以及具有質粒PBlueScript II KS的優點，含可大量復制的ColEl復制子、多克隆位點及對氨比西林(ampicillin，Amp)的抗性基因。(c)、構筑質粒pSE-Luxl (12)利用MlI限制酶及BioI限制酶分別切割第(a)步驟所構筑的質粒p3ZLux4及第(b)步驟所構筑的質粒pBS-SE34，再將質粒p3ZLux4及質粒 PBS-SE34接合成一個質粒pSE-Luxl，該質粒pSE_Luxl有46. 3kb,為一革蘭陰性細菌專用的穩定自發發光載體。功能測試請參閱下表一，為本發明的質粒pSE-Luxl穩定性測試，我們將質粒p3Zlux4植入克隆株大腸桿菌(E. coli)中當作對照組，將質粒pSE-Luxl植入沙門氏菌(S. Typhimurium LBNP4417)中當作實驗組，分別在不含抗生素篩選的Luria-Bertani(LB)液體培養基中培養79代后，此菌液于不同稀釋倍數下分別涂盤于不含抗生素及含抗生素(如ampicillin 及kanamycin)的LB洋菜膠(含1.5%的洋菜膠)培養皿中生長，隔夜后計算總細菌數及含質粒的細菌數(colony formationunit, CFU)，可以清楚的發現本創作的質粒pSE-Luxl可以在79代后，仍有75% (1550/2030)的細菌仍具有發光質粒，細菌經四天(約79代)的繼代培養后，發現本創作的發光質粒pSE-Luxl存在細菌內的穩定效率優于質粒p3ZLux4約十萬倍，在培養皿上觀察菌落發光情形，質粒p3ZLux4所產生的發光效果約8小時，而質粒 PSE-Luxl發光至少2天以上。此結果顯示本發明所構筑的質粒pSE-Luxl既可表現自發發光基因蛋白質，又可非常穩定的存在細菌中持續發光。表一、質粒pSE-Luxl穩定性測試CFU/ ml植入質粒p3Zlux4的大腸桿菌植入質粒pSE-Luxl的沙門氏菌LB培養基含Amp與Kan的 LB培養液LB培養基含—ρ與Kan的LB培養基IO2菌數過多無法計算43菌數過多無法計算菌數過多無法計算IO3菌數過多無法計算4菌數過多無法計算菌數過多無法計算IO4菌數過多無法計算0菌數過多無法計算菌數過多無法計算IO5菌數過多無法計算0菌數過多無法計算菌數過多無法計算IO648802’ 0301,550
權利要求
1.一種可穩定自發光的細菌質粒，其包含至少一 IuxAB⑶E自發發光基因、至少一可啟動IuxAB⑶E自發發光基因的啟動子、至少一 ColEl復制子、至少一抗性基因、至少一 pir基因、至少一 ParG基因、至少一 parF基因、至少一 StbD基因與至少一 StbE基因，以及包含至少一 pilXl基因、至少一 pilX2基因、至少一 pilX4基因、至少一 pil)(5基因、至少一 pil)(6 基因、至少一 pilX7基因、至少一 pilX8基因、至少一 pilX9基因、至少一 pilXlO基因、至少一 pilXll基因、至少一 taxA基因、至少一 taxB基因與至少一 taxC基因。
2.如權利要求1所述的可穩定自發光的細菌質粒，其特征在于，該可啟動luxABCDE自發發光基因的啟動子為Pla。z啟動子。
3.如權利要求1所述的可穩定自發光的細菌質粒，其特征在于，該抗性基因包含對氨比西林(ampicillin)的抗性基因。
4.如權利要求1所述的可穩定自發光的細菌質粒，其特征在于，該抗性基因包含對卡那霉素(kanamycin)的抗性基因。
5.如權利要求1所述的可穩定自發光的細菌質粒，其特征在于，該抗性基因包含對氨比西林(ampicillin)的抗性基因與對卡那霉素(kanamycin)的抗性基因。
6.如權利要求1所述的可穩定自發光的細菌質粒，其特征在于，該可穩定自發光的細菌質粒為如SEQ ID NO :1所述的核甘酸序列。
7.一種制備可穩定自發光的細菌質粒的方法，包含下列步驟(a)、將缺乏啟動子的發光基因(luxABCDE)接入一含啟動子的質粒中，使發光基因 (luxABCDE)可利用啟動子來啟動轉錄。(b)、將含至少一ColEl復制子及至少一抗性基因的革蘭陰性細菌質粒接入質粒PSE34中。(c)、將步驟(a)所構筑的質粒接入步驟(b)所構筑的質粒中以制得該革蘭陰性細菌專用的穩定自發發光載體。
8.如權利要求7所述的制備可穩定自發光的細菌質粒的方法，其特征在于，步驟(a)所述的啟動子可為Pla。z啟動子。
9.如權利要求8所述的制備可穩定自發光的細菌質粒的方法，其特征在于，步驟(a)所述的含啟動子的質粒可為質粒pGEM3-Zf+。
10.如權利要求9所述的制備可穩定自發光的細菌質粒的方法，其特征在于，步驟(a) 所述的缺乏啟動子的發光基因(IuxAB⑶E)來自質粒pXen-5。
11.如權利要求7所述的制備可穩定自發光的細菌質粒的方法，其特征在于，步驟(b) 所述的至少一 ColEl復制子及至少一抗性基因的革蘭陰性細菌質粒可為質粒pBlu必cript II KS(+/-)。
12.—種革蘭陰性細菌的質粒，于細菌細胞分裂時該質粒可穩定地分配于子細菌中，且使細菌與其他菌種細菌間可以利用接合生殖作用來散布該質粒，該質粒系包含至少一 Pir 基因、至少一 ParG基因、至少一 parF基因、至少一 stbD基因與至少一 stbE基因，以及包含至少一pilXl基因、至少一pilX2基因、至少一pilX4基因、至少一pilX5基因、至少一pilX6 基因、至少一 pilX7基因、至少一 pilX8基因、至少一 pilX9基因、至少一 pilXlO基因、至少一 pilXll基因、至少一 taxA基因、至少一 taxB基因與至少一 taxC基因。
13.如權利要求12所述的革蘭陰性細菌的質粒，其特征在于，該質粒為如SEQID NO2所述的核甘酸序列。
全文摘要
一種可穩定自發光的細菌質粒及其制備方法，其包含luxABCDE自發發光基因、可啟動luxABCDE自發發光基因的啟動子、ColE1復制子、對氨比西林與卡那霉素的抗性基因、穩定質粒的相關基因以及接合生殖作用相關的基因，使本發明可容易地以接合傳遞進入細菌中表現發光基因蛋白質，又可穩定且大量地存在細菌中，不需額外填加發光受質以及篩選抗生素仍可持續且高效能地發光，方便于活體動物中直接觀察細菌的動態變化；本發明制備步驟如下a.獲得一可啟動發光基因的質粒；b.將含ColE1復制子及抗性基因的質粒接入質粒pSE34中；c.結合步驟a.與b.質粒制得本發明的質粒。
文檔編號C12N15/70GK102268447SQ20101018805
公開日2011年12月7日 申請日期2010年6月1日 優先權日2010年6月1日
發明者邱政洵, 陳奇良, 黃耀廣 申請人:長庚醫療財團法人林口長庚紀念醫院