專利名稱：一種體外重組神經氨酸酶的細胞定位方法
技術領域：
本發(fā)明涉及重組蛋白在細胞中的分布及功能分析領域，具體涉及一種體外重組神 經氨酸酶的細胞定位方法。
背景技術：
神經氨酸酶(neuraminidase，ΝΑ)是構成流感病毒胞膜刺突的一個重要蛋白成 分。蛋白質的亞細胞定位是蛋白質功能研究的重要方面，研究發(fā)現，NA蛋白在細胞水平上 的抗病活性與其亞細胞定位有關。研究NA蛋白的細胞亞定位對該蛋白抗病功能及其抗病 機理的研究具有重要的意義。從目前蛋白定位研究來看，方法主要是免疫組織化學染色技術，它是應用免疫學 基本原理-抗原抗體反應，對組織或細胞內抗原或者抗體物質定性和定位的組織化學技 術。但該技術是一種多步驟、多因素決定的實驗方法，有很多干擾因素，無論是組織取材、固 定、制片、抗原暴露及修復、液體及抗體的配制、修復溫度、顯色等等因素都會影響免疫組織 化學染色，對試驗結果造成直接的影響。而綠色熒光蛋白目前作為一種熒光標記基因，利用 基因工程技術，將該基因整合于感興趣蛋白cDNA—端使其融合表達蛋白，應用熒光顯微鏡 可方便、快捷的檢測到目的基因的表達，從而減少了實驗步驟，加快了實驗進展。
發(fā)明內容
本發(fā)明目的是提供一種體外重組神經氨酸酶的細胞定位方法，該方法能簡捷、直 觀檢測外源基因在細胞水平上的表達位置。本發(fā)明所說的體外重組神經氨酸酶的細胞定位方法，可通過以下三個具體步驟來 實現步驟一將神經氨酸酶基因的cDNA(Genebank登錄號EU429718. 1，具體序列如 SEQ NO. 1所示)。連接進真核表達載體pcDNA3. 0,構建pcDNA3. O-NA載體，然后再將增強 型綠色熒光蛋白(EGFP)基因連接至pcDNA3.0-NA載體上，構建融合表達載體pcDNA3.0/ EGFP-NA ；步驟二 將含有綠色熒光蛋白(EGFP)基因與神經氨酸酶的融合表達載體 pcDNA3. 0/EGFP-NA 轉染 NIH-3T3 細胞；步驟三轉染細胞48h后，熒光倒置顯微鏡下可觀察綠色熒光在細胞水平上的表 達位置，以此可確定神經氨酸酶在細胞中亞定位情況。由于神經氨酸酶具有酶切活性，可以酶切去掉細胞表面的唾液酸受體，使細胞免 受粘病毒(如禽流感病毒、新城疫病毒等)的侵染。把某一亞型的NA基因cDNA構建表達 載體導入小鼠3T3(NA_)細胞系中構建能夠永久表達NA基因的轉基因細胞系，細胞水平上 的抗病毒實驗表明，NA具有一定的抗病毒活性。NIH-3T3細胞株是從小鼠胎兒里得到培養(yǎng)建立的，由于它顯示出強烈的接觸抑制 作用，所以能明確地識別已發(fā)生轉染的細胞。該細胞自身不能合成并表達NA蛋白，同時能在體外環(huán)境中長期的穩(wěn)定培養(yǎng)，因此能夠作為一種重要的細胞材料滿足于生物醫(yī)學研究的 需要。并且經實驗表明，連接在一起的增強型綠色熒光蛋白(EGFP)基因-NA蛋白基因能在 NIH-3T3細胞中正常翻譯，因此，本發(fā)明利用增強型綠色熒光蛋白基因與NA基因構建融合 表達載體pcDNA3. 0/EGFP-NA,該載體在NIH-3T3細胞獲得表達，通過檢測融合表達蛋白在 細胞水平上的表達位置，建立了快速、簡捷定位神經氨酸酶的方法。
圖1 :pMD-19T-NA載體構建 2 :pcDNA3. O-NA 載體結構3 融合表達載體pcDNA3. 0/EGFP-NA結構4 熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP-NA融合蛋白在NIH-3T3細胞中明場(a)、暗場 (A)分布
具體實施例方式1.設計含有EcoR I與Not I兩個限制性內切酶酶切位點的特異性引物上游引物 Fl :5，-CCGCCGGAATTCATGAATCCAAATCAAAAG-3’,下游引物 Rl :5，-ATTTGCGGCCGCCTACTTGTCA ATGGTGAAT-3，。以神經氨酸酶(NA)基因cDNA為模板，擴增的NA基因克隆至pMD_19T (TaKaRa 公司)載體中，構建pMD-19T-NA(如圖1)。從構建成功的pMD19_T_NA載體上利用EcoR I與Not I兩個限制性內切酶將NA基因酶切回收后定向插入到已經商品化的表達載 pcDNA3. Odnvitrogen公司)的多克隆位點區(qū)中，構建的載體命名為“pcDNA3. O-NA”(如圖 2)。同時設計含有Hind III和EcoR I的酶切位點的特異性引物(剔除下游引物中的終止 子)上游引物 F2 :5，-GTAAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3，，下游引物 R2 :5，-TCAGAAT TCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3‘。以質粒 PEGFP-N1 (Clontech 公司)為模板，亞克隆 EGFP 基 因至PMD-19T (TaKaRa公司)載體中，構建pMD_19T_EGFP。Hind III和EcoR I兩個限制性 內切酶分別酶切PMD-19T-EGFP和pcDNA3. O-NA,將EGFP基因片段與線性化的pcDNA3. O-NA 連接。雙酶切與測序鑒定正確，構建載體命名為“pcDNA3. 0/EGFP-NA”(如圖3)。2.利用電轉染方法介導pcDNA3. 0/EGFP-NA真核表達載體轉染NIH-3T3細胞。取 生長良好的NIH-3T3，用0. 25%胰酶適當消化，含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液終止消化，200g 離心6 8min，棄上清，加入Eppendorf低滲緩沖液懸浮細胞，細胞計數板計數，調整細胞 濃度為1 X IO6個/mL。吸取370 μ L細胞懸液，小心注入2mm電極杯(容積為400 μ L)中。 將30 μ L質粒pcDNA3. 0/EGFP-NA (濃度為1 μ g/ μ L)加入電極杯中，混合均勻。將電極杯 裝入電極槽內，靜置lmin，在電壓為270V條件下作用80 μ s進行電穿孔實驗。操作完畢后， 將電極杯4°C中靜置lOmin，小心將細胞轉移至6孔板中進行培養(yǎng)。3. 24h后觀察細胞貼壁情況。轉染48h以后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞熒光， 以此來分析NA蛋白在活細胞水平的定位(如圖4所示)。結果顯示NA蛋白主要在胞質近 胞膜表達，而在細胞核內不表達。加入終濃度至500 μ g/mL的G418對細胞進行篩選，每3 天更換一次篩選培養(yǎng)液。持續(xù)篩選8天后，獲得轉基因細胞系。
權利要求
一種體外重組神經氨酸酶的細胞定位方法，包括以下步驟步驟一將神經氨酸酶基因的cDNA連接進真核表達載體pcDNA3.0，構建pcDNA NA載體，然后再將增強型綠色熒光蛋白基因連接至pcDNA NA載體，構建融合表達載體pcDNA3.0/EGFP NA；步驟二將融合表達載體pcDNA3.0/EGFP NA轉染NIH 3T3細胞；步驟三轉染細胞培養(yǎng)48h后，熒光倒置顯微鏡下觀察綠色熒光在細胞水平上的表達位置，確定神經氨酸酶在細胞中亞定位分布。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種體外重組神經氨酸酶的細胞定位方法，該方法利用增強型綠色熒光蛋白基因與神經氨酸酶基因構建融合表達載體pcDNA3.0/EGFP-NA，使融合表達載體在NIH-3T3細胞獲得表達，然后通過檢測融合表達蛋白在細胞水平上的表達位置，建立快速、簡捷定位神經氨酸酶的方法。
文檔編號C12N15/85GK101899462SQ20101018762
公開日2010年12月1日 申請日期2010年5月28日 優(yōu)先權日2010年5月28日
發(fā)明者任麗偉, 孫敏, 常國斌, 徐琪, 李碧春, 王霄燕, 田智泉, 陳國宏 申請人:揚州大學