胞外乳糖酶的制備和提取工藝的制作方法

專利名稱：胞外乳糖酶的制備和提取工藝的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白酶的制備工藝，尤其是一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝。

背景技術：
乳糖酶，又被稱為β-半乳糖苷酶(拉丁文名稱β-Galactosidase)，主要用于乳品工業，可使低甜度和低溶解度的乳糖轉變為較甜的、溶解度較大的葡萄糖和半乳糖；使冰淇淋、濃縮乳、淡煉乳中乳糖結晶析出的可能性降低，同時增加甜度。但由于種種原因，大部分人的體內缺少上述乳糖酶，造成很多人患有乳糖不耐癥，即人們在飲用牛奶后常會引起對牛奶中的主要碳水化合物——乳糖的消化不良，出現腹漲、腸鳴、急性腹痛甚至腹瀉等癥狀，在中國，根據科研人員的研究結果，成年人飲用牛奶后乳糖吸收不良的發生率高達86.7％，不耐受指數為0.9。而乳糖不耐癥的會導致胃腸失調，造成有價值的蛋白質和礦物質損失，甚至影響到嬰幼兒的智力發育，故歐洲不少國家常將乳糖酶加入牛奶，供嬰兒飲用。
目前國內乳糖酶的產業化生產還存在著很大的問題，乳糖酶并未得到廣泛應用，其主要原因是乳糖酶的單位產量較低，市場銷售的乳糖酶多為胞內酶，需破碎細胞才能得到，其提取純化工藝復雜，成本高；酶的作用溫度低，耐熱性差，生產過程中很容易染雜菌，適用范圍窄。


發明內容
本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種利用雅致放射毛霉菌株進行胞外產酶的胞外乳糖酶的制備和提取工藝。
一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝，該工藝包括以下步驟 (1)將活化后的雅致放射毛霉菌接種至固態培養基內培養； (2)培養后的粗酶液加入無機絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品； (3)半成品經鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
步驟(1)中所述的活化后的雅致放射毛霉菌株接種量為固態培養基總重量的10～15％。
步驟(1)中固態培養基包括 (1)麩皮、黃豆粉或玉米粉中的一種、兩種或三種； (2)麥芽糖、蔗糖或乳糖中的一種； (3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一種； (4)MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的一種或兩種； (5)水。
更優選的固態培養基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1∶1.0～2.0，乳糖添加量為0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量為0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量為固態培養基總重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量為固態培養基總重量的0.10～0.2％。
上述固態培養基選用已經經過2～3次發酵培養后的固態培養基時，胞外產酶的效果更好。
步驟(1)中的培養條件是培養溫度為30～50℃，培養時間為60～80h，培養過程中每24～36h翻曲一次。
步驟(2)中的無機絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種。
步驟(3)中的鹽析使用的是硫酸銨分級沉淀法，層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
本發明的優點與積極效果在于 本發明以雅致放射毛霉菌為出發菌株，在固態培養基內進行培養，通過單因素和正交試驗確定了最佳的固態培養基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水、培養后得到的粗酶液經無機絮凝劑硫酸鋁處理后，再經過硫酸銨鹽析、Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化制得乳糖酶成品，該成品經聚丙烯凝膠酰胺電泳檢驗后，其最終比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率為44.38％，提純倍數為35.82，乳糖酶的作用pH為4.5～5.5，在30～60℃有較高的耐受性，在4℃冷藏條件下具有良好的穩定性，同現有技術中的胞內產酶相比較，其生產工藝簡單、原料成本低、適合規模化生產，制得的乳糖酶耐熱性高、穩定性好、安全穩定無污染，作用pH更適宜機體的體內生物環境。

具體實施例方式 下面結合實施例，對本發明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護范圍。
本發明所使用的雅致放射毛霉購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該菌種的拉丁文名稱為Actinomucor elegans，保藏編號為CGMCC3.2178。
一種胞外乳糖酶的制備純化方法包括以下步驟 (1)將活化后的雅致放射毛霉菌株接種至固態培養基內培養； 活化的步驟如下 用接種環直接取凍存的雅致放射毛霉菌株，在LB培養基平板表面劃線，于25～32℃培養36～42小時。
挑取一個單菌落，轉到3～5ml LB培養基中，于25～32℃培養36～42小時。
將培養液全部轉到100ml LB培養基中培養36～42小時，到OD600＝0.2～0.4。
步驟(1)中的活化后的雅致放射毛霉菌株接種量為固態培養基總重量的10～15％。
步驟(1)中的固態培養基包括 ①麩皮、黃豆粉或玉米粉中的任意一種； ②麥芽糖、蔗糖或乳糖中的任意一種； ③牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的任意一種； ④MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的任意一種或兩種； ⑤水。
經過單因素和正交試驗確定了更優選的固態培養基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1∶1.0～2.0，乳糖添加量為0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量為0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量為固態培養基總重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量為固態培養基總重量的0.10～0.2％。
上述固態培養基選用已經經過2～3次發酵培養后的固態培養基時，胞外產酶的效果更好，可提高40～55％的乳糖酶產量。
步驟(1)中的培養條件是培養溫度為30～50℃，培養時間為60～80h，培養過程中每24～36h翻曲一次，可提高乳糖酶的產量，通過適當翻曲可以使物料接種和溫度保持均勻，有利于原料的利用，同時翻曲也可以延遲孢子出現的時間，使菌絲分泌更多的酶類。
(2)培養后的粗酶液加入無機絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品； 步驟(2)中的無機絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種，其不僅絮凝效果好，而且酶的回收率也高。通過使用絮凝劑，使乳糖酶粗酶液中各種固體小懸浮顆粒和色素絮凝沉降下來，獲得澄清的酶液，達到初步純化乳糖酶粗酶液的效果，減少對乳糖酶酶活的影響。
絮凝率的測定方法是 取100mL乳糖酶粗酶液置于500mL燒杯中，室溫和自然pH條件下，加入硫酸鋁，快速混勻1min，2～3min后再慢速混勻1min，靜置60min，空白不添加絮凝劑。取上層液稀釋一定倍數，在620nm處以蒸餾水為參比測定吸光度OD值。絮凝率(FR)計算如下
絮凝液過濾速率的測定方法是 過濾5min后記錄體積，換算成單位時間內的體積(mL/min)，作為衡量過濾速率(Fv)的指標。
步驟(2)中的過濾方法是發酵液絮凝處理60min后，用9cm錐形漏斗、12cm濾紙進行過濾，濾液直接滴入量筒內。
(3)半成品經鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
步驟(3)中的鹽析使用的是硫酸銨分級沉淀法，層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
硫酸銨分級沉淀法的過程是 將硫酸銨烘干研細，取200mL上清液，向其中緩慢加入硫酸銨粉末至其濃度達20％，4℃靜置2h，離心(7000r/min、15min、4℃)，沉淀溶于0.005M、pH6.28的磷酸鹽緩沖液，測酶活。上清液繼續加入硫酸銨粉末至濃度達40％，靜置離心，沉淀溶于緩沖液，測酶活。取上清液加入硫酸銨使其濃度分別達60％、80％和90％，操作同上。
Sephadex G-100凝膠層析純化的過程是 1.Sephadex G-100的預處理 取2.5g Sephadex G-100，至于燒杯中，加入蒸餾水，輕輕攪拌，棄去懸浮顆粒，如此反復洗滌幾次后，加入過量0.005M、pH6.28的磷酸鹽緩沖液，室溫下溶脹72h。
2.裝柱 取直徑1.0cm，長50cm的層析柱，垂直固定在鐵架臺上，將層析柱下端的止水螺絲旋緊，向柱中加入約5～7cm的0.005M、pH6.28的磷酸鹽緩沖液，然后緩慢加入溶脹好的凝膠，注意使柱中無氣泡，打開出樣閥。凝膠緩緩下沉，繼續加入，用玻璃棒輕輕攪拌，使柱中無界限。待凝膠柱裝好后，在凝膠表面放一層濾紙，避免上樣時破壞膠面。用緩沖液平衡層析柱，并打開恒流泵控制流速為1mL/5min。
3.上樣 將柱的上端打開，用吸管將凝膠上面的緩沖液吸出，不要吸凈，留一薄層液面，以免空氣進入。沿管壁緩緩加入樣品，注意不要打亂凝膠表面。擰開下端的螺旋夾，使樣品進入凝膠中，快要進完時，加1mL～2mL緩沖液沖洗柱壁，隨即用多量的洗脫液洗脫。
4.洗脫、收集 當樣品完全進入凝膠后，用0.005M、pH 6.28的磷酸鹽緩沖液洗脫樣品，洗脫速度為1mL/5min，并收集。
DEAE-纖維素-52離子交換層析純化的過程是 1.DEAE-纖維素-52膨脹活化 稱取3.0g DEAE-纖維素-52，撒于約45mL0.5mol/L NaOH溶液中，浸泡1h左右，不時攪拌。抽濾(布氏漏斗加兩層濾紙)，以蒸餾水洗滌，再抽濾，直至濾液近中性為止，再將纖維素浸泡于0.5mol/LHCl中1h，同樣抽濾液至近中性。再將纖維素浸于0.5mol/L NaOH液中，同樣處理，洗至中性。
2.平衡 將DEAE-纖維素-52放入0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液中(即起始緩沖液)，靜止1h，不時攪拌，待纖維素下沉后，傾去上清液或抽濾除去洗液，如此反復幾次至傾出液體的pH與加入的磷酸緩沖液的pH相近時為止。
3.裝柱、上樣 裝柱、上樣過程同Sephadex G-100凝膠裝柱過程。
4.洗脫、收集 用含0.15、0.25、0.35、0.45、0.55mol/LNaCl的0.02mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫，并收集。
酶活的檢定方法是 1.ONP標準曲線的制備 用已知濃度的ONP(鄰硝基苯酚)溶液做標準曲線，根據ONP的濃度c對應的OD值，利用最小二乘法建立回歸方程 OD＝51648c+0.0079 OD＝420nm吸光值 cONPG濃度μmol/rnL 相關系數R＝0.9908；c的測定范圍為0～0.15μmol/mL 鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷(ONPG)為易溶于水的無色化合物，β-D-半乳糖苷酶催化ONPG水解生成鄰硝基苯酚(ONP)，ONP在堿性溶液中呈黃色，在420nm有最大吸收峰。
(1)取1mL粗酶液于EP管中，10000r/min離心10min。取上清液0.5mL，與0.5mL反應緩沖液混合。
(2)加入0.2mL ONPG溶液，反應10min。
(3)加入0.5mL飽和碳酸鈉溶液終止反應。補水至3.5mL。
(4)用紫外可見分光光度計在420nm處測定OD值。
(5)酶活力定義為在最適反應條件下，每分鐘催化1μmol底物轉化為產物所需的酶量定義為一個酶活單位。
E是粗酶液中乳糖酶的酶活力，T是反應時間，V是反應體系體積，N是稀釋倍數。由于是固態發酵乳糖酶，最后的酶活力單位要變為U/g曲(Y) E是粗酶液中乳糖酶活力，V是粗酶液的總體積，m是麩皮的質量 (6)因為OD值與酶活成正比，即酶活越高，反應的越多，相應的OD值也越高，所以可以用OD值來間接反應酶活。
實施例 本實施例中涉及的儀器設備包括J-25型高速冷凍離心機、DL201型恒溫自動干燥箱、BS-2F恒溫振蕩培養箱、HZQ-F160全溫振蕩培養箱、磁力攪拌器、JA2003電子天平、DZKW-C型水浴鍋、蒸氣消毒器、Delta 320pH計。
1.制備孢子懸液 (1)培養好的活化雅致放射毛霉菌株菌種放入無菌室，點燃酒精燈，用75％酒精棉球擦拭雙手和桌面，取3～5mL的無菌水加入到活菌培養皿內，在火焰區域內，用滅過菌的涂布器刮下孢子，使之溶于無菌水中。
(2)用移液槍吸取培養皿中的孢子液，移入滅過菌的三角瓶中。取適量無菌水稀釋孢子液。在三角瓶中放入若干滅過菌的小玻璃珠，充分振蕩，使孢子完全散開。
(3)用血球計數板在顯微鏡下計量孢子懸液的孢子數，利用無菌水稀釋作用使孢子懸液的孢子數在107的數量級 2.固體培養基的制備 (1)將麩皮和蒸餾水1∶1.5混合放入250mL三角瓶中，其中固體物質定量為10g，攪拌均勻，作為基礎培養基。
(2)在基礎培養基內添加0.06g/mL的乳糖、添加0.06g/mL的蛋白胨、添加固態培養基總重量的0.1％的KH2PO4，添加固態培養基總重量的0.15％的NaH2PO4。
(3)將三角瓶用報紙包好放入高壓滅菌鍋滅菌，滅菌條件121℃，0.1Mpa，17min。
(4)將三角瓶從高壓滅菌鍋中取出、冷卻至常溫。
3.菌種接種 (1)進入無菌室，點燃酒精燈，用75％酒精棉球擦拭雙手和桌面。解下捆綁在錐型瓶瓶口的繩子，保留紗布，瓶口在離火焰不遠處。
(2)用移液槍往三角瓶中接入固體培養基總重量15％的菌懸液，然后用滅過菌的玻璃棒將之攪拌均勻。
4.培養 將已接種的三角瓶放入45℃的恒溫培養箱中進行培養，培養72h左右效果最佳。在培養過程中，每隔24h攪拌1次。
5.粗酶液的制備 用8體積的水浸提發酵過的麩皮并勻速攪拌30min。經四層紗布過濾后即得粗酶液。
6.粗酶液的絮凝 粗酶液中加入硫酸鋁制備乳糖酶半成品，粗酶液添加量為0.002-0.003g/mL。在30℃下，其絮凝效果最佳。在該條件下，過濾速度為1.52mL/min，絮凝率為88.27％，澄清率為91.46％，酶回收率87.9％。
7.乳糖酶半成品的鹽析及純化 (1)乳糖酶半成品經過硫酸銨分級沉淀法鹽析、Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
8.酶活的檢定 乳糖酶成品通過聚丙烯凝膠酰胺電泳檢驗得到單一條帶，達到電泳純度，最終其比活力512.68±0.25U/mg，乳糖酶得率為44.38％，提純倍數為35.82。
乳糖酶成品以鄰硝基苯酚為底物的酶學性質為最適作用pH為4.5～5.5。當pH超過6.0時酶活顯著降低；其反應的最適溫度為45～60℃。在30～60℃有較高的耐受性，純酶液在4℃冷藏條件下具有良好的穩定性。
權利要求
1.一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于包括以下步驟
(1)將活化后的雅致放射毛霉菌接種至固態培養基內培養；
(2)培養后的粗酶液加入無機絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品；
(3)半成品經鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。
2.根據權利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(1)中所述的活化后的雅致放射毛霉菌株接種量為固態培養基總重量的10～15％。
3.根據權利要求1或2所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于所述固態培養基包括
(1)麩皮、黃豆粉或玉米粉中的一種、兩種或三種；
(2)麥芽糖、蔗糖或乳糖中的一種；
(3)牛肉膏、蛋白胨或酵母膏中的一種；
(4)MnSO4、KH2PO4、NaH2PO4或CaCl2中的一種或兩種；
(5)水。
4.根據權利要求1所述胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(1)中所述固態培養基為麩皮、乳糖、蛋白胨、KH2PO4、NaH2PO4和水，其中麩皮與水的重量比為1∶1.0～2.0，乳糖添加量為0.05～0.1g/mL，蛋白胨添加量為0.04～0.08g/mL，KH2PO4添加量為固態培養基總重量的0.05～0.15％，NaH2PO4添加量為固態培養基總重量的0.10～0.2％。
5.根據權利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于所述固態培養基為經過2～3次發酵培養后的固態培養基。
6.根據權利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(1)中所述培養的條件是培養溫度為30～50℃，培養時間為60～80h，培養過程中每24～36h翻曲一次。
7.根據權利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(2)中所述的無機絮凝劑為明礬、硫酸鋁或氯化鎂中的一種。
8.根據權利要求1所述的胞外乳糖酶的制備和提取工藝，其特征在于步驟(3)中所述的鹽析使用的是硫酸銨分級沉淀法，層析純化包括Sephadex G-100凝膠層析純化和DEAE-纖維素-52離子交換層析純化。
全文摘要
本發明涉及一種胞外乳糖酶的制備和提取工藝，該工藝包括以下步驟(1)將活化后的雅致放射毛霉菌接種至固態培養基內培養；(2)培養后的粗酶液加入無機絮凝劑沉淀，然后過濾得到半成品；(3)半成品經鹽析和層析純化后得到乳糖酶成品。本發明同現有技術中的胞內產酶相比較，其生產工藝簡單、適合規模化生產，耐熱性高、穩定性好、安全穩定無污染，作用pH更適宜機體的體內生物環境。
文檔編號C12N9/38GK101812435SQ201010187278
公開日2010年8月25日 申請日期2010年5月31日 優先權日2010年5月31日
發明者劉鼎闊, 王立紅, 董惠峰, 張勇, 張鳳洪, 張俊霞 申請人:鼎正動物藥業(天津)有限公司