一種誘導植物衰老與雄性不育相關蛋白TaPaO及其編碼基因和應用的制作方法

專利名稱：一種誘導植物衰老與雄性不育相關蛋白TaPaO及其編碼基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種誘導植物衰老與雄性不育的相關蛋白TaPaO及其編碼基因和應用。
背景技術：
現代農業生產中，人們廣泛利用雜種優勢來改良品種。雜種優勢是指兩個遺傳組 成不同的親本雜交產生的雜種一代在生活力、生長勢、繁殖力、抗逆性、產量和品質上比其 雙親優勢的現象。雜種優勢利用被認為是今后小麥生產水平大幅度提高的主要途徑。在小麥遺傳育種中，利用雜種優勢的途徑主要有三系法和二系法。“三系法”是最 早發現并在相當長時間內成為小麥雜種優勢利用的主要途徑，以其制種純度高的優點選育 出了多種不同類型的核質互作雄性不育系。三系即不育系、保持系及恢復系。由于其中的 不育系具有繁殖困難、恢復源窄、恢復源的篩選受到嚴格的恢復系和保持系的關系限制的 缺點，使得三系法在實際生產中的應用受到限制。上世紀九十年代，有學者報道培育成功了小麥光溫敏不育系ES3、ES4和ES5等，并 提出了利用光溫敏不育系進行二系雜交小麥的研究。光溫敏雄性不育二系法具有明顯的優 勢一系二用，簡化制種程序，恢復源廣，降低成本，利用程度高。目前，通過基因工程技術已 經將很多不育相關基因轉入到植物中，并獲得了部分甚至完全雄性不育的植株。李國勝等 利用基因工程的方法將雄性不育基因的重組載體pTA29-barnase轉入農桿菌后轉化煙草， 將得到的轉基因植株分別在低溫(15°C -20°C )和正常溫度(23°C -27°C )下進行培養，結 果低溫下煙草表現部分不育；將低溫下生長的煙草轉入正常溫度進行培養時，育性恢復正 常(李勝國，1997)。此外，他們還獲得了雄性不育轉基因油菜(羅玉英，1997)。中國科學 院植物研究所利用轉基因技術，采用組織特異性啟動子TA29，將編碼細胞分裂素合成關鍵 酶基因_ipt轉入煙草，發現轉基因植株雄蕊發育異常，部分花絲變異成花瓣，從而造成雄 性部分或完全不育(耿颯，2000)。通過基因工程方法得到雄性敗育的轉基因植株，對加速 作物雜種優勢的利用起到一定的推動作用。葉綠素(Chl)是地球上最重要的光合色素。1913年Willstaer等闡明了 Chl的 基本化學結構；50年后，有機化學家Robert成功地合成了葉綠素a，并因此榮獲諾貝爾化 學獎。隨后，人們一直對Chl生物合成代謝進行了廣泛、深入的研究，其合成途徑現已明 確，而有關葉綠素降解代謝方面的研究卻比較少。目前，比較明確的Chl降解途徑有三步 第一步，葉綠素酶作用下葉綠素脫植基反應；第二步，脫鎂螯合酶(MDCase)作用下脫植 基葉綠酸向脫鎂葉綠酸a轉變；第三步，在脫鎂葉綠(甲酯)酸加氧酶(pheophorbide a oxygenase,pheide a oxygenase,PaO)作用下卟啉大環的裂解反應。由于卟啉環裂解與葉 片色素的喪失有關，因此第三步是葉片衰老時葉色黃化的關鍵步驟。脫鎂葉綠(甲酯)酸加氧酶(PaO)是迄今為止發現的參與葉綠素降解代謝的酶中 最重要的關鍵酶(Hortensteiner S et al. , 1998 ；Curty C et al.，1995)。研究表明，只在衰老葉片中檢測到脫鎂葉綠酸氧化酶的存在，而未衰老的組織中不存在，推測該氧化酶是在組織衰老時誘導合成的，因此該酶可能是葉片衰老時葉綠素降解途徑中的關鍵酶。目前關于PaO的報道包括從呈現壞死斑點的玉米llsl (lethal leaf-spot 1)突 變體和擬南芥 acdl (accelerated cell death 1)突變體中得到克隆(Gray et al.，1997 ； Yanget al.，2004)；李鵬麗等(2006)從大豆中克隆了玉米Ilsl的同源基因，全長1817bp， 命名為Gmllsl。該基因在自然衰老或人工誘導衰老的葉片組織中表現出明顯的衰老上調趨 勢，與類受體蛋白激酶的表達有相關性，且在敲除類受體蛋白激酶后的轉Gmllsl基因葉片 中表現出與玉米類似的Llsl突變體典型的葉片斑狀失綠壞死表型；但是，目前還未有小麥 中PaO的相關報道。

發明內容
本發明的目的是提供一種誘導植物衰老和雄性不育的相關蛋白TaPaO。本發明的再一目的是提供編碼上述誘導植物衰老和雄性不育相關蛋白TaPaO的 編碼基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的轉基因細胞系。本發明的另一目的提供上述誘導植物衰老和雄性不育相關蛋白TaPaO的應用。本發明所提供的誘導植物衰老和雄性不育的相關蛋白TaPaO，來源于雜交小麥品 種京麥7號(京審麥2009003)，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1 MPVLAMPSAS LPLLSPRHRP LLRPSTLPAS RDGSGILRVA APTSVPGEAERAEEPSTSTS60TSFESSGEKF VWRCBWVS LVTOLDPRVP IFFQUML VIWNDFNSGCWVAIDDKPH120R1API5BGRI DETGGLQYSY HM3GSGA CIMWFE GFEARAVRSPRAQVIKFPTL180LSQSIIJW DENGWCKAKA IKFMJW DEPAFSIYTI _IMGYMXMNVa)PSH240JEFAHHmG RFDMKPIPF KMESSGA13Y SGANTGNPRI TAIffiAPCYAIMffiEiAKL300PIVGOTVI WKSMHA PGKffiSIVCS AHNFWW GKAWW^VPRWYEHfTS^V360YDOM輝 KM5ASK ESS\DVNQQY miFIPim DFmFMJKRWD420WYGSPS AL PSMjSOW IDRffi^IIl CSSCMKA FQUMVGAIWPGATSG480IPADVQLRIL LGAGALISAA LAYVFYDRQK HFVFVDYVHA DID523本發明的蛋白由523個氨基酸殘基組成，具有保守的RieSke[2Fe-2S]結構域、非 亞鐵血紅素鐵結合域和C-末端的CxxC結構基序。自SEQ ID NO. 1的氨基末端第76-188 位氨基酸殘基是保守的Rieske結構域。為了使TaPaO蛋白便于純化，可在由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列組成的蛋白 質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列
根據本發明所公幵的SEQ ID NO. 1序列，本發明的基因TaPaO可人工合成，也可先 合成其編碼基因，再進行生物表達得到。根據本發明的TaPaO編碼基因具有如SEQ ID NO. 2或3所示核苷酸序列。TaPaO 的表達會誘導葉片衰老，產生葉片斑狀失綠現象，同時可以導致部分植株雄蕊異常。SEQ ID NO. 2 gaaggaacac agaaccaacc ttggaccctt cctccacacg atcccgagga aggaaggaag60gcagacgaaa tgccggtgct ggcgatgccg tccgcctccc tccccctcct ctccccgcgg120caccggccgc tgctgcgccc gtcgaccctc ccggcctccc gtctcggcag cggcatcctc180cgcgtggccg cgccgacgtc ggtccccggc gaggcggagc gggcggagga gccgagcacg240agcacgagca cctcgcctga atcgtccggg gagaagttcg tgtggcggga ccactggtac300ccggtctcgc tcgtggagga cctggacccg cgcgtgccca ccccgttcca gctcctcaac360cgcgacctcg tcatctggaa cgaccccaac tccggcgact gggtcgcgct cgacgaccgc420tgcccgcacc gcctcgcccc gctctcggag gggcggatcg acgagacggg cggcctgcag480tactcctacc acggctggtc cttcgacggc tccggcgcct gcaccaggat cccgcaggcc540gcgcccgagg ggcccgaggc ccgggcggtg cgctcgccca gggcctgcgc caccaagttc600cccacgctcc tctcccaggg gctgctcttc gtctggcctg acgagaatgg ctgggacaag660gccaaggcca ccaagcctcc aatgctgccg aaggagttcg atgacccggc cttctccacc720gtgacgatcc agagggacct cttctatggg tatgacacgt tgatggtgaa cgtctctgat780ccctcacata tagaatttgc tcaccacaag gtcactggac gaagagatag agccaagcct840ttgccattca aaatggaatc gagtggcgca tggggatatt caggggcaaa taccggtaat900cctcgtatca ctgcaacttt cgaggcccct tgctatgcac tgaacaaaat agagattgac960gcaaaattac cgattgtggg agatcagaaa tgggtgatat ggatttgctc cttcaacatt1020ccaatggccc cagggaaaac tcgttctatt gtctgtagtg ctcgaaactt tttccagttt1080acaatgccag gaaaggcatg gtggcagctt gtccctcgat ggtatgaaca ttggacctca1140aatttggtct atgacggcga tatgatcgtg cttcaaggcc aagagaaggt tttcctgtct1200gcatccaagg agtcgtctgc agatgttaat cagcagtaca caaagctcac tttcacaccc1260acacaggccg accgatttgt cttagcattc cgggcatggc tacggaaatt cggcaatagc1320
cagcctgact ggtatggaag ccctagccaa gatgcattac cttctacagt cctttcaaag1380cgagagatgc tagacagata cgagcagcac acgctgaaat gttcctcctg cagaggagcg1440cacaaggcct tccagactct gcagaaggtg ttcatggggg cgacggtggt gtttggcgcg1500acatccggga tccctgcgga tgttcagctc aggatattgc tcggtgccgg tgctctgatc1560agcgccgctc tggcctatgt cttctacgac cgccagaagc atttcgtgtt tgtggactac1620gtgcacgctg acattgattg attagggaga taaaccttag ttatttttgt gaggatctgg1680tgtggcgtgg tgcggagaca tcccacgatc aatcatgcgc ataacctagc caaggagtac1740atatagcttt cagtgggtac ttaccaggct actttgtaag aaagaaaagt cgggatgaaa1800atcgatagat agaccatatc ttttgtctat tagtatcagc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1860SEQ ID NO. 3 atgccggtgc tggcgatgcc gtccgcctcc ctccccctcc tctccccgcg gcaccggccg60ctgctgcgcc cgtcgaccct cccggcctcc cgtctcggca gcggcatcct ccgcgtggcc120gcgccgacgt cggtccccgg cgaggcggag cgggcggagg agccgagcac gagcacgagc180acctcgcctg aatcgtccgg ggagaagttc gtgtggcggg accactggta cccggtctcg240ctcgtggagg acctggaccc gcgcgtgccc accccgttcc agctcctcaa ccgcgacctc300gtcatctgga acgaccccaa ctccggcgac tgggtcgcgc tcgacgaccg ctgcccgcac360cgcctcgccc cgctctcgga ggggcggatc gacgagacgg gcggcctgca gtactcctac420cacggctggt ccttcgacgg ctccggcgcc tgcaccagga tcccgcaggc cgcgcccgag480gggcccgagg cccgggcggt gcgctcgccc agggcctgcg ccaccaagtt ccccacgctc540ctctcccagg ggctgctctt cgtctggcct gacgagaatg gctgggacaa ggccaaggcc600accaagcctc caatgctgcc gaaggagttc gatgacccgg ccttctccac cgtgacgatc660cagagggacc tcttctatgg gtatgacacg ttgatggtga acgtctctga tccctcacat720atagaatttg ctcaccacaa ggtcactgga cgaagagata gagccaagcc tttgccattc780aaaatggaat cgagtggcgc atggggatat tcaggggcaa ataccggtaa tcctcgtatc840actgcaactt tcgaggcccc ttgctatgca ctgaacaaaa tagagattga cgcaaaatta900ccgattgtgg gagatcagaa atgggtgata tggatttgct ccttcaacat tccaatggcc960ccagggaaaa ctcgttctat tgtctgtagt gctcgaaact ttttccagtt tacaatgcca1020ggaaaggcat ggtggcagct tgtccctcga tggtatgaac attggacctc aaatttggtc1080tatgacggcg atatgatcgt gcttcaaggc caagagaagg ttttcctgtc tgcatccaag1140gagtcgtctg cagatgttaa tcagcagtac acaaagctca ctttcacacc cacacaggcc1200gaccgatttg tcttagcatt ccgggcatgg ctacggaaat tcggcaatag ccagcctgac1260tggtatggaa gccctagcca agatgcatta ccttctacag tcctttcaaa gcgagagatg1320ctagacagat acgagcagca cacgctgaaa tgttcctcct gcagaggagc gcacaaggcc1380ttccagactc tgcagaaggt gttcatgggg gcgacggtgg tgtttggcgc gacatccggg1440atccctgcgg atgttcagct caggatattg ctcggtgccg gtgctctgat cagcgccgct1500ctggcctatg tcttctacga ccgccagaag catttcgtgt ttgtggacta cgtgcacgct1560gacattgatt ga1572含有TaPaO基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發明的保護范圍。
可用現有的植物表達載體構建含有TaPaO基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元表達載體系統和可用于植物微彈轟擊法的載體等。所述植物表達載體還可包含 外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達 的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭 瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端轉錄的非翻譯區均具有類 似功能。使用本發明的基因構建植物重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任 何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子、玉米的泛素 啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用；此外，還可使用增強 子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起 始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制 信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來 自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行 加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是 抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。本發明的另一個目的是提供一種培育雄性不育植株的方法。本發明所提供的培育雄性不育植物的方法，是將上述任一種含有TaPaO基因的重 組表達載體導入植物細胞中，得到部分雄性不育植物，優選所述植物為小麥。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的脫鎂葉 綠酸加氧酶TaPaO的編碼基因導入植物細胞，可獲得帶有葉片斑狀失綠以及雄性部分不育 的轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、 植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細 胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也 可以是雙子葉植物，如煙草、小麥、長穗偃麥草、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪 草、苜宿等。本發明以雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)為實驗材料，利用RACE方法 得到了小麥雄性不育相關的脫鎂葉綠酸加氧酶(pheophorbide a oxygenase, TaPaO)蛋白 及其編碼基因，得到了小麥來源的脫鎂葉綠酸加氧酶基因，并將TaPa0基因導入煙草，顯著 加速了煙草葉片的衰老，葉綠素測定儀檢測結果表明，同一葉齡的空白對照和轉基因植株 葉綠素相對值相差較明顯，并且轉基因植株的育性也降低了，從而通過基因工程的方法驗 證其功能。在其他物種中，對于該基因的研究結果多為誘導葉片產生斑狀失綠現象，基本沒 有側重于植株育性相關方面的研究。對于TaPaO這個新基因，本發明研究發現它也可以誘 導煙草葉片衰老并產生葉片斑狀失綠現象，并且它可以誘導煙草的雄蕊出現不同程度的退 化，導致雄蕊部分甚至完全不育，研究該基因與育性的關系是本發明的一個重要創新點。本發明的誘導衰老與雄性不育相關蛋白及其編碼基因對培育光溫敏雄性不育小 麥有很大的推進作用，使二系法育種更加實際，對雜種優勢的利用和推廣十分重要的理論和實際意義。總之，運用基因工程方法構建雄性不育轉基因植株，可以簡化育種程序，改進育種模式。尤其是對光溫敏雄性不育有關基因的研究和利用，可以推進二系法育種，從而加 速雜種優勢在小麥遺傳育種中的應用。下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。


圖1誘導衰老和雄性不育相關蛋白TaPaO編碼基因的cDNA克隆，以雜交小麥品種 京麥7號(京審麥2009003)為模板，PCR擴增TaPaO的cDNA片段，1，2，京麥7號的TaPaO 基因片段；M, DL2000 marker (100, 250，500，750，1000，2000，3000，5000bp)。圖2RT-PCR半定量分析TaPaO基因分別在高溫(可育環境)與低溫(不育環境) 生長環境下的表達特征，該基因的表達在不同育性環境以及不同發育時期的幼穗中存在明 顯差異，在不育環境下，四個時期都表達，且隨著穗部的發育呈現逐步上調趨勢；而在可育 環境下的四個穗部發育時期中表達量很低，其中A1-A4代表安徽不育環境；B1-B4代表北京 可育環境。圖3轉基因煙草的獲得，3A，煙草經農桿菌侵染后的篩選、分化培養；3B，經篩選、 分化后獲得的再生植株生根培養；3C，轉基因煙草植株的PCR檢測，其中1，2，3，4，5，7，8，9， 10，11，12，13，14，15為pBI29A-TaPa0轉基因煙草，17為空白對照。圖4TaPaO基因導致的煙草衰老現象，A，轉基因植株和對照植株葉片顏色的比較； B，轉基因植株出現的葉片斑狀失綠現象。圖5轉基因煙草低溫下處理，花瓣以及花藥的異常發育現象，A，pBI29A-TaPa0轉 基因煙草低溫培養下出現的全部雄蕊退化成花瓣的異常發育現象，幾乎沒有產生花粉的能 力；B，pBI29A-TaPa0轉基因煙草部分雄蕊退化成花瓣，部分雄蕊不育；C，花絲變異為畸形 花瓣，雄蕊著生于異型花瓣的中部；D，對照植株正常的花瓣及雄蕊。圖6轉基因植株變異花藥與對照植株正常花藥在解剖鏡下的比較，A，變異花藥在 解剖鏡下的外形觀察，小而且干癟；B，變異花藥縱切照片，花藥內部幾乎沒有花粉粒；C，對 照植株正常花藥與變異花藥的實物圖；D，對照植株正常花藥切面圖，花粉粒包裹在整個花 藥中；E，對照植株正常花藥的外形觀察，大而且飽滿；F，對照植株正常花藥用解剖針劃開， 花粉粒蹦出來。
具體實施例方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》 (第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。實施例1 小麥誘導衰老與光溫敏雄性不育相關基因TaPaO的cDNA克隆與半定量 分析取雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)的花藥，用Trizol法提取花藥 的總 RNA。應用 5，RACE 試劑盒(5，RACE System for Rapid Amplification of cDNA EndsKit) (GIBCOBRL, CAT. NO. 18374-058)和 3，RACE 試劑盒(3，RACE System for RapidAmplification of cDNA Ends Kit) (GIBCOBRL,CAT. NO. 18373-019)獲得TaPaO基因。
用Trizol法提取雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)花藥的總RNA，用 superscript II (購自invitrogen公司)反轉錄酶反轉錄獲得到cDNA。根據TaPaO基因 編碼區序列設計引物Pl和P2。以反轉錄得到的cDNA為模板，用引物Pl和P2進行PCR擴 增。引物Pl和P2的序列如下P1 5，-AGGAAGGAAGGAAGGCAGACGAAAT-3，
P2 5 ’ -CCCTAATCAATCAATGTCAGCGTGC-3’對PCR產物進行0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1. 6-1. Skb左右的 條帶，與預期結果相符。用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN)回收該片段。將該回收片段 與 pGEM-T Easy (購自 Promega公司)連接，參照 Cohen 等的方法(Proc NatlAcad Sci,69 2110)，將連接產物轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，根據pGEM_T Easy載體上的氨卞青霉 素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和 SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明擴增到的TaPaO基因的開 放閱讀框(ORF)為SEQ ID No. 3，即SEQ ID No. 2的自5'末端第70至1641位脫氧核糖核 苷酸，編碼氨基酸序列是SEQ ID No. 1的蛋白質。將含序列SEQ ID No. 3所示TaPaO基因 的重組載體命名為pBI29A-TaTaPa0，其cDNA克隆結果如圖1所示。TaPaO基因的序列在Genabnk上進行比對，BLAST分析表明，在氨基酸水平上小麥 TaPaO與水稻PaO、擬南芥中同功能基因AtAcd(accelerated cell death 1)以及玉米(Zea mays) Llsl 一致性分別為88%、81%和93%。序列分析發現小麥TaPaO與其他同源基因的 編碼產物一樣都包含有典型的Rieske [2Fe-2S]結構域(Cys-Xl-His-X16-17-Cis-X2_His) 和非亞鐵血紅素鐵結合域(Glu-X3-4-Asp-X2-HiS-X4-5-HiS)，另外在N末端還具有高度保 守的CxxC基序(F/Y/W-X2-His-X3-Cys-X2-Cys)。而在小麥中未發現同源蛋白基因，證明 TaPaO基因是一個新的基因。用Trizol法提取雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)自交后代花藥的總 RNA,反轉錄成cDNA用做半定量RT-PCR分析。利用小麥中穩定表達的肌動蛋白基因(Actin)的特異引物WAC-F 5‘ -GTTCCAATCTATGAGGGATACACGC-3‘WAC-R 5 ‘ -GAACCTCCACTGAGAACAACATTACC-3‘作為內參確定半定量RT-PCR分析的cDNA模板用量。根據調整好的內參標準，對小 麥兩個不同生態育性環境下各四個穗部發育時期的cDNA的量進行調整，調整到擴增產物 亮度基本一致后，進行特異引的半定量RT-PCR擴增(圖2)。結果表明，該基因的表達在不 同育性環境以及不同發育時期的幼穗中存在明顯差異，在不育環境下，四個時期都表達，且 隨著穗部的發育呈現逐步上調趨勢；而在可育環境下的四個穗部發育時期中表達量很低。 三次重復結果基本一致。實施例2 用TaPaO基因培育雄性不育轉基因植物1、重組表達載體的構建PBI29A-TaPa0雙子葉植物重組表達載體的構建以雜交小麥品種京麥7號(京審麥2009003)的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板， 用含有SacI和SpeI接頭序列的特異引物進行PCR擴增；然后SacI和SpeI雙酶切PCR產 物，回收，將酶切產物正向插入載體PBI121的CaMV 29A啟動子之后的SacI和SpeI酶切位點之間，得到重組載體pBI29A-TaPaO。引物序列如下TaPaO[SacI] :5， -TCCGAGCTCTCAATCAATGTCAGCGTGCAC-3，TaPaO[SpeI] :5， -CGGACTAGT ATG CCG GTG CTG GCG ATG-3，2、轉基因煙草的獲得和鑒定1)轉基因煙草的獲得將上述構建的重組表達載體pBI29A-TaPa0用凍融法轉化根癌農桿菌C38C1，再用 葉盤法將整合有pBI29A-TaPa0的根癌農桿菌C38C1轉化煙草W38，用含100mg/L卡那霉素的 MS培養基進行2輪篩選，每輪篩選10-15天，得到陽性轉基因植株(如圖3A、3B)。將篩選 得到的陽性轉基因植株用PCR做進一步鑒定篩選，PCR所用的一對引物為P3和P4。P3 :5’ -TCCGAGCTCTCAATCAATGTCAGCGTGCAC-3，P4 :5’ -CGGACTAGT ATG CCG GTG CTG GCG ATG-3’對pBI29A-TaPa0轉基因煙草進行PCR鑒定，陽性轉基因植株經PCR擴增可獲得 1. 6kb左右條帶，如圖3C所示，結果獲得轉pBI29A-TaPa0煙草22株。同時將pBI121空載體導入煙草W38，方法同上，作為對照，獲得11個株系的轉空載 體煙草(篩選獲得的轉基因煙草用Ttl代表示)。2)轉TaPaO基因植株衰老與雄性不育鑒定將Ttl代轉pBI29A-TaPa0基因煙草植株及Ttl代轉空載體對照植株的3周苗齡的根 系分別移入含有營養土的花盆中分別進行高低和溫處理，一部分在23°C -27°C (正常溫度) 下生長，一部分在15°C-20°C (低溫)下生長，觀察表型并拍照。在開花期結合花藥的生長 情況，做花粉萌發實驗，觀察花粉的育性。結果表明PBI29A-TaPa0轉基因植株在正常溫度條件下能正常生長，初期葉片顏色深綠，與對照植株基本沒有差別，到開花期時底部幾層葉片全部枯黃，還有部分植株葉片 出現了斑狀失綠現象；而空白對照植株葉片從初期到開花期都是正常生長，葉片顏色深綠。 TaPaO基因誘導轉基因煙草衰老鑒定結果證明TaPaO基因可以在植物生長后期可能誘導植 株衰老。圖4顯示了 pBI29A-TaPa0轉基因植株和空白對照植株在正常溫度下生長的差異 情況。在低溫條件下，pBI29A-TaPa0轉基因植株與空白對照植株在開花期表現出明顯的 不同，主要表現在花藥的生長發育和萌發上。轉基因植株部分花藥形態異常，雄蕊退化，花 絲演變成不完全的花瓣，花藥著生在異常花瓣的中部，這種畸形的花藥開裂后為黑褐色，極 少有花粉散出。而低溫條件培養的空白對照植株，花藥發育正常，且花粉較多(如圖5、6所 示)°
權利要求
一種誘導植物衰老和雄性不育的相關蛋白TaPaO，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一種誘導植物衰老和雄性不育的相關基因TaPaO，其特征在于，編碼權利要求1所述 的植物誘導衰老和雄性不育的相關蛋白TaPaO。
3.如權利要求2所述的植物誘導衰老和雄性不育相關基因TaPaO，其特征在于，其堿基 序列如SEQ ID NO. 2或3所示。
4.包含權利要求2或3所述植物誘導衰老與雄性不育相關基因的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體通過將權利要求2或3 所述基因經插入載體PBI121而得。
6.包含權利要求2或3所述植物誘導衰老與雄性不育相關基因的轉基因細胞系。
7.一種培育雄性不育植株的方法，其特征在于，所述方法包括將權利要求2或3所述植 物誘導衰老與雄性不育相關基因導入植物細胞中，獲得雄性不育或部分不育植株的步驟。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述植物為小麥。
9.權利要求1所述植物誘導衰老與雄性不育相關蛋白TaPaO在小麥雜交育種中的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種誘導植物衰老與雄性不育相關蛋白TaPaO及其編碼基因和應用。所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2或3所示。本發明的誘導衰老與雄性不育相關蛋白及其編碼基因對研究光溫敏雄性不育小麥的不育機理有一定的作用，對于研究及開辟小麥雜種優勢利用新途徑提供十分重要的理論和實際意義。
文檔編號C12N5/10GK101845087SQ20101018669
公開日2010年9月29日 申請日期2010年5月21日 優先權日2010年5月21日
發明者單福華, 唐忠輝, 唐益苗, 張鳳廷, 張立平, 王靈云, 苑少華, 趙昌平, 鄭岑, 高世慶 申請人:北京市農林科學院