專利名稱：一種篩選小麥抗葉銹病基因Lr24的方法及其專用引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種篩選小麥抗葉銹病基因Lr24的方法及其專用引物。
背景技術：
小麥葉銹病(Puccinia triticina f. sp. tritici)是一種世界性病害，條件 適宜時可造成40%甚至更大的產量損失(摘自Knott D R. The wheat rust breeding forresistance. Monographs on Theoretical and Applied Genetics, 1989)。在我國，小麥 葉銹病過去主要在西南及長江流域的部分地區，如貴州、江西等省發生較重，近年來華北、 西北及東北各地的發生也日趨嚴重。利用抗葉銹品種是減輕葉銹病危害的經濟、有效、快捷 的方法。加強小麥品種及其遺傳資源的抗病性研究，對病害的持續控制、確保小麥安全生產 至關重要。目前已有60余個抗葉銹病基因正式命名(Mcintosh et al. Catalogue of gene symbols for wheat 2007 supplement[DB/0L]. [2008-01-30]http://shigen. lab. nig. ac. jp//wheat/komugi/top/top. jsp)，由于葉銹菌大多數具有生理專化性，這些抗病基因 往往會由于病菌小種的變異而很快“喪失”抗性。因此利用多基因聚合、基因布局和多系品 種來延長抗病基因的抗性壽命是一重要手段。然而，我國由于缺少對生產品種中抗葉銹基 因的全面分析，對使用品種的抗病性的了解不夠全面，往往造成小麥品種的盲目推廣使用， 加上小麥葉銹菌新毒性基因的產生致使抗病品種不斷喪失抗病性，小麥葉銹病發生日趨嚴 重。因此，了解目前生產品種的抗葉銹性及其基因、發掘新的抗源成為有效控制該病害的一 個重要環節。在人類基因組研究的推動下，分子標記的研究與利用得到了迅速的發展并用于作 物種質資源和育種的研究，特別是在構建分子遺傳圖譜和標記目的性狀基因方面取得了很 大的進展。尋找與重要農藝性狀基因緊密連鎖的分子標記，是進行分子標記輔助選擇和育 種的基礎。近年來，利用分子標記包括RAPD、RFLP、AFLP、SSR和TRAP等定位和標記了多個 小麥抗葉銹病基因。AFLP標記呈典型的孟德爾方式遺傳，多態性高，穩定性好，可在短時間 內對大量的DNA樣品進行檢測，非常適合遺傳多樣性分析、種質鑒定、基因定位和快速構建 遺傳圖譜等研究。但由于其檢測過程涉及聚丙烯酰胺凝膠電泳的使用，對技術要求高且工 作量大，將在基因組隨機分布的AFLP標記轉化為STS標記則可為分子輔助育種提供方便、 快捷的檢測手段。Lr24抗葉銹病基因來源于長穗偃麥草(Thinopyrum ponticum, 2n = 70)，目前很 少有對該基因表現有毒力的小麥葉銹菌，因此是非常具有應用潛力的抗病基因。通過對 Lr24進行AFLP分析，找到了與該基因緊密連鎖的分子標記，并轉化為穩定的STS標記，用于 標記輔助育種。
發明內容
本發明的目的是提供一種可用于篩選小麥抗葉銹病基因Lr24的引物。本發明的另一個目的是提供一種可用于篩選小麥抗葉銹病基因Lr24的方法。
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本發明所提供的用于篩選Lr24抗病基因的引物，是由序列表中的序列1和序列2 的核苷酸序列組成的引物對。將由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對命名為A-S24，序列表中 SEQ ID No :1和SEQ ID No :2均由20個堿基組成，將用引物對A-S24經PCR擴增到得到的 分子標記命名為TA-S24。本發明所提供的篩選含抗葉銹病基因Lr24的小麥的方法，是以待測小麥品種基 因組DNA為模板，在由序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物A-S24的引導下 進行PCR擴增，擴增產物中有212bp大小條帶的小麥品種為含Lr24基因的小麥。其中，20. OyL PCR反應體系為模板DNA 50ng，Taq酶IU(TaKaRa)，上、下游引物 (5ymol · Γ1)各 1.0 μ L，dNTP(IOmmol · Γ1)。· 5 μ L，10XPCR 緩沖液 2· 0 μ L，其余用無菌 蒸餾水補充反應體系至20.0 μ L。反應程序為94°C預變性3min，隨后進行35個循環94°C 變性 lmin，60°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ；最后 72°C延伸 lOmin，10°C保存。所述檢測擴增產物的方法可為對擴增產物進行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，然后用EB 或Goldview顯色。具體方法為取5μ L擴增產物，加入0.5μ L變性載樣指示劑(98%無 離子甲酰胺，IOmM EDTA ρΗ8. 0,0. 25%溴酚藍)，在濃度為2. 0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離。 檢測擴增產物中是否有212bp大小的條帶。本發明提供了一個與小麥抗葉銹病基因Lr24共分離的AFLP-STS標記TA-S24， Lr24基因對我國目前流行的大多數葉銹菌小種表現抗病。利用與該抗病基因共分離的分子 標記可以對其進行標記輔助選擇，從而實現多個有效抗病基因的累加，延長品種的抗病性。 本發明的小麥抗葉銹病基因Lr24的專用引物將在小麥抗病育種中發揮重要作用。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
圖1為用A-S24引物抗感親本和F2群體單株的PCR擴增結果。圖2為用A-S24引物對已知含有Lr24抗葉銹病基因Lr24的小麥品種的PCR擴增結果。圖1中R 抗病F2單株；S 感病F2單株24、Tc分別代表抗病親本和感病親本。圖 2中1、9、10、19、20、29、35、37、44 相應的近等基因系；N1-N5 :5個小麥品種，依次為鄂恩1 號、5R625、周 19、1R13、1R17 ；M :DL2000Marker。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，引物由上海生工生物工程公 司合成。小麥近等基因系、TCLr24XThatCher雜交后代及小麥品種等植物材料均由河北農 業大學小麥葉銹病研究中心收集保存。實施例1、小麥抗葉銹病基因Lr24 AFLP-STS標記的獲得用對小麥抗葉銹病基因Lr24低毒，對感病親本Thatcher高毒的小麥葉銹菌單孢 菌系(BGQQ和SHRT)對TcLr24和Thatcher雜交的F1和F2代群體進行苗期抗葉銹性鑒定， 共鑒定F1群體10株，F2群體141株，結果F1全部抗病，F2抗感符合3 1分離比例，如表 1所示，表明TcLr24對BGQQ和SHRT的抗性由顯性單基因控制。
表1 TcLr24 X Thatcher F2群體對葉銹菌菌系BGQQ及SHRT抗感分離
權利要求
一種篩選小麥抗葉銹病基因Lr24的專用引物，其特征在于，是由序列表中的序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。
2.一種篩選含抗葉銹病基因Lr24的小麥的方法，其特征在于，是以待測小麥品種基因 組DNA為模板，在由權利要求1所述的序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對 的引導下進行PCR擴增，擴增產物中有212bp大小條帶的小麥品種為含Lr24基因的小麥。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，20μ L PCR反應體系為模板DNA 50ng, Taq酶1U，上、下游引物各1. 0 μ L，dNTPO. 5 μ L，10XPCR緩沖液2. 0 μ L,其余用無菌蒸餾水 補充反應體系至20. 0μ L ；反應程序為94°C預變性3min，隨后進行35個循環94°C變性 lmin，60°C退火 lmin，72°C延伸 Imin ；最后 72°C延伸 lOmin，10°C保存。
4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述檢測擴增產物的方法可為對擴增 產物進行2. 0%瓊脂糖凝膠電泳，然后用EB或Goldview顯色。
全文摘要
本發明公開了一種篩選小麥抗葉銹病基因Lr24的方法及其專用引物，專用引物是由序列表中的序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對。篩選含抗葉銹病基因Lr24的小麥的方法，是以待測小麥品種基因組DNA為模板，在由權利要求1所述的序列表中序列1和序列2的核苷酸序列組成的引物對的引導下進行PCR擴增，擴增產物中有212bp大小條帶的小麥品種為含Lr24基因的小麥。所述檢測擴增產物的方法可為對擴增產物進行2.0％瓊脂糖凝膠電泳，然后用EB或Goldview顯色。本發明的篩選小麥抗葉銹病基因Lr24的方法及其專用引物將在小麥葉銹病抗病育種中發揮重要作用。
文檔編號C12Q1/68GK101967518SQ20101018643
公開日2011年2月9日 申請日期2010年5月26日 優先權日2010年5月26日
發明者劉大群, 孟慶芳, 張娜, 張汀, 張立榮, 李在峰, 李星, 楊文香, 王海燕, 閆紅飛 申請人:河北農業大學